Ernten Sie zunächst die Samen der Mutanten- und X134-Pflanzen und lassen Sie sie auf natürliche Weise bei Raumtemperatur trocknen, bis der Feuchtigkeitsgehalt etwa 13 bis 15 % erreicht. Nachdem Sie die Schälmaschine aktiviert haben, geben Sie 10 g Reiskörner in den Feeder, um die Hüllpel effizient zu entfernen. Füllen Sie die geschälten Reissamen in die Reismühle und betreiben Sie die Maschine 60 Sekunden lang, um die Aleuronschicht zu entfernen, die polierten Reis ergibt. Geben Sie dann den polierten Reis in die Mühle.
Stellen Sie die Mahlfrequenz auf 60 Hz ein und lassen Sie die Mühle zwei Zyklen lang 15 Sekunden lang laufen, um Reispulver herzustellen. Geben Sie das gemahlene Reispulver in eine Petrischale und stellen Sie es für 12 Stunden in den vorgeheizten Backofen auf 37 °C. Geben Sie dann 100 mg Reispulver in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und klopfen Sie vorsichtig auf das Röhrchen.
Geben Sie 180 l gereinigtes Wasser in das Röhrchen und kochen Sie die Probe 20 Minuten lang in einem Wasserbad. Nachdem die Probe abgekühlt ist, geben Sie 4 ml AMG mit Pankreas-Alpha-Amylase in das Röhrchen. Mischen Sie dann den Inhalt auf einem Vortex-Oszillator und inkubieren Sie das Röhrchen 16 Stunden lang bei 37 °C unter kontinuierlichem Rühren.
Fügen Sie nun 4 mL Ethanol hinzu und mischen Sie die Probe mit einem Wirbel. Dann zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 1.500 g für 10 Minuten. Nach dem Dekantieren des Überstands 2 ml 50 % Ethanol und anschließend 6 ml 50 % IMS in das Röhrchen geben und mischen.
Gießen Sie nach dem Zentrifugieren des Röhrchens vorsichtig den Überstand ab und drehen Sie das Röhrchen um, um überschüssige Flüssigkeit abzulassen. Stellen Sie das Röhrchen in ein Eisbad, fügen Sie 2 ml 2 molare Kaliumhydroxid hinzu und rühren Sie die Probe 20 Minuten lang um, um den Flock wieder zu suspendieren und resistente Stärke aufzulösen. Geben Sie 8 ml 1,2 molaren Natriumacetatpuffer mit einem pH-Wert von 3,8 in das Röhrchen und mischen Sie es mit einem Magnetrührer.
Dann sofort 0,1 mL AMG in die Mischung geben und gründlich mischen. Die Probe wird 30 Minuten lang bei 50 °C in einem Wasserbad mit intermittierendem Mischen unter Verwendung eines Wirbels inkubiert. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie das Röhrchen 10 Minuten lang bei 1.500 g.
Übertragen Sie nun 0,1 mL des Überstands in ein frisches Glasröhrchen. Fügen Sie 3 ml Glukoseoxidase-Peroxidase-Reagenz hinzu und inkubieren Sie die Probe 20 Minuten lang bei 50 °C. Pipettieren Sie vorsichtig 200 l jeder Blindprobenlösung und Standardlösung in eine 96-Well-Platte.
Messen Sie die Extinktion jeder Probe bei 510 nm gegen die Blindlösung und berechnen Sie den Gehalt an resistenter Stärke anhand der Formel. Zum Schluss werden den Teilnehmern 50 g vorbereiteter Reis mit 200 ml Wasser präsentiert. Entnehmen Sie nach der Mahlzeit venöse Blutproben zu verschiedenen Zeitpunkten, um eine Blutzuckeranalyse durchzuführen.
Der Gehalt an resistenter Stärke war in der SBEIIb-Mutante mit 5,2 % im Vergleich zum Wildtyp signifikant höher. Der Verzehr des zubereiteten Reises führte nach 15 und 30 Minuten zu einer langsameren und reduzierten Glukosereaktion mit einer Reduktion von 9,7 % bzw. 3,7 %.
