Wir danken der Fakultät, Genossen, Bewohner und Arzthelferinnen des Brigham and Womens Hospital, Department of Pathology zur Herstellung von Gewebe für diese Studien. Diese Arbeit wurde durch Forschungsgelder von der NIH / National Cancer Institute (P50 CA105009, CA108748 K08, U01 CA152990), Ovarian Cancer Research Fund, unterstützt The May Kay-Stiftung, Novartis Pharmaceuticals, Robert und Deborah Erste Fund, Randi und Joel Cutler Eierstockkrebs Research Fund, Marsha Rivkin Foundation - Scientific Scholar Award, AACR - George und Patricia Sehl Fellowship for Cancer Genetics Research, und dem amerikanischen Arzt Stipendium für Medizin in Israel - Claire und Emmanuel G. Rosenblatt Foundation Grant.

1. Collagen Vorbereitung und Filter Coating. <ol><li> Zur Vorbereitung der menschlichen Plazenta Kollagen, tweeze aus 30 mg der menschlichen Plazenta Kollagen und setzte oben auf 50 ml destilliertem Wasser (dH 2 O) in einem 500 ml Becherglas mit Rührstab. </li><li> Geben Sie 100 μls Eisessig direkt auf Kollagen zu erleichtern, sich aufzulösen. Warm bis 37 ° C und umrühren, um das Kollagen zu lösen. Es sollte in 20-30 Minuten zu lösen. Wenn Kollagenstränge in Lösung bleibt, wird Filtersterilisation schwierig sein. </li><li> Verdünnen Sie die 50 ml Lager mit 450 ml dH 2 O und mit einem 0,2-um-Membranfilter-sterilisieren. Dies ist die letzte funktionierende Lösung. Lagerung bei 4 ° C. </li><li> Bereiten Transwell Filtermembranen durch Beschichtung mit Kollagen (50-100 ul) über Nacht. Chilled Kollagen muss auf RT erwärmt und dann in die obere Kammer hinzugefügt, um die Membran über Nacht und bei RT decken. Vor der Beschichtung der dissoziierten primäre Eileiter (FT) Epithel (siehe unten) auf die Transwell-Filter, waschen Sie die Filter dreimal in 1X Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) mindestens 1 Stunde vor dem Gebrauch, um überschüssige Kollagen zu entfernen. </li></ol> 2. Tissue Collection und Dissoziation. <ol><li> Frische Eileiter (FT) fimbria sollte in sterile 1X PBS in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen gesammelt und auf Eis gehalten vor der Verarbeitung in einem sterilen Gewebekultur Haube prompt. </li><li> Waschen Sie die Gewebeprobe einmal in 20 ml gekühltes 1X PBS (wenn die Probe in einem anderen Medientyp gesammelt worden ist oder blutige Wäsche mindestens 3X loswerden, wie viel Blut und ausländischen Medien wie möglich, da dies mit Platierungseffizienz stören könnten). </li><li> Mit einer sterilen Pinzette Transfer FT zu einer 10 cm Gewebe Kulturschale mit ein wenig PBS und mit einem sterilen Skalpell und einer sterilen Pinzette, geschnitten längs der Exposition der Epithelzellen zu maximieren. Öffnen Sie die Fimbria so dass es nicht mehr ist ein Rohr, sondern eine fast flache Platte aus Gewebe. Dann in kleinere, aber immer noch abrufbar Stück (ca. 3 mm im Durchmesser) schneiden. </li><li> Transfer-Stücke bis 45 ml des gekühlten Dissoziation Medien (MEM mit 1,4 mg / ml Pronase und 0,1 mg / ml DNAse) in einer 50 ml Tube. </li><li> Rock sanft bei 4 ° C für 24 bis 72 Stunden. (Aus Erfahrung, ist 48 Stunden optimal). Um Höhe der Dissoziation zu überprüfen, geben Sie einen Tropfen der Dissoziation Medien auf einer Folie und überprüfen Menge Verklumpung und Lebensfähigkeit des Gewebes (Schläge Flimmerzellen). Sie wollen sowohl einzelne Zellen und einige kleine Klumpen zu sehen. </li></ol> 3. Eileiter Plating. <ol><li> Wenn die Menge der Epithelzellen Dissoziation optimal ist, inaktivieren die Medien durch Zugabe von 10% vol FBS. Invert ein paar Mal um die Zellsuspension in kleinere Aggregate zu entfernen. </li><li> Lassen großen Klumpen Gewebe (Stroma-Gewebe) in den Boden ab der Röhre. Entfernen Sie das Medium mit Epithelzellen in eine zweite 50 ml Tube. </li><li> Fügen Sie 50 ml kaltem MEM (ohne FBS), um den ursprünglichen 50 ml Tube. Umkehren, um weitere Zellen zu sammeln. Sammeln Medien in einen dritten 50 ml Tube (wenn die Probe ist sehr groß und eine hohe Anzahl von Zellen zu erwarten ist, kann dieser Schritt wiederholt werden, um Zellen Sammlung zu maximieren). Die große Stücke von stromalen / extrazelluläre Gewebe können