Ordnen Sie zunächst die benötigten Experimentiermaterialien auf der Arbeitsplattform an. Geben Sie 100 Mikroliter sterile 0,4%ige Gelatinelösung in die Vertiefungen einer schwarz wandigen, durchsichtigen Bodenplatte mit 96 Vertiefungen. Inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.
Bestätigen Sie unter einem inversen Mikroskop, dass die Endothelzellen in einem T75-Kolben zu 80 bis 100 % konfluent sind. Entfernen Sie das DMEM-Vollmedium durch Aspiration aus dem Kolben. Um die Zellen zu waschen, fügen Sie 10 Milliliter PBS hinzu und schütteln Sie den Kolben vorsichtig.
Ersetzen Sie das PBS durch fünf Milliliter Zelldissoziationslösung. Der Kolben wird bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid etwa 12 Minuten lang inkubiert. Tippen Sie nach sechs Minuten auf die Flasche.
Um die Dissoziation zu erleichtern. Fünf Milliliter des vorgewärmten DMEM-Alleinmediums in den Kolben geben und die Zellsuspension mischen. Mit einer serologischen 10-Milliliter-Pipette die Zellsuspension in ein steriles 50-Milliliter-Röhrchen überführen und fünf Minuten lang bei 150 g zentrifugieren.
In der Zwischenzeit wird die Gelatinelösung mit einer Pastorpipette, die an ein Vakuum angeschlossen ist, aus der 96-Well-Platte abgesaugt. Entfernen Sie nach dem Zentrifugieren der Zellen das Supernatin aus dem Röhrchen, ohne das Pellet zu stören. Geben Sie mit einer serologischen Pipette acht Milliliter frisches DMEM-Komplettmedium in das Röhrchen und pipettieren Sie die Suspension vorsichtig, um das Zellpellet aufzubrechen.
Zählen Sie die Zellen mit trippen blue auf einem Hämozytometer. Fügen Sie DMEM Complete Medium hinzu, um eine Dichte von 600.000 Zellen pro Milliliter Suspension zu erreichen. Mischen Sie die Zellsuspension, indem Sie das Röhrchen vorsichtig umdrehen.
Geben Sie die Zellsuspension in ein 50-Milliliter-Mehrkanal-Pipettenreservoir. Schütteln Sie das Reservoir alle 30 Sekunden vorsichtig von einer Seite zur anderen, um die Suspension zu mischen, und geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter in jede Vertiefung der mit Gelatine beschichteten 96-Well-Platte. Setzen Sie die transparente Plattenabdeckung wieder auf und schütteln Sie die Platte vorsichtig, indem Sie sie von Norden nach Süden und von Osten nach Westen auf die Oberfläche der sterilen Haube schieben.
Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für 16 bis 24 Stunden.
