Nós, graças a nossa fontes de financiamento do Genoma Canadá e Genoma Québec, e Université de Montréal, bem como financiamento da Fundação Canadense para Inovação para financiamento nossa &quot;Synapse à doença&quot; do projeto (S2D).

1. Seleção de doença que pode ser causada por mutações de novo Uma doença que corresponde aos seguintes critérios podem se encaixar com a hipótese de mutação de novo: <ol><li> A aptidão reprodutiva é reduzida. </li><li> A freqüência da doença é relativamente alta e constante, apesar amplamente variados ambientes. </li><li> A doença é associada a um maior idade paterna. </li><li> A ligação clássico e estudos de associação não conseguiu explicar uma fração significativa da hereditariedade da doença. </li><li> Os dados com gêmeos de apoiar um modelo novo. </li></ol> Análise da probabilidade de que uma doença comum, onde as mutações de novo pode em parte explicar a base genética é um primeiro passo crítico. 2. Seleção de casos e amostras de DNA Seleção de amostras adequadas é fundamental para o sucesso da identificação de mutações de novo. Para maximizar a chance de encontrar mutações de novo, nós recomendamos o seguinte: <ol><li> Selecionar os casos com idade precoce de início fenótipo, grave, com pais não afetados, pais mais velhos e sem história familiar da doença prolongada. </li><li> Escolha pacientes cujos DNAs disponíveis são suficientes para conduzir o estudo. Especialmente crítico é a disponibilidade de DNA a partir de uma fonte de células primárias que não foi submetido a cultura (por exemplo, DNA de sangue ou saliva DNA), </li><li> A disponibilidade de ambos os pais DNA é fundamental para determinar o status de transmissão mutação (vs herdou de novo). Disponibilidade de novos grupos afetados e controles normais é necessário para os estudos de validação genética uma vez que genes candidatos são identificados. </li><li> Estimar o tamanho da amostra com base na taxa de mutações, a quantidade de genes para ser exibido ea estimativa da fração de casos que podem resultar de uma mutação de novo. </li></ol> 3. Gene resequencing; duas abordagens principais <ol><li> Alta qualidade seqüenciamento baixa taxa de transferência Esta abordagem é baseada em genes as abordagens candidato. <ol><li> Seleção de genes candidatos (s) Selecionar o melhor candidato genes com base em um sistema de pontuação que é construído em 6 critérios principais. Em seguida, calcular o total que correspondia à soma de todos os pontos atribuídos usando os seis critérios relacionados na Tabela 1. Veja o exemplo do nosso projeto na figura 1 do selecionado e não selecionado distribuição genes. <img src="/files/ftp_upload/2534/2534table1.jpg" alt="Tabela 1"/> Tabela 1. Critérios utilizados para a seleção de genes candidatos <img src="/files/ftp_upload/2534/2534fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Gráfico mostrando a distribuição dos genes selecionados e não selecionados para o seqüenciamento em nosso projeto. Obtivemos uma distribuição de genes classificados por propriedades candidato por genes de classificação de acordo com seu valor de pontuação. Por exemplo, SHANK3 e NRXN1 genes, dois genes que encontramos mutação de novo, teve uma pontuação de 7 e 6 respectivamente (o máximo é 12). </li><li> Primers projeto usando software Primers3 através Exonprimer. Apenas codificação região e junção de emenda devem ser cobertos, incluindo um extra de 50 pares de base em cada lado do exon. </li><li> Condições de otimizar o PCR para a escolha de Taq, volume de reação, etc </li><li> Otimizar todos os fragmentos de PCR </li><li> Amplificar 5 ng de DNA genômico extraído de amostras de sangue de acordo com procedimentos padrão </li><li> Antes de enviar para o seqüenciamento, fazer controle de qualidade de seus produtos PCR carregando um gel de agarose 2%. Selecionados aleatoriamente amostras. </li><li> A seqüência de produtos de PCR em um analisador de DNA em uma fita. Um fragmento é considerado sucesso seqüenciado se a análise de mais de 90% dos traços é possível. Isto é aplicável para uma exibição em grande escala. </li><li> Detecção de variantes <ol><li> Use ferramentas para detecção e genotipagem das variações genômicas, tais como PolyPhred, Polyscan Surveyor e Mutação. Uma combinação de mais de 2 ferramentas de detecção é o ideal. Por exemplo, PolyPhred v.5 e v.6 PolyPhred com as configurações padrão não detectam as mesmas variações. Polyscan v.3 tem uma taxa de mutação mais elevada de falsos positivos de SNPs (96%) e menos para o indels (93%). PolyPhred v.6 não detectou a maioria das indels verdade, mas tem uma taxa de mutação de falsos positivos (para indels) inferior Polyscan total v.3 (90%). Devemos remover a opção de detecção de SNPs