Bereiten Sie zunächst das Serum und die Enzymmischungen zusammen mit den entsprechenden Kontrollen vor. Richten Sie im Mikroplatten-Reader ein kinetisches Leseprotokoll ein, um die Absorption bei 260 Nanometern mit dem kürzesten Leseintervall für 30 Minuten zu messen. Tauen Sie anschließend alle gefrorenen Proben auf Eis auf und verdünnen Sie jede aufgetaute Probe 1 bis 10 mit 1x PBS, das in LoBind-Mikrozentrifugenröhrchen auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde.
Um eine fünf Millimolare Adenosinbrühe herzustellen, fügen Sie 66,8 Milligramm Adenosin zu 50 Millilitern 1x PBS hinzu. Nachdem Sie es auf eine 250 mikromolare Lösung verdünnt haben, erwärmen Sie das Adenosin in einem Inkubator auf 37 Grad Celsius. Zu einer 96-Well-Ultraviolett-kompatiblen Mikroplatte fügen Sie 160 Mikroliter des Adenosins hinzu, gefolgt von 40 Mikrolitern jeder verdünnten Proteinprobe in dreifacher Ausfertigung.
Messen Sie die Absorption jeder Vertiefung bei 260 Nanometern für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Exportieren Sie die Daten für die Datenanalyse in eine Tabelle und bestimmen Sie dann die Steigung des linearen Bereichs der Absorptionsdaten als Funktion der Zeit für die ersten Minuten. Die Steigung der Negativkontrolle, bestehend aus gepooltem Humanserum oder PBS, wird von den Steigungen der Enzym-plus-Serum-Gemische bzw. der Enzym-plus-PBS-Gemische subtrahiert.
Normalisieren Sie abschließend alle angepassten Steigungen auf die ursprüngliche Steigung zum Zeitpunkt null Stunde, um den Anteil der verbleibenden Aktivität mithilfe der Gleichung zu erhalten, und stellen Sie den Anteil der verbleibenden Aktivität über die Zeit dar. Die Wildtyp-HsADA1-Aktivität nahm im gepoolten Humanserum schneller ab als im 1x PBS über fünf Tage. Die Absorptionsabfallkurven für den Wildtyp HsADA1 zeigten eine steilere anfängliche Steigung am Tag Null im Vergleich zum fünften Tag.
Negative Kontrollproben zeigten eine vernachlässigbare Änderung der Absorption im Vergleich zu Enzymproben.
