Gewinnen Sie zunächst Leukämiezellen, die unter optimalen Bedingungen für die Transplantation gezüchtet wurden. Nachdem Sie die Zellen gezählt haben, pelletieren Sie sie bei 300 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur und entsorgen Sie den Überstand. Für die CM-Dil-Färbung resuspendieren Sie die Zellen in der Arbeitslösung, um eins mal 10 hoch sechs Zellen in 100 Mikrolitern zu erhalten, und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.
Waschen Sie die Zellen zweimal mit 10 Millilitern 1X HBSS bei Raumtemperatur. Nachdem Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 300 g pelletiert haben, resuspendieren Sie sie in PBS mit 1 % FBS, um eine Dichte von 40.000 Zellen pro Mikroliter zu erreichen. Schalten Sie dann den Mikroinjektor und die Pumpe ein.
Stellen Sie den Injektionsdruck auf neun bis 11 Pfund pro Quadratzoll und die Injektionszeit auf 0,5 Sekunden ein, um die Nadel abzuschneiden und die Öffnung einzustellen. Laden Sie etwa fünf Mikroliter der Tumorzellsuspensionsleitung vorsichtig in einem einzigen Durchgang in die Mikronadel, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Schneiden Sie mit einer Dumont 5-Pinzette das Ende der Nadel ab, um eine Öffnung zu erzeugen, die den Auswurf unterstützen kann.
Wählen Sie dann gesunde Zebrafischembryonen unter dem Mikroskop aus und eliminieren Sie alle mit Entwicklungsanomalien. Nehmen Sie mit einer Pasteur-Glaspipette die anästhesierten Embryonen auf und ordnen Sie 10 bis 15 von ihnen in einer seitlichen Position auf der 1,5%-Agarose-Platte an. Entfernen Sie überschüssiges Wasser, um eine minimale Menge für das Überleben des Embryos zu erhalten.
Bestätigen Sie anschließend unter dem Lichtmikroskop, dass die Nadel gut geschnitten ist und Zellen enthält. Injizieren Sie 10 bis 15 Nanoliter, was 400 bis 600 Zellen entspricht, für 0,2 bis 0,3 Sekunden in das Eigelb der Embryonen. Nachdem Sie alle Embryonen injiziert haben, sammeln Sie sie in frischem Embryowasser.
Überwachen Sie eine Stunde nach der Injektion den Zellbolus, um die Embryonen mit optimaler Färbung oder gutem Bolus von denen mit minderwertiger Färbung oder minderwertigem Bolus zu trennen. Die CM-Dil-Färbung und die fluoreszierende Proteinmarkierung ermöglichten die Überwachung des Krankheitsverlaufs durch Mikroskopie. Und das Überleben der Embryonen verringerte sich nach der Injektion mit zwei genetisch unterschiedlichen Leukämielinien.
