Fahren Sie mit der Durchführung der Reaktion fort, nachdem Sie beide Enden des linearen DNA-Substrats funktionalisiert haben. Nimm zuerst vier S-400 Spin-Säulen und wirbele sie mindestens 30 Sekunden lang, um das Harz wieder zu resuspendieren. Zentrifugieren Sie sie dann eine Minute lang bei 735 G, um den Speicherpuffer zu entfernen.
Übertragen Sie die Säulen in saubere 1,5-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie sofort 100 Mikroliter der doppelt funktionalisierten linearen DNA-Lösung in jede Säule. Zentrifugieren Sie die Säulen zwei Minuten lang bei 735 G, um die DNA durch die Säule zu fließen, während die nicht eingebauten Nukleotide erhalten bleiben.
Nachdem Sie den Durchfluss mit der DNA aus den vier Säulen zusammengepoolt haben, messen Sie das Volumen mit einer Pipette. Anschließend werden M-280 Streptavidin-beschichtete Magnetbeads 30 Sekunden lang vortext, um sie wieder zu resuspendieren. Übertragen Sie vier Milligramm der resuspendierten Magnetkügelchen in ein sauberes 1,5-Milliliter-Röhrchen.
Legen Sie das Röhrchen eine Minute lang in ein Magnetgestell, um die Kügelchen zu sammeln, bevor Sie den Aufbewahrungspuffer entfernen. Resuspendieren Sie die Kügelchen in einem Milliliter Puffer A, indem Sie sie fünf Sekunden lang vortexen, bevor Sie die Kügelchen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Sammeln Sie die Kügelchen, indem Sie die Röhre eine Minute lang in eine Magnethalterung legen.
Nachdem Sie Puffer A entfernt haben, resuspendieren Sie die Kügelchen in 400 Mikrolitern 2X Puffer A durch Pipettieren. Geben Sie dann 400 Mikroliter der funktionalisierten DNA-Lösung zu den Kügelchen und mischen Sie sie vorsichtig durch Pipettieren. Inkubieren Sie die Bead-DNA-Mischung über Nacht bei vier Grad Celsius mit einer End-over-End-Rotation.
Verwenden Sie am nächsten Tag das Magnetgestell, um den Überstand zu entfernen, bevor Sie die Gesamtmenge der an die Magnetkügelchen gebundenen DNA berechnen. Waschen Sie dann die Kügelchen nacheinander mit Puffer B und Puffer C. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 300 Mikrolitern Puffer C und stellen Sie vier 75-Mikroliter-Aliquots her.
