Zentrifugieren Sie zunächst eins mal 10 hoch sieben HeLa-Zelllinien, die telomerische Restriktionsfragmente DNA in einer Menge von 1.000 g für drei Minuten enthalten. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern PBS. Nach der Behandlung mit SDS-Proteinase K und Natriumchlorid zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 16.900 g für 10 Minuten.
Übertragen Sie den Überstand in ein neues Zentrifugenröhrchen und fügen Sie ein gleiches Volumen Isopropanol hinzu, um schwimmende Lipide oder Sedimente zu vermeiden. Zentrifugieren Sie bei hoher Geschwindigkeit und waschen Sie das Pellet mit 500 Mikrolitern 70%igem Ethanol. Nachdem Sie das DNA-Pellet getrocknet haben, resuspendieren Sie es vorsichtig in 475 Mikrolitern TE-Puffer und mischen Sie es vorsichtig, indem Sie auf den Boden des Röhrchens klopfen.
Fügen Sie nun 25 Mikroliter 10 Milligramm pro Milliliter RNA hinzu und klopfen Sie auf das Röhrchen, bis sich das Pellet vollständig aufgelöst hat. Fügen Sie dann 1/10 Volumen dreimolaren Natriumacetat und zwei Volumen kaltes 100%iges Ethanol hinzu und stellen Sie das Röhrchen zwei bis drei Stunden lang bei minus 80 Grad Celsius. Geben Sie nach der Zentrifugation und 70 %ige Ethanolwäschen 100 Mikroliter TE-Puffer zum DNA-Pellet, klopfen Sie zum Mischen auf das Röhrchen und stellen Sie es zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius, damit es sich vollständig auflöst.
Kombinieren Sie für den DNA-Aufschluss vier Mikrogramm genomische DNA mit einem Mikroliter CviAII, zwei Mikrolitern 10-fachem Verdauungspuffer und Wasser, um ein Gesamtvolumen von 20 Mikrolitern zu erreichen. Inkubieren Sie die Mischung 12 Stunden lang bei 25 Grad Celsius. In einem Thermocycler erhitzen Sie die Mischung drei Minuten lang bei 75 Grad Celsius.
Verringern Sie dann die Temperatur alle 30 Sekunden um 0,1 Grad Celsius, bis sie 25 Grad Celsius erreicht. Nach dem Reinigen und Trocknen die unteren Deckgläser mit 20 Mikrolitern 0,1 % Nitrozellulose beschichten und mit Referenzperlen bestreichen. Die Deckgläser bei 100 Grad Celsius vier Minuten backen.
Montieren Sie das Sandwich der Durchflusszelle. Und nach dem Erhitzen auf 85 Grad Celsius massieren Sie die Baugruppe mit zwei Tupfern, bis der Parafilm den Kanal versiegelt. Waschen Sie 10 Mikroliter M-270 Kügelchen fünfmal mit 50 Mikrolitern Arbeitspuffer mit einem Magneten.
Geben Sie nach dem Waschen die Kügelchen auf der verdauten genomischen DNA in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Bewegen Sie das Röhrchen ein paar Mal vorsichtig, um die Kügelchen und die DNA-Probe zu vermischen. Lassen Sie die Mischung eine Stunde lang auf Eis.
Waschen Sie die Mischung nach der Inkubation dreimal mit 500 Mikrolitern Arbeitspuffer und ziehen Sie die Kügelchen mit einem Magneten im Abstand von 10 Minuten zwischen den Wäschen nach unten. Suspendieren Sie die Probe in einem Arbeitspuffer und laden Sie 30 Mikroliter der Mischung in die Durchflusszelle. Spülen Sie die ungebundenen Magnetkügelchen nach 30 Minuten aus.
Nachdem Sie die Durchflusszelle auf die Objektivlinse gesetzt haben, wählen Sie ein Paar kubischer Fünf-Millimeter-Magnete aus, die in einer vertikalen Anordnung angeordnet sind, und richten Sie den Magnethalter für die Bildgebung an der x-Achse des Strahlengangs der magnetischen Pinzette aus. Starten Sie die grafische Programmiersoftware und schließen Sie die Controller für die magnetische Pinzette an. Passen Sie das Sichtfeld so an, dass sich eine Referenzperle am unteren Rand der Durchflusszelle befindet, und stellen Sie die Objektivlinse leicht so ein, dass die Referenzperle klare Brechringe zeigt.
Schreiben Sie ein Skript in MATLAB, um Motorbewegungen für Kraftrampen-Assays zu steuern. Importieren Sie das Skript in eine grafische Programmiersoftware, um die Einzelmolekülexperimente zu testen. Laden Sie bei langsamer Durchflussrate 200 Mikroliter 10-nanomolares TRF1 in die Durchflusszelle.
Wählen Sie nach 30 Minuten Bindung ein Skript für ein Kraftrampenexperiment mit einer Kraftbelastungsrate von plus/minus einem Piconewton pro Sekunde aus. Benennen Sie die Datendateien, und führen Sie das Experiment aus. Die Integrität der genomischen DNA wurde mittels Agarose-Gelelektrophorese bestätigt, wobei das resultierende TRS über verschiedene menschliche Zelllinien hinweg konsistente Längen aufwies.
Telomerische Repeatsequenzen in TRS wurden über Southern-Blot nachgewiesen und zeigten klare Hybridisierungssignale. Die Kraftverlängerungskurven aus dem Kraftrampen-Assay zeigten Zickzackmuster während der Dehnung, was auf das Brechen von Protein-DNA-Wechselwirkungen hinweist. Die Dissoziationskinetik von telomeren DNA-Proteinkomplexen zeigte eine lineare Beziehung zwischen Kraft und Dissoziationsrate.
Darüber hinaus untersucht die Längenheterogenität der Telomer-DNA aus menschlichen Zellen den Mechanismus der Schleifenbildung in Telomeren unterschiedlicher Länge.