Polyscan v.3 e manter os dois PolyPhred v.5 e v.6 PolyPhred para a detecção da variante. Surveyor mutação e Polyscan são melhores para detectar indels. Nota: A opção de detecção de SNP não deve ser aplicado quando se utiliza Polyscan. Apenas o &quot;INDEL&quot; opção deve estar ligado. Polyscan gerado a muitos falsos positivos para a detecção de SNP. </li><li> Para cada variantes exônico único romance detectado, confirmá-la manualmente por reamplifying fragmento e resequúnicos que experimentam o probando e ambos os pais usando primers reverse e encaminhar para eliminar qualquer artefato técnico. </li></ol></li></ol></li><li> Todo exome seqüenciamento Esta abordagem é um seqüenciamento de alto rendimento visando a maioria das regiões codificantes do genoma humano. Estamos agora a utilizar esta nova abordagem no nosso laboratório, acelerando a detecção de genes candidatos em potencial. <ol><li> Fim do &quot;SureSelect Exon Todos os Humanos&quot; alvo a região de codificação de mais de 16 mil genes (50 MB do genoma) desenhado por Agilent ou qualquer outro produto similar por outros como Roche. Antes de encomendar o kit de captura, as plataformas de seqüenciamento deve ser determinar (Illumina vs sólido). </li><li> Fazer a captura de acordo com o protocolo Agilent </li><li> Seqüência o produto em sua respectiva plataforma da próxima geração disponível </li><li> Detecção de variantes a partir do seqüenciamento exome todo: Várias ferramentas de bioinformática para detecção e genotipagem das variações genômicas a partir da plataforma de sequenciamento de última geração estão disponíveis, tais como BWA, Bfast, Bioscope que irão realizar as alinhamento. Após o qual livremente disponíveis ferramentas adicionais a jusante (por exemplo SAM ferramentas, Varscan, Annovar) seriam necessárias para chamar e anotar as variantes. Software comercial que integra o alinhamento de seqüência e chamando variante e anotação também estão disponíveis, tais como, NextGen (Softgenetics), Bio CLC, e outros </li></ol></li></ol> 4. Priorização de variantes genômicas Variantes identificadas são então priorizados para acompanhamento de acordo com sua probabilidade de ser de novo e deletério à proteína ou mRNA função e / ou estrutura. A variante de acompanhamento para a detecção de prioridades de novo variante deve ser como segue: <ol><li> Variações exclusivas (observado uma vez em um único caso) </li><li> Variações não está presente nos pais </li><li> Proteína-truncando variações: nonsense, frameshift indels levando a mutações e emendas. </li><li> Variação missense e silencioso previsto para ser funcionalmente perturbador (por exemplo, afetam splicing do mRNA). Use SIFT Polyphen e PANTHER para efeito de previsão funcionais na proteína. </li></ol> Se estiver usando seqüenciamento exome todo, a seleção de genes candidatos pode ser usado como uma estratégia para priorizar variantes para estudos adicionais. 5. Validação genética <ol><li> Resequence o gene inteiro em casos de pacientes adicionais (para identificar outras mutações causais) e nos controles. As amostras de controle serão utilizados para avaliar as freqüências alélicas das variantes priorizados. Qualquer gene que contém pelo menos duas diferentes mutações de novo deletérios (splicing nonsense, quadro de leitura, e previu missense prejudiciais) encontrada em pacientes diferentes (mas não em amostras de controlo ou de bases de dados públicas) deve ser altamente priorizadas para estudos de validação adicional. Isto inclui: um teste) para um defeito de splicing potencial em linhagens de células linfoblastóides derivado do paciente. Em nossa experiência, a maioria dos genes rendimento RT-PCR produtos de linhas celulares linfoblastóides, 2) investigar o nível de expressão alterada de proteínas através da análise quantitativa blot ocidental de extratos protéicos das linhas de células linfoblastóides e 3) ensaio da mutação / gene ao nível funcional em animal (c elegans, Zebrafish) e modelos de celulares de linha como feito anteriormente por nosso grupo (ex: 5,6). </li></ol> 6. Resultados representativos: Na sequência deste protocolo, que foram capazes de identificar novos genes para a esquizofrenia e autismo. Um exemplo é a nossa descoberta do gene recentemente SHANK3 (Figura 2). Duas diferentes mutações de novo no gene SHANK3, uma mutação nonsense encontradas em três irmão afetado e uma mutação missense em uma fêmea afetada. <img src="/files/ftp_upload/2534/2534fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. (A) A segregação da mutação nonsense R1117X em três irmãos afetados da família PED 419. O probando é indicado pela seta. (B) segregação da mutação missense R536W no probando, mas não seu irmão não afetado no PED 56.

