Die Arbeit wurde durch die Grundfinanzierung von der Medical Research Council unterstützt. Wir sind dankbar, dass Craig Nicol für die Herstellung von technischen Zeichnungen. Wir sind dankbar, dass Matthew Pearson und Paul Perry für ihre Imaging-Unterstützung.

Alle Tier Arbeit wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts unter Lizenz von der britischen Home Office (Projektlizenznummer PPL 60/3785 und 60/4424) durchgeführt. 1. Vorbereitung <ol><li> Beschriften Sie die Melanoblasten in der Entwicklung von Haut durch die Kombination eines geeigneten Cre-Rekombinase exprimierenden Mauslinie mit einem fluoreszierenden Reportermauslinie. :: CreA Tyr, Tyr :: CREB 8 und Wnt1 :: Cre 14 erfolgreich als Cre-exprimierenden Linien eingesetzt und R26YFPR 9 als Reporter Linie. </li><li> Bereiten Sie das Kulturmedium in einer Steril; Ergänzung nach Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit (1% v / v Penicillin / Streptomycin), 10% v / v fötales Kälberserum und 0,584 g / l L-Glutamin. </li><li> Die Live-Bildgebungsgerät ist in Abbildung 1 skizziert Sterilisieren Sie die Imaging-Kammer Basis durch Abwischen mit 70% Ethanol. Sterilisieren Sie die Einsätze, Imaging-Clips und O-Ringe durch Einweichen overnight in 70% Ethanol. Eine sterile Abdeckung aus einer Platte mit 6 Vertiefungen, wenn der Deckel der Kammer. </li><li> Die Bodenfläche des Bilderzeugungskammer aus einem lummox Membran anstelle von einem O-Ring (1) gehalten wird. Beginnen Sie mit einer 35-mm-gasdurchlässige lummox Gericht. Die Schale über den Imaging-Kammer und schneiden Sie die gasdurchlässige Membran mit einer einzigen Rasierklinge. Schieben Sie den O-Ring über der Membran, um es in der bildgebenden Kammer zu sichern. </li><li> Die bildgebenden Clips (6 insgesamt), klemmen die embryonalen Haut statt (Abbildung 1) vor dem Gebrauch müssen sie mit 1% Agarose gefüllt werden. Vorbereitung einer 2% igen Lösung von Agarose mit sterilem dH 2 O durch Mikrowellenbehandlung und Abkühlen auf 60 ° C. Mischung 1:1 mit 10 ml Kulturmedium (siehe Schritt 2) auf 60 ° C vorgewärmt Stehen die sechs Bildclips in eine sterile 6-Well-Platte. Drip der 1% igen Lösung in der Mitte jeder Clip mit einem feinen pastette und abkühlen lassen. 1 ml kaltem sterilem PBS in jede Vertiefung, die ein zu verhinderngarose Austrocknen. Die Abbildungs ​​Clips kann mehrere Stunden in PBS gelagert werden. </li><li> Zur Durchführung der Trennung von empfindlichen embryonalen Haut und in der Handhabung der sezierten Gewebe verwenden Sie den &quot;Haar-Stick-Methode &#39;, wie in Kashiwagi et al. 3 Statt mit einem Ess-Stäbchen eine Bambus-Kebab-Spieß kann verwendet werden, beschrieben. Machen Sie einen kleinen Schlitz in dem flachen Ende des Spießes mit einer einzigen Rasierklinge und legen Sie eine weiche Zahnbürste Borsten. Schneiden Sie den Spieß, so dass es etwa 15 cm in der Länge. </li><li> Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop mit einer vollständigen Klimakammer oder inszenieren oberen Kammer bietet 5% CO 2 in der Luft. Vorwärmen des Mikroskoptisches auf 37 ° C für mindestens 1 Stunde vor der Bilderzeugung. Dies hilft, Probe Drift durch Erweiterung der Bühne Komponenten zu vermeiden, wie sie aufzuwärmen. </li><li> Bereiten Sie eine Multi-Positions-Satz über die Steuerungssoftware des Mikroskops, so dass man schnell und einfach zu zentrieren auf der Mitte einer jeden Kultur die Einrichtung eines Versuchst. </li></ol> 2. Vorgehen <ol><li> Kamerad die Mäuse und bezeichnen den ersten Tag post coitum als Tag E0.5. Am