nun entsorgt werden. Sie haben jetzt zwei 50 ml Röhrchen Zellsuspension. Zentrifugation bei 1000 rpm für 5 Minuten und absaugen Dissoziation Medien aus Zellpellets. </li><li> Resuspendieren in ca. 5-10 ml USG Medien (DMEM: F12 mit 2% USG und 1% Pen Strep ergänzt) erwärmt auf 37 ° C. Pipette vorsichtig. Seien Sie vorsichtig, nicht zu kräftig Pipette, da dies die epithelialen Zellen schädigen können und reduzieren die Qualität der Kulturen. Es sollte Einzelzellen und kleine Klumpen (Abbildung 1). </li><li> Transfer auf Primaria Kulturschalen und Inkubation für mindestens 1 Stunde oder bis zu 3 Stunden. Fibroblasten und die roten Blutkörperchen werden dem Kunststoff-Stick, aber die FT Epithelzellen nicht. Werfen Sie einen Blick auf die Platte nach einer Stunde, um zu sehen, wenn etwas kleben. Die Anwesenheit von Haarzellen kann mit der Feststellung, das Schlagen der Zilien zu sehen. </li><li> Während dieser Inkubation können Kollagen beschichtete Filter gewaschen und bereit gemacht für die Zell-Plating (Siehe Schritt 1,4) </li><li> Nach 1-3 Stunden Inkubation auf die Primaria Platten, übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 15 ml Tube und spülen Sie die Primaria Platte mit 5 ml USG Medien, übertragen Sie diese Medien auf das Rohr auf ein Endvolumen von 15 ml zu machen. Zentrifugation bei 1000 rpm für 5 Minuten. </li><li> Vorsichtig absaugen Medien und verhindern, dass das Zellpellet. Gemessen an der Pellet-Größe, in der entsprechenden Menge an USG Medien resuspendieren. (In der Regel zwischen 1-3 ml) Weniger ist besser am Anfang, so dass Sie weiter verdünnen kann, wenn Sie benötigen. Resuspendieren sanft. </li><li> Add 10 ul der resuspendierten Zellen zu einem Hämacytometer und bestimmen die Zelldichte. Tipps: Sie sind für Epithelzellen, die eine deutlich dunkler Zellmembran haben und nicht-säulenförmige suchen. Sie können auch rechnen Flimmerzellen, die definitiv in Bewegung sind. Kleinere Zellen, die einen Heiligenschein appearan habence sind rote Blutkörperchen und sollte nicht gezählt werden. Es wird einige Klumpen werden, so müssen Sie diese in dich Zellzahl zu schätzen. Die Aussaat Ziel beträgt 1,65 x10 5 Zellen / Membran oder mindestens 75%-Filter-Deckung (Abbildung 1). Wenn Zellen zu dünn sind vergoldet, werden die Zellen nicht in der Lage, eine vollständige Epithelschicht bilden. </li><li> Add 500 ul der USG Medien Unterseite der Vertiefung einer 24-Well-Platte und legen Transwell. Das erforderliche Volumen der FT Zellsuspension (siehe oben), dann kann auf jede Membran hinzugefügt werden, ist dies in der Regel 100 ul. </li><li> Inkubieren und wachsen nach 1-2 Tagen ohne störende Spitze Membran. Sie können die Medien auf der basalen Seite in diesen Tagen bei Bedarf ändern. Nach 1-2 Tagen können Sie sorgfältig abspülen oben mit USG Medien und eine kleine Menge (50-100 ul) von Medien auf der Membran. Es ist einfacher, dem Zusammenfluss von Zellkulturen zu bestimmen, ob Medien aus der apikalen Seite der Filter vor Mikroskopie entfernt wird. Das untere Fach sollte immer Medien. Sobald Kulturen sind vollständig konfluenten (in der Regel innerhalb von 5 Tagen), sollte die Menge von Medien, die sich Reisen durch die Filter von der basalen zur apikalen Seiten vernachlässigbar sein. </li><li> Ändern Sie den Basalmedien einmal alle zwei Tage für die ersten 10 Tage. Das untere Fach muss immer Medien zu halten Zellen am Leben. Sobald die Zellen haben ein dichtes Epithel (Abb. 1 und 2) sie in weiteren Studien, wie z. B. Immunfluoreszenz (IF) oder Immunhistochemie (IHC) verwendet werden können gebildet. </li></ol> 4. Membrane Processing. <ol><li> Membrane Verarbeitung ist abhängig von der Art der Studie, die ausgeführt werden, aber in der Regel schließt die Entfernung der Filter aus dem Transwell-Einsätze. </li><li> Die Filter sind in der Regel 3-mal in 200 ul 1X PBS vor der Entnahme gewaschen. </li><li> Absaugen von PBS apikalen und basalen Seite der Filter. Diese sollte 1 gut gemacht werden zu einem Zeitpunkt, um die Membranen vor dem Austrocknen zu verhindern. </li><li> Entfernen Sie den Einsatz aus der Platte, drehen Sie sie auf den Kopf und mit