<ol>
	<li>Bassett, A. S., Bury, A., Hodgkinson, K. A., Honer, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+fitness+in+familial+schizophrenia.">Reproductive fitness in familial schizophrenia.</a> Schizophr Res. 21, 151-160 (1996).</li><li>Jablensky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizophrenia:+manifestations,+incidence+and+course+in+different+cultures.+A+World+Health+Organization+ten-country+study.">Schizophrenia: manifestations, incidence and course in different cultures. A World Health Organization ten-country study.</a> Psychol Med Monogr. , 1-97 (1992).</li><li>Malaspina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizophrenia+risk+and+paternal+age:+a+potential+role+for+de+novo+mutations+in+schizophrenia+vulnerability+genes.">Schizophrenia risk and paternal age: a potential role for de novo mutations in schizophrenia vulnerability genes.</a> CNS Spectr. 7, 26-29 (2002).</li><li>DeLisi, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+scan+for+linkage+to+chromosomal+regions+in+382+sibling+pairs+with+schizophrenia+or+schizoaffective+disorder.">A genome-wide scan for linkage to chromosomal regions in 382 sibling pairs with schizophrenia or schizoaffective disorder.</a> Am J Psychiatry. 159, 803-812 (2002).</li><li>Gauthier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+Novo+SHANK3+Mutations+in+Patients+Ascertained+for+Schizophrenia.">De Novo SHANK3 Mutations in Patients Ascertained for Schizophrenia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2010).</li><li>Piton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+calcium-related+gene+IL1RAPL1+are+associated+with+autism.">Mutations in the calcium-related gene IL1RAPL1 are associated with autism.</a> Hum Mol Genet. 17, 3965-3974 (2008).</li><li>Krawczak, M., Ball, E. V., Cooper, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neighboring-nucleotide+effects+on+the+rates+of+germ-line+single-base-pair+substitution+in+human+genes.">Neighboring-nucleotide effects on the rates of germ-line single-base-pair substitution in human genes.</a> Am J Hum Genet. 63, 474-488 (1998).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O procedimento descrito aqui tem como objetivo identificar certas doenças comuns que resultam provavelmente, em parte, a partir de mutações de novo, e para provar esta hipótese. Mutações de novo são um mecanismo bem estabelecido para o desenvolvimento de uma série de doenças, por exemplo, as síndromes de câncer hereditário, mas tem sido pouco explorado em doenças comuns. Isto em parte os resultados dos desafios técnicos envolvidos na identificação de mutações de novo, o que exige o seqüenciamento de grandes quantidades de DNA, que só muito recentemente se tornou rentável, com o advento do seqüenciamento da próxima geração. Além disso, a taxa de mutação de novo em humanos foi, até muito recentemente, apenas uma estimativa. Só muito recentemente tem havido relatórios diretamente determinar a taxa de mutação nos humanos. Antes dessas medidas, era difícil prever o tamanho da amostra necessário para este tipo de estudo e para determinar se a taxa de mutação observada de novo é maior do que a taxa de referência. Seqüenciamento de genes candidatos em relação genoma inteiro? Como a maioria das mutações de doenças relatadas são missense / nonsense e mutações são mutações splice site (de acordo com o site HGMD) nossa estratégia de triagem identificaria mais de 68% das mutações conhecidas. Há também uma clara relação entre a gravidade da substituição de aminoácidos e da probabilidade de um fenótipo clínico. Em comparação com uma substituição do ácido amino conservador, uma mudança absurdo é 9,0 vezes mais propensos a apresentar-se clinicamente 7. Assim, neste momento genes candidatos seqüenciamento é a estratégia mais rentável. O sucesso do procedimento descrito depende de vários passos críticos, que são descritos em detalhes e ilustrados usando dois exemplos, o autismo ea esquizofrenia. Existem muitas armadilhas que devem ser evitadas, como qual a doença para selecionar, o que os pacientes a fonte de tela, de DNA, e os detalhes de como eficiência na identificação de mutações de novo. Nós fornecemos um método para determinar de forma mais eficiente a fração de casos de qualquer doença que resulta de tais mutações espontâneas.

