Wir danken unseren Finanzierungsquellen Genome Canada und Genome Québec, und der Université de Montréal sowie Mittel aus dem Canadian Foundation for Innovation für die Finanzierung unserer &quot;Synapse zu Disease &#39;(S2D) Projekt.

1. Auswahl der Krankheit, die durch de novo-Mutationen verursacht werden Eine Krankheit, die den folgenden Kriterien entspricht, kann mit der De-novo-Mutation Hypothese passen: <ol><li> Die reproduktive Fitness reduziert. </li><li> Die Häufigkeit der Erkrankung ist relativ hoch und konstant trotz unterschiedlichster Umgebungen. </li><li> Die Krankheit ist mit einem höheren Alter des Vaters verbunden. </li><li> Die klassische Verknüpfung und Assoziationsstudien konnte ein signifikanter Anteil der Krankheit Erblichkeit zu erklären. </li><li> Die beiden Konkordanz Daten unterstützen eine de novo-Modell. </li></ol> Die Analyse der Wahrscheinlichkeit, dass eine häufige Erkrankung, wo de novo Mutationen zum Teil erklären, kann die genetische Basis ein entscheidender erster Schritt ist. 2. Die Auswahl der Fälle und DNA-Proben Auswahl geeigneter Proben ist entscheidend für den Erfolg der Identifizierung von de novo-Mutationen. Zur Maximierung der Wahrscheinlichkeit des Findens de novo Mutationen, empfehlen wir folgendes: <ol><li> Wählen Fällen mit frühem Erkrankungsalter, schweren Phänotyp, mit gesunden Eltern, ältere Väter und ohne Großfamilie Geschichte der Krankheit. </li><li> Wählen Sie Patienten, deren verfügbar DNAs sind ausreichend, um die Durchführung der Studie. Besonders kritisch ist die Verfügbarkeit von DNA aus einer Primär-Zelle Quelle, die nicht zur Kultivierung unterzogen wurde (z. B. Blut oder Speichel DNA DNA), </li><li> Die Verfügbarkeit beider Eltern DNA ist von entscheidender Bedeutung, um die Mutation Übertragungsstatus (geerbt vs de novo) zu bestimmen. Die Verfügbarkeit von zusätzlichen betroffenen Kohorten und normalen Kontrollen notwendig ist für die genetische Validierungsstudien einmal Kandidatengene identifiziert werden. </li><li> Schätzen Sie die Stichprobengröße auf die Mutationen Rate, die Höhe von Genen untersucht werden und die Schätzung der Anteil der Fälle, die von einer De-novo-Mutation führen kann basieren. </li></ol> 3. Gene Resequenzierung; zwei wichtige Ansätze <ol><li> Hohe Qualität mit geringem Durchsatz-Sequenzierung Dieser Ansatz basiert auf der Kandidatengene Ansätzen. <ol><li> Auswahl der Kandidaten-Gen (e) Wählen Sie den besten Kandidaten-Gene auf einem Scoring-System, das auf 6 wichtigsten Kriterien gebaut beruht. Dann berechnen Sie die Summe, die der Summe aller Punkte zugeschrieben Mit den sechs Kriterien, die in Tabelle 1 aufgeführten entsprach. Siehe Beispiel aus unserem Projekt in Abbildung 1 gewählten und nicht gewählten Gene Verteilung. <img src="/files/ftp_upload/2534/2534table1.jpg" alt="Tabelle 1"/> Tabelle 1. Kriterien für die Kandidaten-Gen Auswahl verwendet <img src="/files/ftp_upload/2534/2534fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Graph zeigt die Verteilung der gewählten und nicht gewählten Gene für die Sequenzierung in unserem Projekt. Wir erhalten eine Verteilung von Genen durch Kandidaten Eigenschaften von Sortier-Gene rangiert nach ihrem Score-Wert. Zum Beispiel hatte SHANK3 und NRXN1 Gene, zwei Gene, die wir gefunden de novo-Mutation, ein Score 7 bzw. 6 (Maximum ist 12). </li><li> Design-Primer mit Primers3 Software durch Exonprimer. Nur kodierende Region und Spleiß-Kreuzung sollte auch eine zusätzliche 50 Basenpaare auf jeder Seite des Exon abgedeckt werden. </li><li> Optimieren PCR-Bedingungen für die Wahl des Taq, Reaktionsvolumen, etc. </li><li> Optimieren Sie alle PCR-Fragmente </li><li> Amplify 5 ng genomischer DNA aus Blutproben nach Standardverfahren extrahiert </li><li> Vor dem Senden für die Sequenzierung, tun Qualitätskontrolle Ihrer PCR-Produkte durch das Laden einer 2% igen Agarosegel. Nach dem Zufallsprinzip ausgewählt Proben. </li><li> Sequence der PCR-Produkte auf einem DNA-Analyzer auf einem Strang. Ein Fragment wird als erfolgreich sequenziert, wenn die Analyse von über 90% der Spuren ist möglich. Dies gilt für eine große angelegte Screening. </li><li> Varianten-Erkennung <ol><li> Verwenden Sie die Werkzeuge für die Detektion und Genotypisierung der genomischen Variationen wie PolyPhred, PolyScan und Mutation Surveyor. Eine Kombination von mehr als 2-Erkennungs-Tools ist ideal. Zum Beispiel, PolyPhred v.5 und PolyPhred v.6 mit den Standardeinstellungen nicht erkennen die gleichen Variationen. PolyScan v.3 hat eine höhere falsch-positive Mutationsrate für SNPs (96%) und weniger für die Indels (93%). PolyPhred v.6 nicht die Mehrheit der wahre Indels erkannt, sondern haben eine falsche positive Mutationsrate (für Indels) niedriger als PolyScan v.3 insgesamt (90%). Wir sollten uns entfernen Sie die Möglichkeit, SNPs Erkennung für