Pipettieren Sie zunächst 10 Mikroliter Tröpfchen 2X Peptidlösung in die Mitte der Wells in einer 24-Well-Platte. Pipettieren Sie nach der Inkubation 10 Mikroliter 2X PBS in jede Vertiefung. Mischen Sie die Lösung mit der Spitze der Pipette vorsichtig an, lassen Sie die Geltröpfchen mindestens 20 Minuten lang stabilisieren und stellen Sie sicher, dass die Tröpfchen intakt sind.
Als nächstes pipettieren Sie 2,5 Milliliter 0,0125 % Trypsin-EDTA in einen Kolben mit 2 Millionen SW1222-Zellen des menschlichen kolorektalen Adenokarzinoms. Inkubieren Sie die Zellen fünf bis 10 Minuten lang mit Trypsin bei 37 Grad Celsius, bis sie sich vom Kolben lösen. Fügen Sie fünf Milliliter vollständiges Medium hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren.
Filtrieren Sie dann die Zellsuspension mit einem 30-Mikrometer-Zellsieb. Injizieren Sie mit einer 10-Mikroliter-Mikropipette zwei Mikroliter der Zellsuspension in jedes Peptidtröpfchen. Satieren Sie 800 Zellen aus der SW1222-Zelllinie vier Tage lang in jede Vertiefung.
Inkubieren Sie die Tröpfchen 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius unter 5 % Kohlendioxid. Geben Sie dann 0,5 Milliliter ergänztes Medium in jede Vertiefung. Zur Vorbereitung der Kontrolle wird der Vorrat der Basalmembran-Matrix-Kontrolle mit zugesetztem Medium verdünnt.
Laden Sie die Zellsuspension in die verdünnte Membran-Basallösung. Pipettieren Sie 20 Mikroliter verdünnte Basalmembranmatrix in jede Vertiefung mit den Zellen. Inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.
Nachdem sich die Tröpfchen verfestigt haben, füge 0,5 Milliliter vollständiges Medium hinzu. Bilden Sie die Zellen an den Tagen eins, vier und sieben mit einem Hellfeldmikroskop ab, um das Wachstum von Organoiden zu bewerten. Eine einwöchige Hellfeld-Bildgebung der Zellen zeigte, dass sich die kleinen Zellcluster zu Organoiden zusammenfügten.
Die von SW1222 abgeleiteten Organoide, die in Peptidhydrogelen kultiviert wurden, wiesen eine runde Morphologie mit einem leichten Aussehen auf. Ein dunkleres Erscheinungsbild deutete auf eine unerwünscht höhere Dichte hin, wie sie in Kolonien in Peptid P am siebten Tag beobachtet wurde.