a strategy to identify de novo mutations in common disorders such as autism and schizophrenia

Existem várias linhas de evidência apoiando o papel de mutações de novo como um mecanismo para doenças comuns, tais como autismo e esquizofrenia. Primeiro, a taxa de mutação de novo em seres humanos é relativamente alto, assim que novas mutações são gerados em alta freqüência na população. No entanto, mutações de novo não foram relatados na maioria das doenças comuns. Mutações em genes, levando a doenças graves, onde há uma forte seleção negativa contra o fenótipo, como letalidade em estágios embrionários ou aptidão reprodutiva reduzida, não será transmitido para vários membros da família e, portanto, não serão detectados pelo mapeamento genético de ligação ou associação estudos. A observação de concordância muito alta em gêmeos monozigóticos e concordância muito baixo em gêmeos dizigóticos também apoia fortemente a hipótese de que uma fração significativa dos casos pode resultar de novas mutações. Tal é o caso de doenças como autismo e esquizofrenia. Em segundo lugar, apesar de reduzida aptidão reprodutiva 1 e extremamente variável fatores ambientais, a incidência de algumas doenças é mantida em todo o mundo a uma taxa relativamente alta e constante. Este é o caso para o autismo e esquizofrenia, com uma incidência de aproximadamente 1% em todo o mundo. Carga mutacional pode ser pensado como um equilíbrio entre a seleção a favor ou contra uma mutação deletéria e sua produção por mutação de novo. Menores taxas de reprodução constituir um fator de seleção negativa que deve reduzir o número de alelos mutantes na população, levando a prevalência da doença diminuiu. Estas pressões seletivas tendem a ser de diferente intensidade em diferentes ambientes. No entanto, esses transtornos mentais graves têm sido mantidos em uma prevalência relativamente alta constante da população em todo o mundo através de uma ampla gama de culturas e países, apesar de uma forte seleção negativa contra eles dois. Este não é o que se poderia prever em doenças com aptidão reprodutiva reduzida, a menos que houvesse uma alta taxa de mutação nova. Finalmente, os efeitos da idade paterna: há um aumento significativo do risco da doença com o aumento da idade paterna, o que poderia resultar do aumento da idade paterna relacionados em mutações de novo. Este é o caso para o autismo ea esquizofrenia 3. A relação homem-mulher da taxa de mutação é estimado em cerca de 4-6:1, presumivelmente devido a um maior número de células germinativas divisões com a idade no sexo masculino. Portanto, podemos prever que as mutações de novo seria mais freqüentemente vêm os homens, sobretudo do sexo masculino mais velhos 4. A alta taxa de novas mutações podem, em parte, explicar por que estudos genéticos têm até agora não conseguiram identificar muitos genes predisponentes para genes complexos doenças, tais como autismo e esquizofrenia, e por que as doenças têm sido identificados para apenas 3% dos genes no genoma humano . Identificação de mutações de novo como uma causa de uma doença exige uma abordagem orientada molecular, que inclui os pais a estudar e indivíduos afetados. O processo para determinar se a base genética de uma doença pode resultar em parte de mutações de novo e da abordagem molecular para estabelecer esta relação será ilustrada, usando o autismo ea esquizofrenia como exemplos.

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A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

Estratégia de genética molecular para encontrar mutações de novo causando doenças comuns, tais como autismo e esquizofrenia.

A estratégia para identificar mutações de novo em Distúrbios comuns, tais como autismo e esquizofrenia

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

25.6K visualizações.  Universite de Montreal. Estratégia de genética molecular para encontrar mutações de novo causando doenças comuns, tais como autismo e esquizofrenia.