Tag E14.5, filtern das Weibchen durch Genickbruch und setzen die Körperhöhle mit einem kleinen Mittellinienschnitt, Auseinanderziehen der Haut in Richtung Kopf und Schwanz und dann schneiden die zugrunde liegende Bauchfell und läuten wieder auf beiden Seiten des Körpers. Präparieren Sie die Gebärmutter in kalte sterile PBS durch Halten mit einer Zange fest und schnippeln entlang der Mesometrium Verwendung von chirurgischen Schere. Halten Sie die Gebärmutter auf Eis, bis sie benötigt. Für eine detaillierte Beschreibung siehe Shea et al. (2007) 15. </li><li> Dissect Embryonen aus der Gebärmutter, indem zuerst die Länge der Gebärmutterwand mit chirurgischer Schere, um die Decidua freizugeben und dann sezieren die Embryonen aus der Dezidua, indem Sie sie heraus mit zwei Paaren von feinen Pinzette. Bildschirm fluoreszierenden Reporter-Expression (falls erforderlich). </li><li> Cull Embryonen durch Enthauptung vor der Dissektion. Subsequently entfernen Sie den Schwanz und Hinterbeine und dann die Vorderbeine mit einer einzigen Rasierklinge. Bewahren Gewebe zur Genotypisierung, wenn erforderlich. </li><li> Einen Einschnitt in der ventrum in einer rostro-kaudale Richtung nahe der Mittellinie. Mit Hilfe der in Schritt 1.6 beschrieben Haar-Sticks, sorgfältig zu necken entfernt die Haut vor dem Drehen des Embryo in der gleichen Zeit zugrunde liegenden Bindegewebe. Sie die Haut vollständig entfernen nicht, sondern lassen Sie es entlang der ventralen Rand weitesten vom ersten Schnitt angebracht. </li><li> Es ist wichtig, die Haut wird oben geschraubt, wie es ist dann sehr schwierig zu montieren zu lassen. Um dies zu verhindern, glätten die Haut mit Hilfe der Haar-Sticks (Hautseite nach oben) auf der Oberfläche eines trockenen Petrischale und dann schneiden Sie aus dem Embryo Stamm mit einer einzigen Rasierklinge. Die dermale Seite von der epidermalen Seite durch sorgfältige Beobachtung der Verbindung zwischen dem sezierten Gewebe und der Embryo unterscheiden, bevor der Haut entfernt werden. Die Fläche des sezierten Gewebeca. 0,5 mm 2, wenn Sezieren eines E14.5 Embryos. </li><li> Platzieren eines Abbildungs ​​Clip auf der Haut, so daß die Agarose Berühren der dermalen Seite des Gewebes. Lassen Sie für 60 Sekunden stehen gelassen und dann sorgfältig zu necken die Kanten des Gewebes an den Seiten des Clips. Kehren Sie den Clip und verwenden Sie das Haar klebt zu glätten die Haut und entfernen Sie alle Luftblasen, kümmert sich um die Oberfläche des Gewebes (in dem Bereich, der abgebildet wird), so wenig wie möglich zu berühren. </li><li> Verwenden Seide Faden, um die Haut auf die Abbildungs ​​Clip binden mit zwei einfachen Daumen Knoten auf beiden Seiten des Bildclip, so dass sie zu straffen und ziehen Sie die Haut in die Nut der Nähe der Spitze des Clips. Kehren Sie den Clip, Push innerhalb des Abbildungseinsatz und in der Basis. Füllen des Einsatzes mit ~ 5 ml Kulturmedium (siehe Schritt 1.2). Abbildung 1 beschreibt den Aufbau der Abbildungskammer. </li><li> Wiederholen Protokoll für die verbleibenden 5 Proben. </li></ol> 3. LebenImaging <ol><li> Die Abbildungskammer hat die gleichen Abmessungen wie ein Standard-6-Well-Platte. Verwenden Sie eine geeignete Platteneinsatz, um die Kammer auf der Bühne des konfokalen Mikroskops befestigen. </li><li> Eine automatisierte Stufe ist mit Bild die Kulturen parallel erforderlich. Definieren Sie die sechs Positionen, um Bild in der konfokalen Software. Die genauen Einstellungen werden auf der Fähigkeit des verwendeten Mikroskops ab. Typischerweise ein kleiner Z-Stapel (3-5 z-Positionen, für jede Stufe Drift zu berücksichtigen) ist in jedem der 6-Stellung verwendet wird und eine z-Stapel wird alle 2 min für 18-24 h erfasst. Für Live-Abbildungsanwendungen in der Regel ist es vorteilhaft, eine größere als optisch optimale Lochblende Einstellung verwenden, um Laserleistung und die Anzahl von Z-Profilen zu reduzieren. </li></ol>