einem sterilen Skalpell um die Membran herum geschnitten. Versuchen Sie, die Membran in einem Stück, indem sie gerade Schnitte um die Membran herum Kante, anstatt ziehen das Skalpell um den Rand zu entfernen. </li><li> Verwenden einer Pinzette, um den Filter aus dem Einsatz zu entfernen, zu verfolgen, welche Seite die Zellen auf. Der Filter kann dann für IF, IHC, etc. nach Bedarf bearbeitet werden. </li><li> Beispiel: für IF-Studien, den Filter (nach der Fixierung, Permeabilisierung, Sperrung und Inkubation mit entsprechenden Antikörpern, nach der Norm IF-Verfahren) sind auf einer Folie platziert werden, ist Zellen nach oben Vectashield mit DAPI auf den Filter fallen gelassen und mit einer Deckglas. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Die Transwell-Filter können leicht entfernt werden, um die ex vivo Epithel von beiden Immunhistochemie (IHC) und Immunfluoreszenz (IF) zu untersuchen. Mit Linie spezifische Marker kann man Bild und Quantifizierung der sekretorischen (Pax8 positiv) und Flimmerepithel (Sall2 positive) Zellkompartimenten in diesen Kulturen (Abbildung 3). Darüber hinaus mit diesen Markern kann man beobachten, wie jeder Zelltyp verschiedene physiologische Signale 10 reagiert. Dieses System wurde verwendet, um die Veränderungen in der Sekretom und intrazelluläre Phosphoproteom der FT Epithel in Reaktion auf verschiedene Reize zu charakterisieren. <img src="/files/ftp_upload/2728/2728fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Die Illustration zeigt, wie ex vivo Kulturen aus primären humanen Eileiter Gewebe erzeugt. Eileiter Fimbrien Gewebe aus der OP gewonnen und zerkleinert, um kleine Fragmente 1, gewaschen und mit Dissoziation Medien inkubiert 24-72 Stunden 2 zu erzeugen. Nach Dissoziation abgeschlossen ist, werden die Gewebestücke dürfen auf den Grund der Inkubationszeit Rohr und das Medium mit den dissoziierten Epithelzellen absetzen geerntet wird 3. Die Effizienz der Dissoziation kann durch eine Untersuchung unter dem Phasenkontrast-Mikroskop 4 überwacht werden. Die dissoziierten epithelialen Zellen werden dann auf Primaria Platten kultiviert zur Beseitigung von Fibroblasten und hämatopoetischen Zellen, die sich immer mit den Epithelzellen 5 beigemischt. Sobald die nicht-epithelialen Zellen ausreichend entfernt werden, sind die Epithelzellen auf Transwell-Filter, die mit der menschlichen Plazenta Kollagen 5 beschichtet werden ausgesät. Das Medium wird durch Diffusion durch die Transwell von unten zur Verfügung gestellt. Die Kulturen werden für 24-48 Stunden inkubiert und anschließend die apikalen Medien entfernt wird. Die ex vivo Kulturen sind dann erlaubt, für 5-8 Tage wachsen, um eine vollständige, komplette Rasen auf der Transwell-Filter bilden. Die ex vivo Kulturen rentabel in diesem Zustand gehalten werden für bis zu 4 Wochen. Die Karikatur 5 zeigt eine Darstellung der ausgewachsenen ex vivo Kultur mit einem Beispiel für einen Filter aus dem Einsatz und gefärbt mit hämato entferntxylin und Eosin (H &amp; E) zu zeigen, die Polarität und die Architektur der ex vivo Epithel. <img src="/files/ftp_upload/2728/2728fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Hellfeld-Mikroskopie von FT ex vivo Kulturen. Transwell-Einsätze sind mit der menschlichen Plazenta Kollagen 0.4μm Poren beschichtet sind (a). FT Epithelzellen auf die Kollagen-beschichteten Wendeschneidplatten (b), wo sie bilden eine Epithelschicht (c) kultiviert. Einige Trümmer wird in der Regel beobachtet Einhaltung Zellen im Epithel Kultur (durch Pfeile angedeutet), die meist auf Flimmerzellen. <img src="/files/ftp_upload/2728/2728fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. FT ex vivo Kultur Immunfluoreszenz (IF). Beispiele für IF Bilder von ex vivo Kulturen fixiert und gefärbt mit Antikörpern gegen (a) sekretorische (Pax8) und (d) Flimmerepithel Zelle (Sall2) Marker. DAPI ist als Kontrolle für die Lage der Zellkerne (blau) (b und e) und fusionierte Antikörper und DAPI-Färbung wird auch gezeigt, (c und f) verwendet. Die Anzahl der Zellen ist abhängig von der Länge der Zeit werden die Zellen in Kultur (Pax8 Färbung, 7 Tage; Sall2 Färbung, 3 Tage).

