Nehmen Sie zunächst ein 75-Mikroliter-Aliquot, das ein Milligramm DNA-gebundene, mit Streptavidin beschichtete Magnetkügelchen enthält, und entfernen Sie den Überstand mit dem Magnetgestell. Waschen Sie die Kügelchen mit 200 Mikrolitern Ladepuffer. Dann die Kügelchen in 75 Mikrolitern Ladepuffer resuspendieren und durch Pipettieren vorsichtig mischen.
Als nächstes fügen Sie der kügelchengebundenen DNA den Ursprungserkennungskomplex in einer Endkonzentration von 37,5 Nanomolaren hinzu und inkubieren die Reaktion fünf Minuten lang bei 30 Grad Celsius mit 800 Umdrehungen pro Minute Bewegung. CDC6 wird in einer Endkonzentration von 50 Nanomolaren zugegeben und die Reaktion wie zuvor gezeigt inkubiert. Fügen Sie dann Mcm2-7 Cdt1 in einer Endkonzentration von 100 Nanomolar hinzu und inkubieren Sie die Reaktion 20 Minuten lang, wie zuvor gezeigt.
Danach wird DDK in einer Endkonzentration von 100 Nanomolar zugegeben und auf ähnliche Weise 30 Minuten lang inkubiert. Nach dem Entfernen des Überstands wird die an Kügelchen gebundene DNA, die phosphorylierte Mcm-2-7-Hexamere enthält, mit 200 Mikrolitern Waschpuffer mit hohem Salzgehalt gewaschen. Mischen Sie durch Pipettieren und stellen Sie sicher, dass die Kügelchen vollständig resuspendiert sind.
Als nächstes entfernst du den Puffer und wäschst die Kügelchen einmal mit 200 Mikrolitern CMG-Puffer. Um das fluoreszenzmarkierte CMG an perlengebundener DNA zu assemblieren und zu aktivieren, entfernen Sie den CMG-Puffer und resuspendieren Sie die DNA-gebundenen Kügelchen in 50 Mikrolitern CMG-Puffer, der mit fünf millimolaren ADP ergänzt wird. Mischen Sie anschließend alle auf dem Sieb genannten Komponenten in einer Tube und legen Sie sie auf Eis.
Fügen Sie die resuspendierte beadgebundene DNA sofort zum Proteinmix hinzu. Inkubieren Sie die Reaktion 15 Minuten lang bei 30 Grad Celsius und 800 U/min. Waschen Sie die Perle nacheinander mit HSW-Puffer und CMG-Puffer.
Nach dem Entfernen des Puffers wird das CMG mit DNA-gebundenen magnetischen Kügelchen in 200 Mikrolitern Elutionspuffer resuspendiert und dann eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit 800 U/min Rührwerk inkubiert. Legen Sie das Röhrchen in ein Magnetgestell und lassen Sie die Kügelchen fünf Minuten lang einsammeln. Sammeln Sie vorsichtig den Überstand mit den eluierten DNA-CMG-Komplexen, ohne die abgesetzten Kügelchen zu zerstören, und übertragen Sie ihn in ein neues Röhrchen.
Um sicherzustellen, dass keine Kügelchen in der Lösung zurückbleiben, legen Sie den gesammelten Überstand wieder in ein Magnetgestell und bewahren Sie ihn weitere fünf Minuten sorgfältig auf. Sammle den Überstand und fülle ihn in ein neues Röhrchen um. Zu den 200 Mikrolitern Überstand werden 1.400 Mikroliter CMG-Puffer hinzugefügt.
Die Probe ist nun bereit für die Einzelmolekül-Bildgebung.