PolyScan v.3 und halten beide PolyPhred v.5 und PolyPhred v.6 für Variante Erkennung. Mutation Surveyor und PolyScan sind besser zum Nachweis von indels. Hinweis: Die Option der SNP-Nachweis sollte nicht angewendet werden, wenn mit PolyScan werden. Nur die &quot;indel&quot; Option sollte eingeschaltet sein. PolyScan zu viele falsch positive für SNP-Detektion erzeugt. </li><li> Für jeden eindeutigen Roman exonische Varianten erkannt, bestätigen Sie es manuell durch Reamplifikation des Fragments und resequGeoreferenzierung Probanden und beide Eltern mit Reverse-und Forward-Primer, um technische Artefakte zu eliminieren. </li></ol></li></ol></li><li> Whole Exom Sequenzierung Dieser Ansatz ist ein Hochdurchsatz-Sequenzierung Targeting die Mehrheit der kodierenden Regionen des menschlichen Genoms. Wir sind jetzt gerade mit diesem neuen Ansatz in unserem Labor, die Beschleunigung der Erkennung von potenziellen Kandidaten-Gene. <ol><li> Bestelle das &quot;SureSelect Menschliches Exon&quot; targeting den kodierenden Bereich von über 16.000 Genen (50 MB des Genoms) von Agilent oder andere ähnliche Produkte von anderen wie Roche entwickelt. Vor der Aufnahme-Kit bestellen, sollten die Sequenzier-Plattformen zu bestimmen (Illumina vs SOLiD). </li><li> Haben die Aufnahme nach dem Agilent-Protokoll </li><li> Sequence das Produkt auf dem jeweils verfügbaren Plattform der nächsten Generation </li><li> Variant-Detektion aus der ganzen Exom Sequenzierung: Mehrere Werkzeuge der Bioinformatik für die Detektion und Genotypisierung von genomischer Abweichungen von der nächsten Generation Sequencing-Plattform zur Verfügung, wie BWA, Bfast, Bioscope, die die Ausrichtung durchführen wird. Nach der zusätzliche frei verfügbare Downstream-Tools (z. B. SAM-Tools, Varscan, Annovar) wäre nötig es zu nennen und kommentieren Sie die Varianten werden. Kommerzielle Software, die Sequenz-Alignment und die Variante aufrufen und Annotation integriert sind ebenfalls erhältlich wie NextGEN (Softgenetics), CLC Bio, und andere </li></ol></li></ol> 4. Genomic Varianten Priorisierung Identifizierte Varianten werden dann für eine Nachuntersuchung nach ihrer Wahrscheinlichkeit in sein de novo und schädlich für die Protein-oder mRNA-Funktion und / oder Struktur priorisiert. Die Variante folgen Prioritäten für den Nachweis von de novo-Variante sein sollte wie folgt: <ol><li> Einzigartige Varianten (einmal in einem einzigen Fall beobachtet) </li><li> Variationen nicht bei den Eltern </li><li> Protein-Abschneiden Variationen: Unsinn, indels was zu Frameshift und Spleißen Mutationen. </li><li> Missense und stille Variation vorausgesagt werden funktionell störende (zB Auswirkungen auf mRNA-Spleißen). Verwenden Sie PolyPhen, SIFT und PANTHER für die funktionelle Prognose Wirkung auf das Protein. </li></ol> Wenn Sie ganze Exom Sequenzierung kann die Auswahl von Kandidatengenen als eine Strategie für die Priorisierung von Varianten zur weiteren Untersuchung verwendet werden. 5. Genetische Validierung <ol><li> Resequence das gesamte Gen in weitere Patientenfälle (zu anderen ursächlichen Mutationen zu identifizieren) und bei den Kontrollen. Die Kontrollproben werden verwendet, um Allelfrequenzen von priorisierten Varianten zu bewerten. Jedes Gen enthält mindestens zwei verschiedene de novo schädlichen Mutationen (Unsinn, Spleißen, Rasterverschiebungen und vorhergesagt beschädigen Missense) in verschiedenen Patienten (aber nicht in Kontrollproben oder öffentlichen Datenbanken) gefunden werden sollte hoch für weitere Validierungsstudien priorisiert werden. Dazu gehören: 1) Prüfung für einen möglichen Defekt in Spleißen lymphoblastoiden Zelllinien vom Patienten abgeleitet. Nach unserer Erfahrung ergeben die meisten Gene RT-PCR-Produkte von lymphoblastoiden Zelllinien, 2) zu untersuchen verändertes Protein Expression durch quantitative Western-Blot-Analyse von Protein-Extrakten aus der lymphoblastoiden Zelllinien und 3) weitere Prüfung der Mutation / Gen auf funktionaler Ebene in Tier (c elegans, Zebrafisch) und Zell-Linie Modelle wie zuvor von unserer Gruppe (ex: 5,6) durchgeführt. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Nach diesem Protokoll konnten wir neue Gene für Schizophrenie und Autismus zu identifizieren. Ein Beispiel ist unser kürzlich SHANK3 Entdeckung von Genen (Abbildung 2). Zwei verschiedene de novo Mutationen im Gen SHANK3, eine Nonsense-Mutation in drei betroffenen Bruder und eine Missense-Mutation in einem betroffenen Weibchen gefunden. <img src="/files/ftp_upload/2534/2534fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. (A) Segregation der R1117X Nonsense-Mutation in drei betroffenen Brüdern der Familie PED 419. Der Proband wird durch den Pfeil angedeutet. (B) Segregation der R536W Missense-Mutation in der Proband aber nicht ihre nicht betroffenen Bruder in PED 56.

