Beschichten Sie zunächst die 24-Well-Platten mit der Beschichtungslösung und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius oder über Nacht bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Platten zweimal mit sterilem Wasser und lagern Sie sie bei Raumtemperatur, bis die Zellen bereit für die Beschichtung sind. Nehmen Sie nun ein Stück des Pferdejejunums und legen Sie es in kalte Ringerlösung auf Eis.
Entfernen Sie einen 10 Zentimeter großen Teil aus dem Jejunum und öffnen Sie ihn an der antimesenterialen Grenze, wobei Sie die nicht-lymphoiden Regionen in der Mitte positionieren. Schneiden Sie dann die Portion in einen etwa sieben mal sieben Zentimeter großen Abschnitt und spülen Sie das Taschentuch vor der Dissektion gut mit frischer Ringerlösung ab. Stecken Sie nun das Gewebe mit der Schleimhautseite nach oben auf eine mit Silikonelastomer beschichtete Petrischale in kalter Klingellösung (PBS) und dehnen Sie es so weit wie möglich.
Entfernen Sie mit einer gebogenen Pinzette die Darmzotten und entfernen Sie dann die Schicht der Lamina propria aus der etwa fünf mal fünf Zentimeter großen nicht-lymphoiden Region. Entfernen Sie anschließend mit einer Mikrodissektionsschere die Submukosa in einem Blatt, indem Sie sie an einer Ecke befreien. Beobachten Sie die natürliche Trennung beim Abschälen der Submukosa von der inneren zirkulären Muskelschicht.
Anschließend hacken Sie die angesammelte submuköse Schicht in zwei bis fünf Millimeter große Stücke. Geben Sie sie in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen, das fünf Milliliter Orgono ohne FBS, Kollagenase, Protease und BSA enthält. Inkubieren Sie das Gewebe für zwei bis drei Stunden bei 37 Grad Celsius für die enzymatische Verdauung.
Fügen Sie nach der Inkubation 10 Milliliter Orgono mit FBS bei Raumtemperatur hinzu, um die Enzymwirkung zu stoppen. Pipettieren Sie das Gewebegemisch 15 Mal mit einer 10-Milliliter-Serologiepipette auf und ab, um die Zellen vom Gewebe zu trennen. Dann zentrifugieren Sie die Mischung bei 3000 g drei Minuten lang bei Raumtemperatur.
Entsorgen Sie anschließend den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern PBS bei Raumtemperatur, indem Sie die Lösung 15 Mal mit einer serologischen 10-Milliliter-Pipette auf und ab pipettieren. Das konische Röhrchen wird bei 3000 g drei Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern Orgono mit FBS, indem Sie es 15 Mal auf und ab pipettieren.
Als nächstes filtrieren Sie die Zellen nacheinander durch ein Zellsieb mit 100 Mikrometern, 70 Mikrometern und 40 Mikrometern Porengröße. Nachdem Sie die Zellen zentrifugiert und den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Orgono mit FBS. Färbe die Zellen dann mit Trypanblau, um lebende Zellen zu identifizieren und sie mit einem Hämozytometer zu zählen.
Säen Sie nun etwa 400.000 Zellen in 300 Mikrolitern Orgono mit FBS in jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte. Geben Sie fünf Mikroliter N2, fünf Mikroliter G5 und 10 Mikroliter B27 in jede Vertiefung. Stellen Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid, um die Zelladhäsion zu ermöglichen.
Wenn die Zellen aus der ersten Passage eine Konfluenz von 70 bis 80 % erreichen, setzen Sie die Vertiefungen 24 Stunden lang null, 10 und 25 Nanogramm Interleukin-1 beta aus. In den Kulturen wurden spindelförmige Zellen beobachtet, die mit der enterischen Gliamorphologie übereinstimmten, mit Pleomorphismus und minimaler Kontamination durch andere Zelltypen.