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Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We have established bilateral common carotid artery occlusion as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance to transient focal cerebral ischemia in C57Bl6/J mice. In this video, we will demonstrate the methodology used for this study.

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning (PC) &#x2013; a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We established bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO) as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance (IT) to transient focal cerebral ischemia (induced by middle cerebral artery occlusion, MCAO) in C57Bl6/J mice.

Oclusão bilateral artéria carótida comum como um estímulo pré-condicionamento adequados para induzir a tolerância isquêmica início da Isquemia Cerebral Focal

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a ...

Medicina

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for personalized medicine after stratification, explaining the current interest in developing a reproducible and low-cost xenotransplant model for this disease. The chick chorioallantoic membrane is a natural immunodeficient host capable of sustaining grafted tissues and cells without species-specific restrictions. In addition, it is easily accessed, manipulated and imaged using optical and fluorescence stereomicroscopy. Histology further allows detailed analysis of heterotypic cellular interactions.
This protocol describes in detail the in ovo grafting of the chorioallantoic membrane with fresh sarcoma-derived tumor tissues, their single cell suspensions, and permanent and transient fluorescently labeled established sarcoma cell lines (Saos-2 and SW1353). The chick survival rates are up to 75%. The model is used to study graft- (viability, Ki67 proliferation index, necrosis, infiltration) and host (fibroblast infiltration, vascular ingrowth) behavior. For localized grafting of single cell suspensions, ECM gel provides significant advantages over inert containment materials. The Ki67 proliferation index is related to the distance of the cells from the surface of the CAM and the duration of application on the CAM, the latter determining a time frame for the addition of therapeutic products.

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

The in ovo chorioallantoic membrane (CAM) is grafted with fresh sarcoma-derived tumor tissues, their single cell suspensions, and permanent and transient fluorescently labeled established sarcoma cell lines. The model is used to study graft- (viability, Ki67 proliferation index, necrosis, infiltration) and host (fibroblast infiltration, vascular ingrowth) behavior.

O<em&gt; Em ovo</em&gt; CAM-ensaio como um Xenograftmodel para o Sarcoma

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for ...

Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties of the smooth muscle as well as changes induced by pathology. This method provides critical information for understanding bladder function while overcoming major methodological difficulties encountered in in vivo experiments, such as surgical and pharmacological manipulations that affect stability and survival of the preparations, the use of human tissue, and/or the use of expensive chemicals. It also provides a way to investigate the properties of each bladder component (i.e. smooth muscle, mucosa, nerves) in healthy and pathological conditions.
The urinary bladder is removed from an anesthetized animal, placed in Krebs solution and cut into strips. Strips are placed into a chamber filled with warm Krebs solution. One end is attached to an isometric tension transducer to measure contraction force, the other end is attached to a fixed rod. Tissue is stimulated by directly adding compounds to the bath or by electric field stimulation electrodes that activate nerves, similar to triggering bladder contractions in vivo. We demonstrate the use of this method to evaluate spontaneous smooth muscle contractility during development and after an experimental spinal cord injury, the nature of neurotransmission (transmitters and receptors involved), factors involved in modulation of smooth muscle activity, the role of individual bladder components, and species and organ differences in response to pharmacological agents. Additionally, it could be used for investigating intracellular pathways involved in contraction and/or relaxation of the smooth muscle, drug structure-activity relationships and evaluation of transmitter release.
The in vitro smooth muscle contractility method has been used extensively for over 50 years, and has provided data that significantly contributed to our understanding of bladder function as well as to pharmaceutical development of compounds currently used clinically for bladder management.

This manuscript presents a simple, yet powerful, in vitro method for evaluating smooth muscle contractility in response to pharmacological agents or nerve stimulation. Main applications are drug screening and understanding tissue physiology, pharmacology,&#160;and pathology.

Músculo liso da bexiga Faixa Contractility como um método para avaliar do trato urinário inferior Farmacologia

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties ...