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	<li>Bassett, A. S., Bury, A., Hodgkinson, K. A., Honer, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+fitness+in+familial+schizophrenia.">Reproductive fitness in familial schizophrenia.</a> Schizophr Res. 21, 151-160 (1996).</li><li>Jablensky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizophrenia:+manifestations,+incidence+and+course+in+different+cultures.+A+World+Health+Organization+ten-country+study.">Schizophrenia: manifestations, incidence and course in different cultures. A World Health Organization ten-country study.</a> Psychol Med Monogr. , 1-97 (1992).</li><li>Malaspina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizophrenia+risk+and+paternal+age:+a+potential+role+for+de+novo+mutations+in+schizophrenia+vulnerability+genes.">Schizophrenia risk and paternal age: a potential role for de novo mutations in schizophrenia vulnerability genes.</a> CNS Spectr. 7, 26-29 (2002).</li><li>DeLisi, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+scan+for+linkage+to+chromosomal+regions+in+382+sibling+pairs+with+schizophrenia+or+schizoaffective+disorder.">A genome-wide scan for linkage to chromosomal regions in 382 sibling pairs with schizophrenia or schizoaffective disorder.</a> Am J Psychiatry. 159, 803-812 (2002).</li><li>Gauthier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+Novo+SHANK3+Mutations+in+Patients+Ascertained+for+Schizophrenia.">De Novo SHANK3 Mutations in Patients Ascertained for Schizophrenia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2010).</li><li>Piton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+calcium-related+gene+IL1RAPL1+are+associated+with+autism.">Mutations in the calcium-related gene IL1RAPL1 are associated with autism.</a> Hum Mol Genet. 17, 3965-3974 (2008).</li><li>Krawczak, M., Ball, E. V., Cooper, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neighboring-nucleotide+effects+on+the+rates+of+germ-line+single-base-pair+substitution+in+human+genes.">Neighboring-nucleotide effects on the rates of germ-line single-base-pair substitution in human genes.</a> Am J Hum Genet. 63, 474-488 (1998).</li></ol>

