Axolotl-Gewebeaufnahme und -verarbeitung für Rasterkraftmikroskopie-Messungen in regenerierendem und intaktem Gliedmaßengewebe

Um einen Zentimeter lange Zylinder mit einem Durchmesser von einem Zentimeter herzustellen, erhitzen Sie einen Pappschneider unter einer Bunsenbrennerflamme und schneiden Sie mit der erhitzten Klinge ein 15-Milliliter-Rohr ab. Decken Sie eine Seite der Zylinder mit Parafilm-Stücken ab. Nachdem Du den Axolotl betäubt und sichergestellt hast, dass er nicht auf taktile Reize reagiert, richtest Du die Gliedmaßen senkrecht zur Körperachse aus.

Amputieren Sie die Extremität unmittelbar distal des verkalkten Bereichs der zeugopodialen Region. Setze den Axolotl in einen Tank mit frischem Warmwasser und Analgetika zurück. Nach 24 Stunden überträgst Du den Axolotl wieder in frisches Haltewasser und lässt die Gliedmaße sich bis zum gewünschten Stadium regenerieren.

Nachdem Sie den anästhesierten Axolotl unter ein Stereomikroskop gelegt haben, messen Sie die Länge der Extremität im gewünschten Regenerationsstadium für die Histolyse und Kondensation der Knorpelstadien. Nachdem Sie die Gliedmaßen gesammelt haben, legen Sie sie zum Sezieren in eine Petrischale. Präparieren Sie die Gliedmaßen unter einem Stereomikroskop mit einem Skalpell auf Höhe des Ellbogens und legen Sie sie in eine Petrischale, die APBS-Lösung enthält.

Ordnen Sie die Pasteur-Pipetten und den auf 37 Grad Celsius eingestellten Thermoblock mit Agarose-Aliquoten auf der Arbeitsplattform an. Nehmen Sie den Kälteblock aus dem minus 20 Grad Celsius heißen Gefrierschrank und legen Sie den Zylinder mit dem mit Parafilm überzogenen Ende nach unten darauf. Legen Sie die Gliedmaße auf eine saubere Platte und entfernen Sie vorsichtig überschüssige Flüssigkeit mit Seidenpapier von der präparierten Gliedmaße.

Geben Sie die geschmolzene Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt darauf und bewegen Sie das Glied kurz in der Agarose, um das verbleibende APBS von der Hautoberfläche zu verdrängen. Platzieren Sie den Wurfarm schnell im Zylinder und stellen Sie sicher, dass er vertikal ausgerichtet ist und der Interessenbereich nach oben zeigt. Geben Sie Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in den Zylinder, bis das Gewebe vollständig bedeckt ist.

Nehmen Sie dann den Zylinder aus dem Kaltblock und lassen Sie die Agarose 30 Sekunden lang erstarren. Entfernen Sie nach der Erstarrung den Parafilm von der Unterseite des Zylinders und befestigen Sie das agarosehaltige Gewebe mit Cyanacrylatkleber an der Vibratomstufe. Entfernen Sie dann die überschüssige umliegende Agarose mit einem Skalpell.

Tauchen Sie die Bühne in die APBS-Lösung zum Schneiden. Beginnen Sie mit dem Schneiden der Agarose in 100-Mikrometer-Schritten, bis die Gewebespitze erreicht ist. Schnitte dann, bis der distale Teil des Gewebes entfernt ist.

Entfernen Sie mit einer Rasierklinge vorsichtig den gewebehaltigen Agaroseblock aus dem Vibratomstadium. Befestigen Sie den Block sofort mit chirurgischem Gewebekleber an einer 35-Millimeter-Petrischale aus Kunststoff. Fügen Sie etwa zwei Milliliter Nährmedium hinzu, um das Gewebe zu bedecken.