Fundus Photography as a Convenient Tool to Study Microvascular Responses to Cardiovascular Disease Risk Factors in Epidemiological Studies

The microcirculation consists of blood vessels with diameters less than 150 &#181;m. It makes up a large part of the circulatory system and plays an important role in maintaining cardiovascular health. The retina is a tissue that lines the interior of the eye and it is the only tissue that allows for a non-invasive analysis of the microvasculature. Nowadays, high-quality fundus images can be acquired using digital cameras. Retinal images can be collected in 5 min or less, even without dilatation of the pupils. This unobtrusive and fast procedure for visualizing the microcirculation is attractive to apply in epidemiological studies and to monitor cardiovascular health from early age up to old age.
Systemic diseases that affect the circulation can result in progressive morphological changes in the retinal vasculature. For example, changes in the vessel calibers of retinal arteries and veins have been associated with hypertension, atherosclerosis, and increased risk of stroke and myocardial infarction. The vessel widths are derived using image analysis software and the width of the six largest arteries and veins are summarized in the Central Retinal Arteriolar Equivalent (CRAE) and the Central Retinal Venular Equivalent (CRVE). The latter features have been shown useful to study the impact of modifiable lifestyle and environmental cardiovascular disease risk factors.
The procedures to acquire fundus images and the analysis steps to obtain CRAE and CRVE are described. Coefficients of variation of repeated measures of CRAE and CRVE are less than 2% and within-rater reliability is very high. Using a panel study, the rapid response of the retinal vessel calibers to short-term changes in particulate air pollution, a known risk factor for cardiovascular mortality and morbidity, is reported. In conclusion, retinal imaging is proposed as a convenient and instrumental tool for epidemiological studies to study microvascular responses to cardiovascular disease risk factors.

Retinal image analysis is an unobtrusive procedure for visualizing the microcirculation. The impact of cardiovascular disease risk factors can result in changes of retinal vessel calibers. The procedures to acquire fundus images and the steps for calculating the vessel calibers are described.

Retinografia colorida como uma ferramenta conveniente para estudar as respostas microvasculares a doenças cardiovasculares Fatores de Risco em estudos epidemiológicos

The microcirculation consists of blood vessels with diameters less than 150 &#181;m. It makes up a large part of the circulatory system and plays an ...

Sublingual Immunotherapy as an Alternative to Induce Protection Against Acute Respiratory Infections

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been shown to effectively induce humoral and cellular responses at systemic and mucosal sites, namely the lungs and urogenital tract. Sublingual vaccination can promote protection against infections at the lower and upper respiratory tract; it can also promote tolerance to allergens and ameliorate asthma symptoms. Modulation of lung&#8217;s immune response by sublingual immunotherapy (SLIT) is safer than direct administration of formulations by intranasal route because it does not require delivery of potentially harmful molecules directly into the airways. In contrast to intranasal delivery, side effects involving brain toxicity or facial paralysis are not promoted by SLIT. The immune mechanisms underlying SLIT remain elusive and its use for the treatment of acute lung infections has not yet been explored. Thus, development of appropriate animal models of SLIT is needed to further explore its potential advantages. 
This work shows how to perform sublingual administration of therapeutic agents in mice to evaluate their ability to protect against acute pneumococcal pneumonia. Technical aspects of mouse handling during sublingual inoculation, precise identification of sublingual mucosa, draining lymph nodes and isolation of tissues, bronchoalveolar lavage and lungs are illustrated. Protocols for single cell suspension preparation for FACS analysis are described in detail. Other downstream applications for the analysis of the immune response are discussed. Technical aspects of the preparation of Streptococcus pneumoniae inoculum and intranasal challenge of mice are also explained.
SLIT is a simple technique that allows screening of candidate molecules to modulate lungs&#8217; immune response. Parameters affecting the success of SLIT are related to molecular size, susceptibility to degradation and stability of highly concentrated formulations.

The present work illustrates the convenience of using sublingual immunotherapy to boost the innate immune response in the lungs and confer protection against acute pneumococcal pneumonia in mouse.

Imunoterapia sublingual como uma alternativa para induzir protecção contra Infecções Respiratórias Agudas

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been ...