Das hier beschriebene Verfahren zielt darauf ab, spezifische häufigsten Krankheiten, die wahrscheinliche Ergebnis, zum Teil aus de novo Mutationen, und um diese Hypothese zu beweisen, zu identifizieren. De-novo-Mutationen sind ein gut etabliertes Verfahren für die Entwicklung einer Reihe von Krankheiten, zum Beispiel der erblichen Krebserkrankungen, wurde aber schlecht in Volkskrankheiten untersucht. Dieser Teil ergibt sich aus der technischen Herausforderungen bei der Identifizierung von de novo-Mutationen, die die Sequenzierung von großen Mengen an DNA, die nur erfordert beteiligt sehr kurzem kostengünstig mit dem Aufkommen von Next Generation Sequencing. Darüber hinaus wurde die de novo Mutationsrate beim Menschen, bis vor kurzem nur eine Schätzung. Erst in jüngster Zeit gab es Berichte über die direkte Bestimmung der Mutationsrate beim Menschen. Vor diesen Messungen war es schwierig, die Stichprobengröße für diese Art von Studie erforderlich vorherzusagen und zu bestimmen, ob die beobachteten de novo Mutationsrate höher ist als der Ausgangswert Rate. Sequencing Kandidatengene gegenüber gesamte Genom? Da die Mehrheit der gemeldeten Erkrankungen Mutationen sind Missense / Nonsense-Mutationen und Spleißstelle Mutationen (nach HGMD Website) unserer Screening-Strategie über 68% der bekannten Mutationen zu identifizieren wäre. Es gibt auch eine klare Beziehung zwischen der Schwere der Aminosäureaustausch und die Wahrscheinlichkeit einer klinischen Phänotyp. Wie bei einem konservativen Aminosäureaustausch gegenüber, ist ein Unsinn ändern 9,0 mal häufiger an klinisch derzeit 7. So, in dieser Zeit Sequenzierung Kandidatengene ist die kostengünstigste Strategie. Der Erfolg der beschriebenen Vorgehensweise hängt von mehreren wichtigen Schritte, die im Detail beschrieben werden, und illustriert anhand von zwei Beispielen, Autismus und Schizophrenie. Es gibt viele Fallstricke, die vermieden werden müssen, wie die Krankheit zu wählen, welche Patienten auf dem Bildschirm, Quelle der DNA, und erfahren, wie Sie effizient identifizieren die de novo-Mutationen. Wir stellen eine Methode für die meisten effizient bestimmen den Anteil der Fälle einer Krankheit, die aus solchen spontanen Mutationen Ergebnisse.

a strategy to identify de novo mutations in common disorders such as autism and schizophrenia

Es gibt mehrere Linien der Nachweise für die Rolle von de novo-Mutationen als Mechanismus für die häufigsten Erkrankungen wie Autismus und Schizophrenie. Erstens, die de novo Mutationsrate beim Menschen relativ hoch ist, so neue Mutationen mit hoher Frequenz in der Bevölkerung erzeugt werden. Allerdings haben de novo Mutationen nicht in häufigsten Erkrankungen gemeldet worden. Mutationen in Genen, die zu schweren Erkrankungen, bei denen es eine starke negative Selektion gegen den Phänotyp, wie Letalität in embryonalen Stadien oder reduzierte reproduktive Fitness, nicht auf mehrere Familienmitglieder übertragen werden, und wird daher nicht durch Verknüpfung Genkartierung oder Vereinigung nachgewiesen werden Studien. Die Beobachtung von sehr hohen Konkordanz bei eineiigen Zwillingen und eine sehr geringe Übereinstimmung in zweieiige Zwillinge auch stark unterstützt die Hypothese, dass ein erheblicher Anteil der Fälle können von neuen genetischen Mutationen führen. Dies ist der Fall für Krankheiten wie Autismus und Schizophrenie. Zweitens: Trotz der reduzierten reproduktive Fitness 1 und äußerst variable Umweltfaktoren, ist die Inzidenz einiger Krankheiten weltweit aufrecht erhalten auf einem relativ hohen und konstanten Rate. Dies ist der Fall für Autismus und Schizophrenie, die mit einer Häufigkeit von ca. 1% weltweit. Mutational Belastung kann als ein Gleichgewicht zwischen Auswahl für oder gegen eine schädliche Mutation und seine Produktion von de novo Mutation gedacht werden. Niedrigere Reproduktion stellen eine negative Selektion Faktor, der die Anzahl der mutierten Allele in der Bevölkerung sollte zu reduzieren, was letztlich zu einer verminderten Prävalenz der Krankheit. Diese selektiven Druck neigen dazu, von unterschiedlicher Intensität in verschiedenen Umgebungen werden. Dennoch haben diese schweren psychischen Störungen bei einer konstanten relativ hohe Prävalenz in der Bevölkerung weltweit in einem breiten Spektrum von Kulturen und Ländern trotz einer starken negativen Selektion gegen sie 2 beibehalten. Dies ist nicht das, was man bei Krankheiten mit verminderter Fortpflanzungsfähigkeit vorherzusagen, es sei denn, es gab eine hohe neuen Mutationsrate. Schließlich die Auswirkungen der väterlichen Alter: Gibt es ein signifikant erhöhtes Risiko der Erkrankung mit zunehmendem Alter des Vaters, die aus der altersbedingte Anstieg der väterlichen de novo-Mutationen führen kann. Dies ist der Fall für Autismus und Schizophrenie 3. Die Mann-zu-Frau-Verhältnis von Mutationsrate bei etwa 4-6:1 geschätzt, was vermutlich auf eine höhere Anzahl von Keimzellen Divisionen mit zunehmendem Alter bei Männern. Daher würde man erwarten, dass de novo Mutationen würden häufiger von Männern, insbesondere älteren Männchen 4 kommen. Eine hohe Rate neuer Mutationen können zum Teil erklären, warum genetische Studien bisher nicht gelungen, viele Gene prädisponieren Komplexe Krankheiten Gene, wie Autismus und Schizophrenie zu identifizieren, und warum Krankheiten haben nur 3% der Gene im menschlichen Genom identifiziert . Kennzeichnung für de novo-Mutationen als Ursache einer Krankheit erfordert eine gezielte molekulare Ansatz, der studierenden Eltern und betroffenen Personen umfasst. Das Verfahren zur Bestimmung, ob die genetische Grundlage von Krankheiten zum Teil aus de novo-Mutationen und der molekularen Ansatz für diese Beziehung herzustellen dargestellt wird, werden mit Autismus und Schizophrenie als Beispiele führen kann.