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Dr. Drapkin ist ein Berater für Novartis Pharmaceuticals. Kein anderer Autoren erklären, mögliche Interessenkonflikte.

Die Identifizierung der FT als Kandidat vor Ort Ursprungsbezeichnungen für SOC bietet die Möglichkeit für Grundlagenforschung und translationale Forschung an der Entschlüsselung der Mechanismen der Verknüpfung von bekannten Risikofaktoren und der tatsächlichen seröse krebserregend Prozess soll. Entscheidend für diese ist die Entwicklung von gefügig Systeme modellieren, die es uns ermöglichen, beginnen die Prüfung der Hypothese, dass die FTSEC einer Zelle des Ursprungslandes für Becken-seröse Karzinome ist, wird. Die ex vivo Kultur-Modell beschriebenen ist ein neuartiges System, das die Isolierung und Co-Kultur von primären FT sekretorische und Flimmerzellen erlaubt in einer Weise, dass die Morphologie und Biologie der einheimischen FT Epithel bewahrt. Mit diesem System haben wir vor kurzem aus der Sekretom dieses Epithel und wie das Epithel reagiert auf mechanische und genotoxische Verletzungen 10. Ovulation, ein wesentlicher Risikofaktor mit Eierstockkrebs Tumorgenese verbunden sind, ist durch eine Kombination von Gewebeschäden, Entzündungsmediatoren, Wachstumsfaktoren und Hormone 11 gekennzeichnet. Dieses System könnte verwendet werden, um die Wirkung eines ovulatorischen Milieu auf die Reaktion und die Lebensfähigkeit von sekretorischen und Flimmerzellen zu studieren. Darüber hinaus könnten die Auswirkungen anderer Zelltypen (zB Entzündungszellen) untersucht, um zu einem besseren Verständnis der Ereignisse zu ermöglichen, dass Laufwerk Zelltyp Differenzierung und die Faktoren, die zur neoplastischen Transformation dieser Zellen beitragen. Ähnliche Modelle wurden in anderen Geweben beschrieben worden, wo polarisierten Epithel vorhanden ist. Zum Beispiel im polarisierten primären Kulturen von Atemwegsepithel, wurde die Wirkung von Heregulin auf das Zellwachstum und die Reaktion auf Zellschädigung 12 bewertet. Diese Art von Modell-Systeme bieten eine neue und nützliche Methode, um die Einleitung und Pathogenese von Tumoren, die aus epithelialen Geweben entstehen zu studieren, und dies ist von entscheidender Bedeutung in Geweben wie der FT, wo keine Zelllinien zur Verfügung steht, und wo gibt es eine große Notwendigkeit für die Identifizierung der wichtigsten Wege und Entwicklung von neuartigen Therapiestrategien.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Collagen from human placenta (Bornstein and Traub Type IV)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C7521</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM:F12 media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>15-090-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultroser G</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Crescent Chemical Company</td>
<td>67042</td>
<td>Add 20 ml of DMEM:F12 to stock bottle and use 10mls per 500 ml of media (2% final concentration)</td>
</tr>
<tr>
<td>Pen Strep</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Primaria culture plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>353802</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>24 well Transwell Permeable supports</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning (Costar)</td>
<td>3470</td>
<td> Clear, 6.5 mm insert, 0.4 &mu;m pore size, treated polyester </td>
</tr>
<tr>
<td>MEM (Minimal Essential Media)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>10-010-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pronase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11459643001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNAse</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>DN25</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sall2 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dr T. Benjamin, Harvard</td>
<td>Gift</td>
<td>1:20 dilution</td>
</tr>
<tr>
<td>Pax8 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Proteintech</td>
<td>10336-1-AP</td>
<td>1: 1000 dilution</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

