Montieren Sie den Ausleger vor Rasterkraftmikroskopie- oder AFM-Messungen auf einem Glasblock. Setzen Sie eine mit PBS gefüllte Petrischale in die Halterung des Motortisches ein und setzen Sie den Glasblock in den AFM-Kopf ein. Positionieren Sie dann den AFM-Kopf über der Petrischale, so dass der Ausleger in den Puffer eingetaucht ist, und richten Sie den Laser manuell aus.
Drücken Sie in der JPK-Software die Annäherungs- und Akquisitionstaste, um den Ausleger auf eine harte Oberfläche zu schieben. Sobald die einzelne Kraft-Weg-Kurve erfasst wurde, öffnen Sie den Kalibrierungsmanager und wählen Sie unter Methode die Option Kontaktbasiert. Stellen Sie dann die Raumtemperatur auf 20 Grad Celsius ein.
Vergrößern Sie nun die Kurve und wählen Sie den linearen Teil für die Empfindlichkeitsanpassung aus. Klicken Sie auf das Kontrollkästchen für die Empfindlichkeit und ziehen Sie den Ausleger 200 Mikrometer von der Oberfläche zurück. Aktivieren Sie dann das Kontrollkästchen für das Unendlichkeitssymbol und klicken Sie auf Run Thermal Noise.
Vergrößern Sie als Nächstes das resultierende Häufigkeitsdiagramm und definieren Sie mit der rechten Maustaste einen Bereich. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Federkonstante und schließen Sie den Kalibrierungsmanager. Setze die Petrischale mit dem regenerierten Axolotl-Glied, das in den Gewebeblock und das Kulturmedium eingebettet ist, in den Schalenhalter des AFM ein.
Erfassen Sie ein Übersichtsbild des Gewebeblocks im Hellfeldmodus. Zoomen Sie in den interessierenden Bereich und passen Sie die Belichtungszeit und den Fokus an. Richten Sie die Gitternetzparameter für Eindringmessungen ein, und zeichnen Sie ein Array von Kraft-Weg-Kurven auf.
Für die Datenverarbeitung in der PyJibe-Software öffnen Sie die Datei, die die Kraft-Verschiebungs-Kurve enthält. Wählen Sie die Registerkarte Vorverarbeitung aus, und wählen Sie unter der Kontaktpunktschätzung die Option Stückweise Anpassung mit Linie und Polynom aus. Wählen Sie dann die Registerkarte Passung aus, und wählen Sie unter Modell die Option Sphärischer Eindringkörper aus, wählen Sie unter Methode die Option Nelder aus.
Für die viskoelastische Analyse in der PyJibe-Software öffnen Sie die Datei mit der Kraft-Weg-Kurve. Wählen Sie die Registerkarte Vorverarbeitung aus, und wählen Sie unter der Kontaktpunktschätzung die Option Stückweise Anpassung mit Linie und Polynom aus. Wählen Sie dann die Registerkarte Passung und unter Modell das Hertz-Modell aus, das mit dem KVM-Modell für die Viskoelastizität korrigiert wurde.
Wählen Sie unter Methode die Option leastsq aus. Stellen Sie den genauen Eindringradius auf 10 Mikrometer und die Annäherungsgeschwindigkeit auf 7,5 Mikrometer pro Sekunde ein. Drücken Sie auf Modell anwenden und Alle anpassen, um das scheinbare und unentspannte Elastizitätsmodul, die scheinbare Viskosität und die Relaxationszeit des Maxwell-Elements zu erhalten.
Messungen des scheinbaren Elastizitätsmoduls des Radius und der Ulna bei intakten Gliedmaßen zeigten keinen signifikanten Unterschied. Während der Histolysephase sanken die scheinbaren Elastizitätsmodule des Radius und der Ulna dramatisch auf 0,03 bzw. 0,13 Kilopascal. Die scheinbaren Elastizitätsmodule im Zentrum des intakten Knorpels waren höher als in der Peripherie.
In der Histolysephase zeigten Messungen des scheinbaren Elastizitätsmoduls keinen signifikanten Unterschied zwischen dem Knorpelzentrum und der Peripherie. Während der Knorpelkondensation stiegen die scheinbaren Elastizitätsmodule signifikant auf 0,77 Kilopascal an, was den mittleren Steifigkeitswerten entspricht. Unentspannte Module zeigten erhebliche Unterschiede zwischen intaktem Gewebe während der Histolyse und im kondensierenden Knorpel.
Die scheinbaren Elastizitätsmodule waren den unentspannten Modulen sehr ähnlich, was auf eine überwiegend elastische Reaktion hindeutet. Die scheinbare Viskosität war während der Histolyse signifikant niedriger als bei intaktem Gewebe und kondensierendem Knorpel.