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A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

Molekulargenetische Strategie für die Suche nach de novo Mutationen häufigsten Erkrankungen wie Autismus und Schizophrenie.

Eine Strategie, um de novo Mutationen in Common Störungen wie Autismus und Schizophrenie Identifizieren

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

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Serie: A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We have established bilateral common carotid artery occlusion as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance to transient focal cerebral ischemia in C57Bl6/J mice. In this video, we will demonstrate the methodology used for this study.

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning (PC) &#x2013; a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We established bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO) as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance (IT) to transient focal cerebral ischemia (induced by middle cerebral artery occlusion, MCAO) in C57Bl6/J mice.

Bilaterale Arteria carotis communis Occlusion als adäquate Vorbehandlung Stimulus zu frühe ischämische Toleranz zu Focal zerebraler Ischämie induzieren

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a ...

Forschung

Medizin

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for personalized medicine after stratification, explaining the current interest in developing a reproducible and low-cost xenotransplant model for this disease. The chick chorioallantoic membrane is a natural immunodeficient host capable of sustaining grafted tissues and cells without species-specific restrictions. In addition, it is easily accessed, manipulated and imaged using optical and fluorescence stereomicroscopy. Histology further allows detailed analysis of heterotypic cellular interactions.
This protocol describes in detail the in ovo grafting of the chorioallantoic membrane with fresh sarcoma-derived tumor tissues, their single cell suspensions, and permanent and transient fluorescently labeled established sarcoma cell lines (Saos-2 and SW1353). The chick survival rates are up to 75%. The model is used to study graft- (viability, Ki67 proliferation index, necrosis, infiltration) and host (fibroblast infiltration, vascular ingrowth) behavior. For localized grafting of single cell suspensions, ECM gel provides significant advantages over inert containment materials. The Ki67 proliferation index is related to the distance of the cells from the surface of the CAM and the duration of application on the CAM, the latter determining a time frame for the addition of therapeutic products.

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

The in ovo chorioallantoic membrane (CAM) is grafted with fresh sarcoma-derived tumor tissues, their single cell suspensions, and permanent and transient fluorescently labeled established sarcoma cell lines. The model is used to study graft- (viability, Ki67 proliferation index, necrosis, infiltration) and host (fibroblast infiltration, vascular ingrowth) behavior.

Die<em&gt; In ovo</em&gt; CAM-Assay als Xenograftmodel für Sarkom

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for ...

Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties of the smooth muscle as well as changes induced by pathology. This method provides critical information for understanding bladder function while overcoming major methodological difficulties encountered in in vivo experiments, such as surgical and pharmacological manipulations that affect stability and survival of the preparations, the use of human tissue, and/or the use of expensive chemicals. It also provides a way to investigate the properties of each bladder component (i.e. smooth muscle, mucosa, nerves) in healthy and pathological conditions.
The urinary bladder is removed from an anesthetized animal, placed in Krebs solution and cut into strips. Strips are placed into a chamber filled with warm Krebs solution. One end is attached to an isometric tension transducer to measure contraction force, the other end is attached to a fixed rod. Tissue is stimulated by directly adding compounds to the bath or by electric field stimulation electrodes that activate nerves, similar to triggering bladder contractions in vivo. We demonstrate the use of this method to evaluate spontaneous smooth muscle contractility during development and after an experimental spinal cord injury, the nature of neurotransmission (transmitters and receptors involved), factors involved in modulation of smooth muscle activity, the role of individual bladder components, and species and organ differences in response to pharmacological agents. Additionally, it could be used for investigating intracellular pathways involved in contraction and/or relaxation of the smooth muscle, drug structure-activity relationships and evaluation of transmitter release.
The in vitro smooth muscle contractility method has been used extensively for over 50 years, and has provided data that significantly contributed to our understanding of bladder function as well as to pharmaceutical development of compounds currently used clinically for bladder management.