ex vivo culture of primary human fallopian tube epithelial cells

Epithelialen Ovarialkarzinom ist eine führende Ursache der weiblichen Krebssterblichkeit in den Vereinigten Staaten. Im Gegensatz zu anderen frauenspezifischen Krebsarten, wie Brust-und Gebärmutterkrebs Karzinome, wo Todesraten in den letzten Jahren gesunken sind, haben Eierstockkrebs Heilungsraten blieb relativ unverändert in den vergangenen zwei Jahrzehnten 1. Dies ist im Wesentlichen auf das Fehlen geeigneter Screening-Tools zur Erkennung von frühen Stadium der Erkrankung, wo Operation und Chemotherapie sind am effektivsten, 2, 3. Als Ergebnis präsentieren die meisten Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung und diffuse Bauchschmerzen Engagement. Dies wird auch durch die Tatsache, dass Eierstockkrebs eine heterogene Erkrankung mit mehreren histologischen Subtypen 4, 5 ist kompliziert. Seröse Ovarialkarzinom (SOC) ist die häufigste und aggressivste Subtyp und die Form häufig mit Mutationen in den BRCA-Gene assoziiert. Aktuelle experimentelle Modelle in diesem Bereich mit dem Einsatz von Krebszelllinien und Maus-Modellen zum besseren Verständnis der Einleitung genetischen Ereignissen und Pathogenese der Krankheit 6, 7. Vor kurzem hat die Eileiter als neuartige Ort für die Entstehung des SOC in Erscheinung, der Eileiter (FT) sekretorischen Epithelzellen (FTSEC) als die vorgeschlagene Zelle Herkunft 8, 9. Es liegen noch keine Zelllinien oder Kultur-Systeme zur Verfügung, die FT Epithel oder die FTSEC studieren. Hier beschreiben wir eine neuartige ex vivo Kultur System, in dem primären humanen FT Epithelzellen in einer Weise, dass ihre Architektur, Polarität, Immunphänotyp, und die Reaktion auf physiologische und genotoxische Stressoren bewahrt kultiviert werden. Diese ex vivo-Modell bietet ein nützliches Werkzeug für das Studium der SOC, so dass ein besseres Verständnis davon, wie Tumore können aus diesem Gewebe entstehen, und die Mechanismen der Tumor-Initiation und Progression beteiligt.