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes (ILM), and in conjunction with astrocytes, pericytes and endothelial cells they establish the blood-retinal barrier (BRB). BRB limits material transport between the bloodstream and the retina while the ILM acts as a basement membrane that defines histologically the border between the retina and the vitreous cavity. Labeling M&#252;ller cells is particularly relevant to study the physical state of the retinal barriers, as these cells are an integral part of the BRB and ILM. Both BRB and ILM are frequently altered in retinal disease and are responsible for disease symptoms.
There are several well-established methods to study the integrity of the BRB, such as the Evans blue assay or fluorescein angiography. However these methods do not provide information on the extent of BRB permeability to larger molecules, in nanometer range. Furthermore, they do not provide information on the state of other retinal barriers such as the ILM. To study BRB permeability alongside retinal ILM, we used an AAV based method that provides information on permeability of BRB to larger molecules while indicating the state of the ILM and extracellular matrix proteins in disease states. Two AAV variants are useful for such study: AAV5 and ShH10. AAV5&#160;has a natural tropism for photoreceptors but it cannot get across to the outer retina when administered into the vitreous when the ILM is intact (i.e., in wild-type retinas). ShH10 has a strong tropism towards glial cells and will selectively label M&#252;ller glia in both healthy and diseased retinas. ShH10 provides more efficient gene delivery in retinas where ILM is compromised. These viral tools coupled with immunohistochemistry and blood-DNA analysis shed light onto the state of retinal barriers in disease.

To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

Usando vírus adeno-associado como uma ferramenta para o estudo da retina Barreiras na Doença

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide new expandable sources of beta cells to alleviate the donor scarcity in human islet transplantation as therapy for diabetes. Although recent advances have been made towards this aim, mechanisms that regulate beta cell expansion and differentiation from a stem/progenitor cell remain to be characterized. Here, we describe a protocol for an injury model in the adult mouse pancreas that can function as a tool to study mechanisms of tissue remodeling and beta cell proliferation and differentiation. Partial duct ligation (PDL) is an experimentally induced injury of the rodent pancreas involving surgical ligation of the main pancreatic duct resulting in an obstruction of drainage of exocrine products out of the tail region of the pancreas. The inflicted damage induces acinar atrophy, immune cell infiltration and severe tissue remodeling. We have previously reported the activation of Neurogenin (Ngn) 3 expressing endogenous progenitor-like cells and an increase in beta cell proliferation after PDL. Therefore, PDL provides a basis to study signals involved in beta cell dynamics and the properties of an endocrine progenitor in adult pancreas. Since, it still remains largely unclear, which factors and pathways contribute to beta cell neogenesis and proliferation in PDL, a standardized protocol for PDL will allow for comparison across laboratories.

This protocol describes an injury model involving the surgical ligation of the pancreatic duct in the adult mouse pancreas, resulting in severe injury that establishes an environment that allows beta cell neogenesis and proliferation. This model can be used as a tool to study mechanisms involved in beta cell formation.

Lesão cirúrgica para o mouse Pâncreas através da ligadura da pâncreas Duct como um modelo para endócrina e exócrina Reprogramação e Proliferação

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide ...

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves focal endothelial-selective transgenesis, thereby allowing an investigator to determine the biological roles of endothelial-expressed transgenes and to quantify the in vivo transcriptional activity of DNA sequences in large artery endothelial cells. The method uses surgical isolation of rabbit common carotid arteries and an arteriotomy to deliver a transgene-expressing viral vector into the arterial lumen. A short incubation period of the vector in the lumen, with subsequent aspiration of the lumen contents, is sufficient to achieve efficient and durable expression of the transgene in the endothelium, with no detectable transduction or expression outside of the isolated arterial segment. The method allows assessment of the biological activities of transgene products both in normal arteries and in models of human vascular disease, while avoiding systemic effects that could be caused either by targeting gene delivery to other sites (e.g. the liver) or by the alternative approach of delivering genetic constructs to the endothelium by germ line transgenesis. Application of the method is limited by the need for a skilled surgeon and anesthetist, a well-equipped operating room, the costs of purchasing and housing rabbits, and the need for expertise in gene-transfer vector construction and use. Results obtained with this method include: transgene-related alterations in arterial structure, cellularity, extracellular matrix, or vasomotor function; increases or reductions in arterial inflammation; alterations in vascular cell apoptosis; and progression, retardation, or regression of diseases such as intimal hyperplasia or atherosclerosis. The method also allows measurement of the ability of native and synthetic DNA regulatory sequences to alter transgene expression in endothelial cells, providing results that include: levels of transgene mRNA, levels of transgene protein, and levels of transgene enzymatic activity.

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

This method is to introduce a transgene into the endothelium of rabbit carotid arteries. Introduction of the transgene allows the assessment of the biological role of the transgene product either in normal arteries or disease models. The method is also useful for measuring activity of DNA regulatory sequences.

