Einzelmolekülmethoden wurden verwendet, um die telomerische Protein-DNA-Interaktion zu untersuchen. Die Herstellung von Einzelmolekülkonstrukten mit den sich wiederholenden Telomermotiven bleibt jedoch eine herausfordernde Aufgabe. In diesem Protokoll beschreiben wir die Schritte zur Expression und Reinigung des TRF2-Proteins, zur Vorbereitung der Telomer-DNA, zur Einrichtung mechanischer Einzelmolekül-Assays und zur Analyse der resultierenden Daten.
Einzelmolekül-Werkzeuge sind leistungsfähige Techniken zur Erforschung telomerer Protein-DNA-Wechselwirkungen. Mechanische Einzelmolekülmethoden wie magnetische Pinzetten, optische Pinzetten und AFM wurden unter anderem verwendet, um die TRF2-abhängige DNA-Verzerrung zu untersuchen, die TRF2-vermittelte säulenförmige Stapelung von humanem Telomerchromatin aufzudecken und das Vorhandensein von Telomerase-Katalyse zu beobachten. Wir untersuchten telomerische DNA-Protein-Wechselwirkungen mit einer einzelnen molekularen magnetischen Pinzette, die eine präzise Messung von Änderungen der Ausdehnung und der Dauer von Protein-DNA-Wechselwirkungen unter angewendeten Kräften ermöglichte.
Aus diesen Messungen leiteten wir die Dissoziationskinetik der telomeren DNA-Protein-Komplexe ab. Darüber hinaus wurde die Bildung von Schleifen innerhalb dieser Komplexe aufgedeckt. Zahlreiche Strukturen von Telomer-bindenden Proteinen im Komplex mit der DNA wurden mittels Kryo-EM, Röntgenkristallographie und NMR aufgeklärt.
Diese strukturellen Erkenntnisse haben unser Verständnis der telomeren Protein-DNA-Wechselwirkungen erweitert. Um die Dynamik dieser Wechselwirkungen weiter zu untersuchen, haben wir eine einzelmolekulare mechanische Methode speziell für die Untersuchung von telomeren Protein-DNA-Wechselwirkungen entwickelt. Einzelmolekülwerkzeuge sind leistungsfähige Techniken zur Untersuchung von Protein-DNA-Wechselwirkungen an Telomeren.
Diese Methoden sind besonders wertvoll für topologische Konformationen und die Analyse der Kinetik der Protein-DNA-Assoziation und -Dissoziation.