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Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Die Eileiter (FT) wird als Alternative vor Ort Ursprungsbezeichnungen für seröse Ovarialkarzinom (SOC) entstehen. Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige Methode zur Isolierung und<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur der Eileiter Epithelzellen. Dieses System rekapituliert die<em&gt; In vivo</em&gt; Epithel und ermöglicht das Studium der Pathogenese SOC.

Ex vivo-Kultur von primären humanen Eileiter Epithelzellen

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

ex-vivo-culture-of-primary-human-fallopian-tube-epithelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

19.5K Aufrufe.  Dana-Farber Cancer Institute. Die Eileiter (FT) wird als Alternative vor Ort Ursprungsbezeichnungen für seröse Ovarialkarzinom (SOC) entstehen. Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige Methode zur Isolierung und Ex vivo Kultur der Eileiter Epithelzellen. Dieses System rekapituliert die In vivo Epithel und ermöglicht das Studium der Pathogenese SOC.

Serie: Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Method for Culture of Early Hühnerembryonen ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Forschung

Biologie

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the function and structure of human epithelial cells. Here we describe in detail the method of growing bronchial epithelial cells from bronchial airway tissue that is harvested by the surgeon at the times of lung surgery (e.g. lung cancer or lung volume reduction surgery). With ethics approval and informed consent, the surgeon takes what is needed for pathology and provides us with a bronchial portion that is remote from the diseased areas. The tissue is then used as a source of explants that can be used for growing primary bronchial epithelial cells in culture. Bronchial segments about 0.5-1cm long and &le;1cm in diameter are rinsed with cold EBSS and excess parenchymal tissue is removed. Segments are cut open and minced into 2-3mm3 pieces of tissue. The pieces are used as a source of primary cells. After coating 100mm culture plates for 1-2 hr with a combination of collagen (30 &mu;g/ml), fibronectin (10 &mu;g/ml), and BSA (10 &mu;g/ml), the plates are scratched in 4-5 areas and tissue pieces are placed in the scratched areas, then culture medium (DMEM/Ham F-12 with additives) suitable for epithelial cell growth is added and plates are placed in an incubator at 37&deg;C in 5% CO2 humidified air. The culture medium is changed every 3-4 days. The epithelial cells grow from the pieces forming about 1.5 cm diameter rings in 3-4 weeks. Explants can be re-used up to 6 times by moving them into new pre-coated plates. Cells are lifted using trypsin/EDTA, pooled, counted, and re-plated in T75 Cell Bind flasks to increase their numbers. T75 flasks seeded with 2-3 million cells grow to 80% confluence in 4 weeks. Expanded primary human epithelial cells can be cultured and allowed to differentiate on air-liquid interface. Methods described here provide an abundant source of human bronchial epithelial cells from freshly isolated tissues and allow for studying these cells as models of disease and for pharmacology and toxicology screening.

Here we describe a detailed method for growing primary human bronchial epithelial cells from explants of human bronchial airway tissue including differentiated growth on an air-liquid interface. This method provides an abundant source of primary cells for investigating the role of the airway epithelium in human lung health and disease.