Na Vivo Transferência de genes para o endotélio da artéria carótida comum de coelho

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves ...

An Experimental Model of Diet-Induced Metabolic Syndrome in Rabbit: Methodological Considerations, Development, and Assessment

In recent years, obesity and metabolic syndrome (MetS) have become a growing problem for public health and clinical practice, given their increased prevalence due to the rise of sedentary lifestyles and unhealthy eating habits. Thanks to animal models, basic research can investigate the mechanisms underlying pathological processes such as MetS. Here, we describe the methods used to develop an experimental rabbit model of diet-induced MetS and its assessment. After a period of acclimation, animals are fed a high-fat (10% hydrogenated coconut oil and 5% lard), high-sucrose (15% sucrose dissolved in water) diet for 28 weeks. During this period, several experimental procedures were performed to evaluate the different components of MetS: morphological and blood pressure measurements, glucose tolerance determination, and the analysis of several plasma markers. At the end of the experimental period, animals developed central obesity, mild hypertension, pre-diabetes, and dyslipidemia with low HDL, high LDL, and an increase of triglyceride (TG) levels, thus reproducing the main components of human MetS. This chronic model allows new perspectives for understanding the underlying mechanisms in the progression of the disease, the detection of preclinical and clinical markers that allow the identification of patients at risk, or even the testing of new therapeutic approaches for the treatment of this complex pathology.

We describe methods to develop an experimental model of diet-induced metabolic syndrome (MetS) in rabbits using a high-fat, high-sucrose diet. Animals developed central obesity, mild hypertension, pre-diabetes, and dyslipidemia, thus reproducing the main components of human MetS. This chronic model will allow acquisition of knowledge underlying mechanisms of disease progression.

Um modelo Experimental de síndrome metabólica induzida por dieta em coelho: considerações metodológicas, desenvolvimento e avaliação

In recent years, obesity and metabolic syndrome (MetS) have become a growing problem for public health and clinical practice, given their increased ...

A Rabbit Model of Durable Transgene Expression in Jugular Vein to Common Carotid Artery Interposition Grafts

Vein graft bypass surgery is a common treatment for occlusive arterial disease; however, long-term success is limited by graft failure due to thrombosis, intimal hyperplasia, and atherosclerosis. The goal of this article is to demonstrate a method for placing bilateral venous interposition grafts in a rabbit, then transducing the grafts with a gene transfer vector that achieves durable transgene expression. The method allows the investigation of the biological roles of genes and their protein products in normal vein graft homeostasis. It also allows the testing of transgenes for the activities that could prevent vein graft failure, e.g., whether the expression of a transgene prevents the neointimal growth, reduces the vascular inflammation, or reduces atherosclerosis in rabbits fed with a high-fat diet. During an initial survival surgery, the segments of right and left external jugular vein are excised and placed bilaterally as reversed end-to-side common carotid artery interposition grafts. During a second survival surgery, performed 28 days later, each of the grafts is isolated from the circulation with vascular clips and the lumens are filled (via an arteriotomy) with a solution containing a helper-dependent adenoviral (HDAd) vector. After a 20-min incubation, the vector solution is aspirated, the arteriotomy is repaired, and flow is restored. The veins are harvested at time points dictated by individual experimental protocols. The 28-day delay between the graft placement and the transduction is necessary to ensure the adaptation of the vein graft to the arterial circulation. This adaptation avoids rapid loss of transgene expression that occurs in vein grafts transduced before or immediately after grafting. The method is unique in its ability to achieve durable, stable transgene expression in grafted veins. Compared to other large animal vein graft models, rabbits have advantages of low cost and easy handling. Compared to rodent vein graft models, rabbits have larger and easier-to-manipulate blood vessels that provide abundant tissue for analysis.

This method describes the placement of interposition vein grafts in rabbits, the transduction of the grafts, and the achievement of durable transgene expression. This allows the investigation of physiological and pathological roles of transgenes and their protein products in grafted veins, and testing of gene therapies for vein graft disease.

Um modelo de coelho da expressão do Transgene durável na veia Jugular para enxertos de interposição da artéria carótida comum

Vein graft bypass surgery is a common treatment for occlusive arterial disease; however, long-term success is limited by graft failure due to thrombosis, ...