Nehmen Sie zu Beginn Schweineaugen, die in einen Ein-Liter-Becher gegeben werden. Halten Sie einen Augapfel mit einer Pinzette fest und entfernen Sie das überschüssige Augengewebe mit einer Schere in einer sterilen Petriplatte. Halten Sie bei Epithelverletzungen den Augapfel mit sterilisierten, fusselfreien Tüchern fest und markieren Sie die Mitte der Hornhaut mit einem sechs Millimeter großen Trepan.
Kratzen Sie dann mit einem kleinen Skalpell oder einer weichen Rasierklinge vorsichtig die Epithelzellen innerhalb des trepanmarkierten Kreises ab. Entfernen Sie alle Zelltrümmer und stellen Sie sicher, dass die Basalmembran intakt bleibt. Reinigen Sie anschließend den Wundbereich mit Wattestäbchen.
Präparieren Sie den Augapfel mit einem Skalpell und einer Schere, indem Sie entlang der Corneo-Skleral-Ränder schneiden. Spülen Sie dann die Hornhäute in einem sterilisierten 500-Milliliter-Becherglas ab, das PBS enthält. Legen Sie dann die herausgeschnittenen Hornhäute kopfüber in eine sterile Form.
Füllen Sie die endotheliale Hornhauthöhle mit einem Minimum an essentiellem Medium (MEM), das 1 % Agarose enthält und bei 48 Grad Celsius gehalten wird. Nun die Hornhaut umdrehen und in eine 35-Millimeter-Schale geben. Geben Sie zwei Milliliter MEM mit oder ohne Testmittel tropfenweise auf die Oberfläche der zentralen Hornhaut, wobei Sie darauf achten, dass die limbale Bindehautregion bedeckt ist, während das Epithel der Luft ausgesetzt bleibt.
Stellen Sie dann die Kulturschalen in einen befeuchteten 5%igen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius. 40 Stunden nach der Wunde färben Sie die verwundete kultivierte Hornhaut mit Richardson-Färbelösung. Waschen Sie die verfärbten Hornhäute mit PBS, bevor Sie sie fotografieren.
Markieren Sie dann mit dem gleichen Trepan die ursprüngliche Wunde und kratzen Sie mit einem kleinen Skalpell die Epithelzellen innerhalb der markierten Kreise ab. Entnehmen Sie die gesammelten Zellen und geben Sie sie in ein vorgekühltes Zentrifugenröhrchen. Die verbleibende Wundfläche war bei Hornhäuten, die mit Nepafenac behandelt wurden, signifikant größer 0,1 % im Vergleich zu denen, die mit Bromfenac 0,09 % und Ketorolac 0,45 % behandelt wurden. Hornhäute, die mit LL-37 in Höhe von 0,2 und 0,5 Mikrogramm pro Milliliter behandelt wurden, zeigten eine signifikant beschleunigte Wundheilung unter Bedingungen mit hohem Glukosegehalt im Vergleich zu unbehandelten Hornhäuten.