Primären humanen bronchialen Epithelzellen aus Explantaten Grown

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

Isolierung und Kultivierung von Adult epithelialen Stammzellen aus menschlicher Haut

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentivirale-vermittelte Knockdown Während Ex Vivo Erythropoese von humanen hämatopoetischen Stammzellen

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts migrate through the epidermis of the embryo where they subsequently colonize the developing hair follicles1,2. Neural crest cell migration is extensively studied in vitro but in vivo methods are still not well developed, especially in mammalian systems. One alternative is to use ex vivo organotypic culture3-6. Culture of mouse embryonic skin requires the maintenance of an air-liquid interface (ALI) across the surface of the tissue3,6. High resolution live-imaging of mouse embryonic skin has been hampered by the lack of a good method that not only maintains this ALI but also allows the culture to be inverted and therefore compatible with short working distance objective lenses and most confocal microscopes. This article describes recent improvements to a method that uses a gas permeable membrane to overcome these problems and allow high-resolution confocal imaging of embryonic skin in ex vivo culture6. By using a melanoblast specific Cre-recombinase expressing mouse line combined with the R26YFPR reporter line we are able to fluorescently label the melanoblast population within these skin cultures. The technique allows live-imaging of melanoblasts and observation of their behavior and interactions with the tissue in which they develop. Representative results are included to demonstrate the capability to live-image 6&#160;cultures in parallel.

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

We describe the dissection and ex vivo culture of mouse embryonic skin. The culture system maintains an air-liquid interface across the tissue surface and allows imaging on an inverted microscope. Melanoblasts, a component of the developing skin, are fluorescently labeled allowing their behavior to be observed using confocal microscopy.

Ex-vivo-Kultur von embryonalen Maus-Haut-und-Live-Darstellung von Migration Melanoblasten

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of airway cell differentiation and function. In the past few years, the use of lentiviral vectors for transgene delivery became common practice. While there are reports of transduction of fully differentiated airway epithelial cells with certain non-HIV pseudo-typed lentiviruses, the overall transduction efficiency is usually less than 15%. The protocol presented here provides a reliable and efficient method to produce lentiviruses and to transduce primary human bronchial epithelial cells. Using undifferentiated bronchial epithelial cells, transduction in bronchial epithelial growth media, while the cells attach, with a multiplicity of infection factor of 4 provides efficiencies close to 100%. This protocol describes, step-by-step, the preparation and concentration of high-titer lentiviral vectors and the transduction process. It discusses the experiments that determined the optimal culture conditions to achieve highly efficient transductions of primary human bronchial epithelial cells.

Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.

Optimale Lentivirus Produktion und Zellkulturbedingungen notwendig für eine erfolgreiche transduzieren primären humanen bronchialen Epithelzellen

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II cells and two types of immune cells (i.e., human monocyte-derived macrophages [MDMs] and dendritic cells [MDDCs]). A protocol for assembling the multicellular model is provided. Alveolar epithelial cells (A549 cell line) are grown and differentiated under submerged conditions on permeable inserts in two-chamber wells, then combined with differentiated MDMs and MDDCs. Finally, the cells are exposed to an air-liquid interface for several days. As human primary immune cells need to be isolated from human buffy coats, immune cells differentiated from either fresh or thawed monocytes are compared in order to tailor the method based on experimental needs. The three-dimensional models, composed of alveolar cells with either freshly isolated or thawed monocyte-derived immune cells, show a statistically significant increase in cytokine (interleukins 6 and 8) release upon exposure to proinflammatory stimuli (lipopolysaccharide and tumor necrosis factor &#945;) compared to untreated cells. On the other hand, there is no statistically significant difference between the cytokine release observed in the cocultures. This shows that the presented model is responsive to proinflammatory stimuli in the presence of MDMs and MDDCs differentiated from fresh or thawed peripheral blood monocytes (PBMs). Thus, it is a powerful tool for investigations of acute biological response to different substances, including aerosolized drugs or nanomaterials.

Presented here is a protocol for primary human blood monocyte isolation as well as their differentiation into macrophages and dendritic cells and assembly with epithelial cells into a multicellular human lung model. Biological responses of cocultures composed of immune cells differentiated from either freshly isolated or thawed monocytes, upon exposure to proinflammatory stimuli, are compared.