This manuscript presents a simple, yet powerful, in vitro method for evaluating smooth muscle contractility in response to pharmacological agents or nerve stimulation. Main applications are drug screening and understanding tissue physiology, pharmacology,&#160;and pathology.

Glatten Muskulatur der Blase Streifen Kontraktilität als eine Methode zur unteren Harnwege Pharmakologie Bewerten

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties ...

Fundus Photography as a Convenient Tool to Study Microvascular Responses to Cardiovascular Disease Risk Factors in Epidemiological Studies

The microcirculation consists of blood vessels with diameters less than 150 &#181;m. It makes up a large part of the circulatory system and plays an important role in maintaining cardiovascular health. The retina is a tissue that lines the interior of the eye and it is the only tissue that allows for a non-invasive analysis of the microvasculature. Nowadays, high-quality fundus images can be acquired using digital cameras. Retinal images can be collected in 5 min or less, even without dilatation of the pupils. This unobtrusive and fast procedure for visualizing the microcirculation is attractive to apply in epidemiological studies and to monitor cardiovascular health from early age up to old age.
Systemic diseases that affect the circulation can result in progressive morphological changes in the retinal vasculature. For example, changes in the vessel calibers of retinal arteries and veins have been associated with hypertension, atherosclerosis, and increased risk of stroke and myocardial infarction. The vessel widths are derived using image analysis software and the width of the six largest arteries and veins are summarized in the Central Retinal Arteriolar Equivalent (CRAE) and the Central Retinal Venular Equivalent (CRVE). The latter features have been shown useful to study the impact of modifiable lifestyle and environmental cardiovascular disease risk factors.
The procedures to acquire fundus images and the analysis steps to obtain CRAE and CRVE are described. Coefficients of variation of repeated measures of CRAE and CRVE are less than 2% and within-rater reliability is very high. Using a panel study, the rapid response of the retinal vessel calibers to short-term changes in particulate air pollution, a known risk factor for cardiovascular mortality and morbidity, is reported. In conclusion, retinal imaging is proposed as a convenient and instrumental tool for epidemiological studies to study microvascular responses to cardiovascular disease risk factors.

Retinal image analysis is an unobtrusive procedure for visualizing the microcirculation. The impact of cardiovascular disease risk factors can result in changes of retinal vessel calibers. The procedures to acquire fundus images and the steps for calculating the vessel calibers are described.

Fundusfotografie als geeignetes Mittel, um mikrovaskuläre Antworten zu Herz-Kreislauf-Erkrankungen Risikofaktoren in epidemiologischen Studien Studieren

The microcirculation consists of blood vessels with diameters less than 150 &#181;m. It makes up a large part of the circulatory system and plays an ...

Sublingual Immunotherapy as an Alternative to Induce Protection Against Acute Respiratory Infections

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been shown to effectively induce humoral and cellular responses at systemic and mucosal sites, namely the lungs and urogenital tract. Sublingual vaccination can promote protection against infections at the lower and upper respiratory tract; it can also promote tolerance to allergens and ameliorate asthma symptoms. Modulation of lung&#8217;s immune response by sublingual immunotherapy (SLIT) is safer than direct administration of formulations by intranasal route because it does not require delivery of potentially harmful molecules directly into the airways. In contrast to intranasal delivery, side effects involving brain toxicity or facial paralysis are not promoted by SLIT. The immune mechanisms underlying SLIT remain elusive and its use for the treatment of acute lung infections has not yet been explored. Thus, development of appropriate animal models of SLIT is needed to further explore its potential advantages. 
This work shows how to perform sublingual administration of therapeutic agents in mice to evaluate their ability to protect against acute pneumococcal pneumonia. Technical aspects of mouse handling during sublingual inoculation, precise identification of sublingual mucosa, draining lymph nodes and isolation of tissues, bronchoalveolar lavage and lungs are illustrated. Protocols for single cell suspension preparation for FACS analysis are described in detail. Other downstream applications for the analysis of the immune response are discussed. Technical aspects of the preparation of Streptococcus pneumoniae inoculum and intranasal challenge of mice are also explained.
SLIT is a simple technique that allows screening of candidate molecules to modulate lungs&#8217; immune response. Parameters affecting the success of SLIT are related to molecular size, susceptibility to degradation and stability of highly concentrated formulations.

