Um mit der Transformation von Escherichia coli BL21 DE3-Zellen zu beginnen, tauen Sie 50 Mikroliter Aliquot der kompetenten Zellsuspension auf Eis auf. Geben Sie einen Mikroliter DNA des pET 28a Sumo TRF2-Plasmids in die zuständige Zellsuspension und schwenken Sie das Röhrchen vorsichtig, um die Suspension zu mischen. Nach der Transformation verteilen Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension auf einer Luria bertani oder LB-Agarplatte, die 50 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin enthält.
Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag wählen Sie eine Kolonie der transformierten Zellen aus und kultivieren sie in fünf Millilitern LB-Medium, ergänzt mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin. Inkubieren Sie 18 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie bei 220 U/min.
Nach der Inkubation wird die Kultur mit einem millimolaren IPTG als Endkonzentration induziert. Inkubieren Sie 17 Stunden lang bei 20 Grad Celsius, um die Proteinexpression zu fördern. Laden Sie die Rohproteinextrakte zusammen mit dem Ladepuffer auf ein SDS-PAGE-Gel.
Lassen Sie die Proben zunächst 30 Minuten lang bei 100 Volt laufen, gefolgt von 120 Volt für 50 Minuten in einem Tris-Glycin-Puffer. Färben Sie dann mit Coomassie-Blau, um die Proteinexpression zu visualisieren. Für die Proteinreinigung zentrifugieren Sie den Rohproteinextrakt bei 38.000 g 40 Minuten lang bei vier Grad Celsius und filtrieren den Überstand durch einen 0,22-Mikrometer-Spritzenvorsatzfilter.
Der gefilterte Überstand wird auf die voräquilibrierte Nickelsäule im Bindungspuffer geladen. Waschen Sie die Säule mit Bindungspuffer und eluieren Sie das Protein mit dem vorbereiteten Imidazol-Gradienten, wobei Sie 12 Fraktionen zu je einem Milliliter sammeln. Geben Sie Glycerin in einer Endkonzentration von 50% zu dem konzentrierten und pufferausgetauschten Protein für die Lagerung.
Die Expression von TRF2 in Escherichia coli coli konnte erfolgreich nachgewiesen werden, wie SDS-PAGE zeigte, wobei vor und nach der Induktion unterschiedliche Banden auftraten, die TRF2 entsprachen.