<ol>
	<li>Thomas, A. J., Erickson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+making+of+a+melanocyte:+the+specification+of+melanoblasts+from+the+neural+crest.">The making of a melanocyte: the specification of melanoblasts from the neural crest.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 21 (6), 598-610 (2008).</li><li>Mayer, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+migratory+pathway+of+neural+crest+cells+into+the+skin+of+mouse+embryos.">The migratory pathway of neural crest cells into the skin of mouse embryos.</a> Developmental Biology. 34 (1), 39-46 (1973).</li><li>Kashiwagi, M., Huh, N., Turksen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+Culture+of+Developing+Mouse+Skin+and+Its+Application+for+Molecular+Mechanistic+Studies+of+Morphogenesis.">Organ Culture of Developing Mouse Skin and Its Application for Molecular Mechanistic Studies of Morphogenesis.</a> Epidermal Cells: Methods and Protocols. 289, 39-45 (2005).</li><li>Kashiwagi, M., Kuroki, T., Huh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+inhibition+of+hair+follicle+formation+by+epidermal+growth+factor+in+an+organ+culture+of+developing+mouse+skin.">Specific inhibition of hair follicle formation by epidermal growth factor in an organ culture of developing mouse skin.</a> Developmental Biology. 189 (1), 22-32 (1997).</li><li>Van Der Wel, L. I., Wei, L., Prens, E. P., Laman, J. D., Companjen, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+ex+vivo+skin+organ+culture+system+for+functional+studies.">A modified ex vivo skin organ culture system for functional studies.</a> Archives of Dermatological Research. 293 (4), 184-190 (2001).</li><li>Mort, R. L., Hay, L., Jackson, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+live+imaging+of+melanoblast+migration+in+embryonic+mouse+skin.">Ex vivo live imaging of melanoblast migration in embryonic mouse skin.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 23 (2), 299-301 (2010).</li><li>Jordan, S. A. A., Jackson, I. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MGF+(KIT+ligand)+is+a+chemokinetic+factor+for+melanoblast+migration+into+hair+follicles.">MGF (KIT ligand) is a chemokinetic factor for melanoblast migration into hair follicles.</a> Developmental Biology. 225 (2), 424-436 (2000).</li><li>Delmas, V., Martinozzi, S., Bourgeois, Y., Holzenberger, M., Larue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-mediated+recombination+in+the+skin+melanocyte+lineage.">Cre-mediated recombination in the skin melanocyte lineage.</a> Genesis. 36 (2), 73-80 (2003).</li><li>Srinivas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1 (1), (2001).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac1+Drives+Melanoblast+Organization+during+Mouse+Development+by+Orchestrating+Pseudopod.">Rac1 Drives Melanoblast Organization during Mouse Development by Orchestrating Pseudopod.</a> Driven Motility and Cell-Cycle Progression. Developmental Cell. 21 (4), 722-734 (2011).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+Mutant+NRas(Q61K)+Drives+Aberrant+Melanocyte+Signaling,+Survival,+and+Invasiveness+via+a+Rac1-Dependent+Mechanism.">Activated Mutant NRas(Q61K) Drives Aberrant Melanocyte Signaling, Survival, and Invasiveness via a Rac1-Dependent Mechanism.