Beschichten Sie zunächst die Transwell-Einsätze mit 42 Mikrolitern 0,05%Matrigel. Eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren, damit Matrigel aushärten kann. Saugen Sie das zusätzliche Medium an und trocknen Sie die Transwells 30 Minuten lang unbedeckt.
Geben Sie dann 200 Mikroliter DMEM F12 Medium in jede Einlage und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie die Matrigel-Patties mit den Organoiden mit PBS. Setzen Sie sie auf Eis einer Zellrückgewinnung von 500 Mikrolitern aus und pipettieren Sie die Mischung wiederholt, um eine vollständige Sammlung von Zellen in einem 15-Milliliter-Röhrchen zu gewährleisten.
Dann zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet im Zielvolumen der Darmepithelstammzelle oder des IESC-Mediums. Beschichten Sie nun eine Ein-Milliliter-Spritze mit IESC-Medium vor und aspirieren Sie die Zellsuspension durch eine 16-Gauge-Nadel.
Ersetzen Sie dann die 16-Gauge-Nadel durch eine 28-Gauge-Nadel und werfen Sie die Suspension aus, um die Trennung der Organoide zu fördern. Als nächstes geben Sie 200 Mikroliter der resultierenden Zellsuspension in die apikale Seite der beschichteten Transwells. Geben Sie 500 Mikroliter IESC-Medium und Wachstumsfaktoren auf die basale Seite.
Verwenden Sie eine TEER-Messkammer mit zwei Elektroden, um den TEER über die Monoschichten zu quantifizieren. Füllen Sie den Kulturbecher mit 1,5 Millilitern IESC-Medien und stellen Sie sicher, dass genau 200 Mikroliter Medium im Transwell-Einsatz vorhanden sind, damit die Flüssigkeitsstände während der Messung übereinstimmen. Setzen Sie den basolateralen Aspekt der Transwell-Inserts entweder entzündlichen Zytokinen von Interleukin-1 beta oder Gliaprodukten aus Kulturen aus, die Interleukin-1 beta ausgesetzt waren.
Messen Sie den TEER alle 10 bis 15 Minuten für 45 Minuten, indem Sie jeden Transwell in den Kulturbecher geben. Die basolaterale Exposition gegenüber Medien aus Gliakulturen, die mit 10 und 25 Nanogramm Interleukin-1 beta behandelt wurden, erhöhte die Permeabilität der Epithelbarriere signifikant. Es wurde kein signifikanter Anstieg der epithelialen Permeabilität nach Exposition mit equinem Interleukin-6 in verschiedenen Konzentrationen beobachtet.
