Zu Beginn erhalten Sie Zebrafischembryonen, die mit Leukämiezellen injiziert wurden, die mit CM-Dil vorgefärbt wurden. Übertragen Sie die anästhesierten Embryonen in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und lösen Sie das Eigelb mit einer P200-Pipette fünf Minuten lang in 100 Mikrolitern kalziumfreier Ringerlösung auf. Inkubieren Sie jede Probe von deyolkierten Embryonen mit einem Milliliter der Trypsin-Kollagenase-Lösung bei 29 Grad Celsius für 30 bis 35 Minuten.
Pipettieren Sie die Embryonen mit einer P1000-Spitze alle fünf Minuten in dieser Lösung auf und ab, bis die Struktur des Rückgrats nicht mehr sichtbar ist. Um die Reaktion zu stoppen, geben Sie 200 Mikroliter FBS in das Röhrchen. Gut mischen und weitere fünf Minuten inkubieren.
Pelletieren Sie die Zellsuspension bei 300 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Sobald der Überstand verworfen wurde, waschen Sie das Zellpellet zweimal in gekühltem PBS und passieren Sie die Zellen durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb. Nach dem Waschen der Zellen wird das Zellpellet in das Färbemedium resuspendiert, das einen Antikörper enthält, der mit den transplantierten Zellen reaktiv ist.
Inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Pelletieren Sie die Zellen und resuspendieren Sie sie in 200 Mikrolitern Färbemedium, das eine mikromolare Helix und P Blue enthält. Übertragen Sie die Zellmischung in ein Fünf-Milliliter-Röhrchen aus Polycarbonat mit rundem Boden und führen Sie eine Durchflusszytometrie durch.
Die doppelte Markierung ermöglichte die Messung von Unterschieden in der Tumorlast zwischen guter und minderer Bolusimpfung.
