Zu Beginn erhalten Sie plättchenreiches Plasma, indem Sie das antikoagulierte Vollblut mit Citrat bei 200 g für 20 Minuten zentrifugieren. Geben Sie Indomethacin und PGE1 in das Plasma und zentrifugieren Sie es bei 500 g für 10 Minuten. Resuspendieren Sie das resultierende Plättchenpellet in modifiziertem HEPES-Puffer von Tyrode bei 37 Grad Celsius, um eine Dichte von 2x10^8 Blutplättchen pro Milliliter zu erhalten.
Lassen Sie die Blutplättchen 30 Minuten bei 37 Grad Celsius ruhen. Geben Sie DETC bis zu einer Endkonzentration von fünf Mikromolaren und Deferoxamin bis zu einer Endkonzentration von 25 Mikromolaren in die Thrombozytensuspension, gefolgt von CMH bis zu einer Endkonzentration von 200 Mikromolaren. Geben Sie die Proben in Aggregationsküvetten, die mit teflonbeschichteten Rührmagneten ausgestattet sind, und laden Sie sie auf das Aggregometer.
Fügen Sie nach einer Minute Stimuli wie Thrombin oder Kollagen hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten lang. Nach der Inkubation die Thrombozytensuspension aus der Aggregationsküvette in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführen und 10 Sekunden lang schnell bei 6.000 g abschleudern. 50 Mikroliter des Überstands in Kapillar-Mikropipetten füllen und mit EPR-Siegellack verschließen.
Übertragen Sie die Proben an den EPR-Scanner und stellen Sie die Parameter am Scanner ein. Schätzen Sie die CMH-Oxidation zum CM-Radikal als die Fläche unter der Kurve der aufgezeichneten EPR-Peaks. Erhalten Sie eine Kalibrierkurve mit handelsüblichem CM-Radikal.
Die EPR-Signalintensität in den Proben war proportional zur Intensität der EPR-Peaks. Die Spezifität des Nachweises wurde mit ROS-Scavengern und selektiven Inhibitoren von Enzymen, die Superoxid-Anionen erzeugen, bestätigt. Daten zur Thrombozytenstimulation mit Thrombin oder Kollagen in Gegenwart des selektiven Inhibitors VAS2870 darauf hindeuten, dass NADPH-Oxidasen die Hauptquelle für Thrombozyten-Superoxid-Anionen als Reaktion auf diese beiden Agonisten sind.