The present work illustrates the convenience of using sublingual immunotherapy to boost the innate immune response in the lungs and confer protection against acute pneumococcal pneumonia in mouse.

Sublinguale Immuntherapie als Alternative zum Schutz vor akuten Atemwegsinfektionen ausgelöst werden

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been ...

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes (ILM), and in conjunction with astrocytes, pericytes and endothelial cells they establish the blood-retinal barrier (BRB). BRB limits material transport between the bloodstream and the retina while the ILM acts as a basement membrane that defines histologically the border between the retina and the vitreous cavity. Labeling M&#252;ller cells is particularly relevant to study the physical state of the retinal barriers, as these cells are an integral part of the BRB and ILM. Both BRB and ILM are frequently altered in retinal disease and are responsible for disease symptoms.
There are several well-established methods to study the integrity of the BRB, such as the Evans blue assay or fluorescein angiography. However these methods do not provide information on the extent of BRB permeability to larger molecules, in nanometer range. Furthermore, they do not provide information on the state of other retinal barriers such as the ILM. To study BRB permeability alongside retinal ILM, we used an AAV based method that provides information on permeability of BRB to larger molecules while indicating the state of the ILM and extracellular matrix proteins in disease states. Two AAV variants are useful for such study: AAV5 and ShH10. AAV5&#160;has a natural tropism for photoreceptors but it cannot get across to the outer retina when administered into the vitreous when the ILM is intact (i.e., in wild-type retinas). ShH10 has a strong tropism towards glial cells and will selectively label M&#252;ller glia in both healthy and diseased retinas. ShH10 provides more efficient gene delivery in retinas where ILM is compromised. These viral tools coupled with immunohistochemistry and blood-DNA analysis shed light onto the state of retinal barriers in disease.

To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

Verwendung Adeno-assoziierte Virus als Werkzeug Retinal Barrieren in Disease Study

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide new expandable sources of beta cells to alleviate the donor scarcity in human islet transplantation as therapy for diabetes. Although recent advances have been made towards this aim, mechanisms that regulate beta cell expansion and differentiation from a stem/progenitor cell remain to be characterized. Here, we describe a protocol for an injury model in the adult mouse pancreas that can function as a tool to study mechanisms of tissue remodeling and beta cell proliferation and differentiation. Partial duct ligation (PDL) is an experimentally induced injury of the rodent pancreas involving surgical ligation of the main pancreatic duct resulting in an obstruction of drainage of exocrine products out of the tail region of the pancreas. The inflicted damage induces acinar atrophy, immune cell infiltration and severe tissue remodeling. We have previously reported the activation of Neurogenin (Ngn) 3 expressing endogenous progenitor-like cells and an increase in beta cell proliferation after PDL. Therefore, PDL provides a basis to study signals involved in beta cell dynamics and the properties of an endocrine progenitor in adult pancreas. Since, it still remains largely unclear, which factors and pathways contribute to beta cell neogenesis and proliferation in PDL, a standardized protocol for PDL will allow for comparison across laboratories.

This protocol describes an injury model involving the surgical ligation of the pancreatic duct in the adult mouse pancreas, resulting in severe injury that establishes an environment that allows beta cell neogenesis and proliferation. This model can be used as a tool to study mechanisms involved in beta cell formation.

Chirurgische Verletzung des Maus-Pankreas durch Ligatur des Pankreasganges als Modell für endokrine und exokrine Reprogrammierung und Proliferation

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide ...

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves focal endothelial-selective transgenesis, thereby allowing an investigator to determine the biological roles of endothelial-expressed transgenes and to quantify the in vivo transcriptional activity of DNA sequences in large artery endothelial cells. The method uses surgical isolation of rabbit common carotid arteries and an arteriotomy to deliver a transgene-expressing viral vector into the arterial lumen. A short incubation period of the vector in the lumen, with subsequent aspiration of the lumen contents, is sufficient to achieve efficient and durable expression of the transgene in the endothelium, with no detectable transduction or expression outside of the isolated arterial segment. The method allows assessment of the biological activities of transgene products both in normal arteries and in models of human vascular disease, while avoiding systemic effects that could be caused either by targeting gene delivery to other sites (e.g. the liver) or by the alternative approach of delivering genetic constructs to the endothelium by germ line transgenesis. Application of the method is limited by the need for a skilled surgeon and anesthetist, a well-equipped operating room, the costs of purchasing and housing rabbits, and the need for expertise in gene-transfer vector construction and use. Results obtained with this method include: transgene-related alterations in arterial structure, cellularity, extracellular matrix, or vasomotor function; increases or reductions in arterial inflammation; alterations in vascular cell apoptosis; and progression, retardation, or regression of diseases such as intimal hyperplasia or atherosclerosis. The method also allows measurement of the ability of native and synthetic DNA regulatory sequences to alter transgene expression in endothelial cells, providing results that include: levels of transgene mRNA, levels of transgene protein, and levels of transgene enzymatic activity.

