Bereiten Sie zunächst die geeignete Beschichtungslösung in modifiziertem Tyrode-Puffer vor und beschichten Sie einen Acht-Well-Objektträger, indem Sie ihn zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Waschen Sie dann den beschichteten Objektträger zweimal mit modifiziertem Tyrode-Puffer. Inkubieren Sie den Mikroobjektträger mindestens 30 Minuten lang in modifiziertem Tyrode-Puffer, der fünf Milligramm pro Milliliter BSA enthält, um unspezifische Adhäsion zu unterdrücken.
Zur Herstellung von gewaschenen Blutplättchen zentrifugieren Sie Citrat antikoaguliertes Vollblut bei 200 g für 20 Minuten, um plättchenreiches Plasma zu erhalten. Geben Sie dann Indomethacin und PGE1 in das plättchenreiche Plasma und zentrifugieren Sie es 10 Minuten lang bei 500 g. Resuspendieren Sie das resultierende Plättchenpellet in modifiziertem HEPES-Puffer von Tyrode bei 37 Grad Celsius, um eine Dichte von viermal 10 hoch sieben Blutplättchen pro Milliliter zu erreichen.
Lassen Sie die isolierten Blutplättchen 30 Minuten bei 37 Grad Celsius ruhen. Als nächstes fügen Sie der Thrombozytensuspension DHE-Lösung hinzu, um eine Endkonzentration von 10 Mikromolaren zu erreichen, und inkubieren Sie eine Minute lang bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie nach der Inkubation die Blockierungslösung vom Mikroobjektträger und positionieren Sie ihn für die Bildgebung auf dem Mikroskoptisch.
Anschließend die Blutplättchen sanft dosieren. Verwenden Sie eine 40-fache Öl-Immersionslinse an einem inversen Konfokalmikroskop, um die Umwandlung von DHE in 2-Hydroxyethidium zu überwachen. Bild für 10 Minuten, Bilder alle 10 Sekunden sammeln.
Um die Bildung von Superoxid-Anionen als Reaktion auf einen Agonisten zu überwachen, fügen Sie 10 Minuten nach der Abgabe der Blutplättchen einen löslichen Agonisten hinzu und sammeln Sie weitere 10 Minuten lang Fluoreszenzbilder. Unter Verwendung dieses Protokolls wurde die Erzeugung von Superoxidradikalen während der Thrombozytenadhäsion an Kollagen oder Fibrinogen und von Thrombozyten, die an PLL hafteten, die mit Thrombin stimuliert wurden, untersucht.
