Zu Beginn säen Sie 20 Millionen Neugeborenen-Knochenmarkzellen von Mäusen pro T75-Kolben in 10 Milliliter vollständiges DMEM, das 2,5 Milliliter 10%L929-Zellüberstand enthält. Inkubieren Sie den Kulturkolben fünf Tage lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Am dritten Tag der Differenzierung werden zwei Milliliter konditioniertes Medium L929 in den Kolben gegeben.
Beobachten Sie die Zellen täglich unter einem inversen Mikroskop mit 20-facher Vergrößerung. Um die Makrophagen am fünften Tag zu ernten, aspirieren Sie das Differenzierungsmedium aus dem Kolben. Waschen Sie die Zellen mit fünf Millilitern PBS, um nicht adhärente Zellen und Serumproteine zu entfernen.
Geben Sie fünf Milliliter 0,05 % Trypsin-EDTA in den Kolben und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Fügen Sie nach fünf Minuten fünf Milliliter DMEM hinzu und pipettieren Sie, um die Zellen zu lösen. Die Zellsuspension wird fünf Minuten lang bei 350 g zentrifugiert.
Dissoziieren Sie den Zellgaumen in einem Milliliter vollständigem DMEM. Zählen Sie die Zellen auf einem automatisierten Zellzähler. In Gegenwart eines L929-Zellüberstands wurden Knochenmarkzellen innerhalb von fünf Tagen zu Makrophagen differenziert.
Die spindelförmige Zellbildung wurde ab dem zweiten Tag beobachtet, wobei fast die Hälfte am dritten Tag und die Mehrheit am fünften Tag diese Morphologie aufwiesen.