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

This method is to introduce a transgene into the endothelium of rabbit carotid arteries. Introduction of the transgene allows the assessment of the biological role of the transgene product either in normal arteries or disease models. The method is also useful for measuring activity of DNA regulatory sequences.

In Vivo Gentransfer in die Kaninchen gemeinsame Halsschlagader Endothel

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves ...

An Experimental Model of Diet-Induced Metabolic Syndrome in Rabbit: Methodological Considerations, Development, and Assessment

In recent years, obesity and metabolic syndrome (MetS) have become a growing problem for public health and clinical practice, given their increased prevalence due to the rise of sedentary lifestyles and unhealthy eating habits. Thanks to animal models, basic research can investigate the mechanisms underlying pathological processes such as MetS. Here, we describe the methods used to develop an experimental rabbit model of diet-induced MetS and its assessment. After a period of acclimation, animals are fed a high-fat (10% hydrogenated coconut oil and 5% lard), high-sucrose (15% sucrose dissolved in water) diet for 28 weeks. During this period, several experimental procedures were performed to evaluate the different components of MetS: morphological and blood pressure measurements, glucose tolerance determination, and the analysis of several plasma markers. At the end of the experimental period, animals developed central obesity, mild hypertension, pre-diabetes, and dyslipidemia with low HDL, high LDL, and an increase of triglyceride (TG) levels, thus reproducing the main components of human MetS. This chronic model allows new perspectives for understanding the underlying mechanisms in the progression of the disease, the detection of preclinical and clinical markers that allow the identification of patients at risk, or even the testing of new therapeutic approaches for the treatment of this complex pathology.

We describe methods to develop an experimental model of diet-induced metabolic syndrome (MetS) in rabbits using a high-fat, high-sucrose diet. Animals developed central obesity, mild hypertension, pre-diabetes, and dyslipidemia, thus reproducing the main components of human MetS. This chronic model will allow acquisition of knowledge underlying mechanisms of disease progression.

Ein experimentelles Modell der Diät-induzierten metabolischen Syndroms in der Kaninchen: methodische Überlegungen, Entwicklung und Bewertung

In recent years, obesity and metabolic syndrome (MetS) have become a growing problem for public health and clinical practice, given their increased ...

A Rabbit Model of Durable Transgene Expression in Jugular Vein to Common Carotid Artery Interposition Grafts

Vein graft bypass surgery is a common treatment for occlusive arterial disease; however, long-term success is limited by graft failure due to thrombosis, intimal hyperplasia, and atherosclerosis. The goal of this article is to demonstrate a method for placing bilateral venous interposition grafts in a rabbit, then transducing the grafts with a gene transfer vector that achieves durable transgene expression. The method allows the investigation of the biological roles of genes and their protein products in normal vein graft homeostasis. It also allows the testing of transgenes for the activities that could prevent vein graft failure, e.g., whether the expression of a transgene prevents the neointimal growth, reduces the vascular inflammation, or reduces atherosclerosis in rabbits fed with a high-fat diet. During an initial survival surgery, the segments of right and left external jugular vein are excised and placed bilaterally as reversed end-to-side common carotid artery interposition grafts. During a second survival surgery, performed 28 days later, each of the grafts is isolated from the circulation with vascular clips and the lumens are filled (via an arteriotomy) with a solution containing a helper-dependent adenoviral (HDAd) vector. After a 20-min incubation, the vector solution is aspirated, the arteriotomy is repaired, and flow is restored. The veins are harvested at time points dictated by individual experimental protocols. The 28-day delay between the graft placement and the transduction is necessary to ensure the adaptation of the vein graft to the arterial circulation. This adaptation avoids rapid loss of transgene expression that occurs in vein grafts transduced before or immediately after grafting. The method is unique in its ability to achieve durable, stable transgene expression in grafted veins. Compared to other large animal vein graft models, rabbits have advantages of low cost and easy handling. Compared to rodent vein graft models, rabbits have larger and easier-to-manipulate blood vessels that provide abundant tissue for analysis.

This method describes the placement of interposition vein grafts in rabbits, the transduction of the grafts, and the achievement of durable transgene expression. This allows the investigation of physiological and pathological roles of transgenes and their protein products in grafted veins, and testing of gene therapies for vein graft disease.

Ein Kaninchen-Modell der dauerhafte Transgene Ausdruck in Halsschlagader, gemeinsame Halsschlagader Interposition Grafts

Vein graft bypass surgery is a common treatment for occlusive arterial disease; however, long-term success is limited by graft failure due to thrombosis, ...