Multizelluläres humanes Alveolarmodell bestehend aus Epithelzellen und primären Immunzellen zur Gefahrenbeurteilung

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, epithelial progenitor cells can self-renew and generate differentiating progeny that exhibit cellular functions similar to those of their in vivo counterparts. Herein we describe a step-by-step protocol to isolate region-specific progenitors from human lung and generate 3D organoid cultures as an experimental and validation tool. We define proximal and distal regions of the lung with the goal of isolating region-specific progenitor cells. We utilized a combination of enzymatic and mechanical dissociation to isolate total cells from the lung and trachea. Specific progenitor cells were then fractionated from the proximal or distal origin cells using fluorescence associated cell sorting (FACS) based on cell type-specific surface markers, such as NGFR&#160;for sorting basal cells and HTII-280 for sorting alveolar type II cells. Isolated basal or alveolar type II progenitors were used to generate 3D organoid cultures. Both distal and proximal progenitors formed organoids with a colony forming efficiency of 9-13% in distal region and 7-10% in proximal region when plated 5000 cell/well on day 30. Distal organoids maintained HTII-280+ alveolar type II cells in culture whereas proximal organoids differentiated into ciliated and secretory cells by day 30. These 3D organoid cultures can be used as an experimental tool for studying the cell biology of lung epithelium and epithelial mesenchymal interactions, as well as for the development and validation of therapeutic strategies targeting epithelial dysfunction in a disease.

This article provides a detailed methodology for tissue dissociation and cellular fractionation approaches allowing enrichment of viable epithelial cells from proximal and distal regions of the human lung. Herein these approaches are applied for the functional analysis of lung epithelial progenitor cells through the use of 3D organoids culture models.

Isolierung und Anreicherung menschlicher Lungenepithel-Vorläuferzellen für Organoidkulturen

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a multifactorial disease influenced by environmental and genetic factors, which lead to functional impairment of the retina due to retinal pigment epithelial (RPE) cell degeneration followed by photoreceptor degradation. An ideal treatment would include the transplantation of healthy RPE cells secreting neuroprotective factors to prevent RPE cell death and photoreceptor degeneration. Due to the functional and genetic similarities and the possibility of a less invasive biopsy, the transplantation of iris pigment epithelial (IPE) cells was proposed as a substitute for the degenerated RPE. Secretion of neuroprotective factors by a low number of subretinally-transplanted cells can be achieved by Sleeping Beauty (SB100X) transposon-mediated transfection with genes coding for the pigment epithelium-derived factor (PEDF) and/or the granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF). We established the isolation, culture, and SB100X-mediated transfection of RPE and IPE cells from various species including rodents, pigs, and cattle. Globes are explanted and the cornea and lens are removed to access the iris and the retina. Using a custom-made spatula, IPE cells are removed from the isolated iris. To harvest RPE cells, a trypsin incubation may be required, depending on the species. Then, using RPE-customized spatula, cells are suspended in medium. After seeding, cells are monitored twice per week and, after reaching confluence, transfected by electroporation. Gene integration, expression, protein secretion, and function were confirmed by qPCR, WB, ELISA, immunofluorescence, and functional assays. Depending on the species, 30,000-5 million (RPE) and 10,000-1.5 million (IPE) cells can be isolated per eye. Genetically modified cells show significant PEDF/GM-CSF overexpression with the capacity to reduce oxidative stress and offers a flexible system for ex vivo&#160;analyses and in vivo studies transferable to humans to develop ocular gene therapy approaches.

Here, a protocol to isolate and transfect primary iris and retinal pigment epithelial cells from various mammals (mice, rat, rabbit, pig, and bovine) is presented. The method is ideally suited to study ocular gene therapy approaches in various set-ups for ex vivo&#160;analyses and&#160;in vivo studies transferable to humans.

Isolierung, Kultur und Gentechnik von primären Pigmentepithelzellen von Säugetieren für die nicht-virale Gentherapie

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

Effiziente Dissektion und Kultur der primären Maus retinalen Pigmentepithelzellen

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...