Stellen Sie zunächst ein 50-Milliliter-Röhrchen auf Eis und fügen Sie nacheinander Kollagen eine Lösung zusammen mit anderen Komponenten hinzu. Schütteln Sie die Tube, um sie gründlich zu mischen. Mit einer P10-Pipette eine molare Natronlauge tropfenweise hinzufügen, während Sie die Mischlösung schütteln, um den pH-Wert auf 7,3 einzustellen.
Fügen Sie 1,25 Milliliter Basalmembranmatrix zu der Fünf-Milliliter-Kollagen-Ein-Mischung hinzu und mischen Sie die Lösung vorsichtig. Legen Sie dann eine 12-Well-Platte für zwei Minuten auf Eis. Geben Sie mit breiten Bohrungsspitzen die Kollagen-Ein-Basalmembran-Matrix-Mischung langsam auf die 12-Well-Platte.
Legen Sie die 12-Well-Platte für zwei Stunden in den 37 Grad Celsius heißen Inkubator, um die erste Schicht Hydrogel zu verfestigen. Bewahren Sie das restliche Kollagen und eine Basalmembran-Matrix-Mischung für die spätere Verwendung auf Eis auf. Dann werden ca. 60 Zellaggregate in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
Und kühlen Sie die Tube fünf Minuten lang auf Eis ab. Entfernen Sie das Medium vorsichtig mit einer P200-Pipettenspitze aus dem Röhrchen. Geben Sie 1,5 Milliliter der Kollagen-Ein-Basalmembran-Mischung tropfenweise zu den Zellaggregaten und mischen Sie sie vorsichtig mit einer P200-Pipettenspitze mit breiter Bohrung, um sie zu resuspendieren.
Übertragen Sie die Platte mit der ersten Schicht Hydrogel aus dem Inkubator in die Biosicherheitswerkbank. Geben Sie 1,5 Milliliter der Zuschlagstoffsuspension auf die ausgehärtete Hydrogelschicht und schütteln Sie die Platte vorsichtig, um die Zuschlagstoffe gleichmäßig zu verteilen. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für zwei Stunden.
Gefäßdifferenzierungsmedium zwei in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad für 20 Minuten vorwärmen. Geben Sie zwei Milliliter Medium in jede Vertiefung und kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Wechseln Sie das Medium alle drei Tage mit frischem, vorgewärmtem Gefäßdifferenzierungsmedium zwei.
Organoide exprimierten CD31, ERG1 und PDGFR beta, was auf das Vorhandensein von vaskulären Endothelzellen und Parasiten hinweist. Die vaskulären Netzwerke wurden mittels Immunfluoreszenzmikroskopie nach der Gewebereinigung sichtbar gemacht. Reife Organoide, die an Tag 17 gefärbt wurden, zeigten Gefäßnetzwerke, die die Sphäroide innerhalb des Gelblocks einkapselten.
Organoide, die an Tag 28 entnommen wurden, wiesen Gefäßnetzwerke auf, die sich um die Sphäroide wickelten, anstatt sich radial auszudehnen.