</a> The Journal of Investigative Dermatology. , 1-12 (2012).</li><li>Schachtner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+inducible+Lifeact+expression+allows+visualization+of+actin+dynamics+in+vivo+and+ex+vivo.">Tissue inducible Lifeact expression allows visualization of actin dynamics in vivo and ex vivo.</a> European Journal of Cell Biology. 91 (11-12), 923-929 (2012).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fascin+1+is+transiently+expressed+in+mouse+melanoblasts+during+development+and+promotes+migration+and+proliferation.">Fascin 1 is transiently expressed in mouse melanoblasts during development and promotes migration and proliferation.</a> Development. 140 (10), 2203-2211 (2013).</li><li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase.">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li><li>Shea, K., Geijsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+6.5+dpc+mouse+embryos.">Dissection of 6.5 dpc mouse embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (2), (2007).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Wir beschreiben ein Verfahren zur Kultur embryonaler Haut, die Besonderheit zugänglich Live-Cell-Imaging auf invertierten konfokalen Mikroskopen ist. Das Verfahren umfasst die jüngsten Verbesserungen, die sechs Kulturen parallel abgebildet werden und beseitigt die Abhängigkeit von Matrigel und Nuclepore Membranen der ursprünglichen Methode 6 ermöglichen. Der entscheidende technische Unterschied von ähnlichen Techniken ist die Verwendung einer gasdurchlässigen Membran lummox, eine Luftschnittstelle Flü...

Traditionell embryonalen Haut durch Sezieren von der Maus Embryo und die Montage auf einem Polycarbonat Nuclepore Membran kultiviert. Die Membran wird dann auf Kulturmedium schwimmen, damit die Aufrechterhaltung eines Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche auf der Oberfläche der Entwicklungs Gewebe 3,4. Diese Technik wurde verwendet, um Melanoblasten Verhalten durch Fixieren des Gewebes und der Beurteilung Melanoblasten Verteilung mit β-Galactosidase als Markierungs 7 testen. Wir haben eine Methode, die Live-Imaging von fluoreszenzmarkierten Melanoblasten in ex vivo Hautkultur 6 ermöglicht. Hier beschreiben wir die Methode im Detail von der Dissektion zu gründen, um die konfokale Bildgebung und umfassen einige der jüngsten Verbesserungen. Melanoblasten sind die embryonalen Vorstufen der Melanozyten, die Zellen, die Pigment im Haar und Haut. Melanoblasten entstehen in der Neuralleiste neben dem Neuralrohr bei rund embryonalen Tag 9 (E9) in der Entwicklung von e-Mausmbryo. Anschließend wandern sie entlang einer dorsolateralen Weg zwischen Ektoderm und den Entwicklungs Somiten. Bei E12.5 sie aus der Dermis zu bewegen, um die Epidermis, wo sie sich vermehren und setzen ihre Migration. Der primäre Haarfollikel Muster beginnt in der Epidermis bei E14.5 und E15.5 durch Melanoblasten werden, um die Lokalisierung dieser Follikel zu bilden. Für einen Überblick über Melanoblasten / Melanozyten-Entwicklung zu sehen Thomas &amp; Erickson (2008) ein. Um die Bevölkerung Melanoblasten beschriften wir Tyr kombiniert :: CREB Tiere, die Cre-Rekombinase-von der Maus Tyrosinase-Promotor mit 8 R26YFPR Tiere, die gelb fluoreszierendes Protein (YFP) bedingt von der ROSA26 Locus 9 auszudrücken angetrieben auszudrücken. Wir beschreiben ein Verfahren zur Kultur embryonaler Haut und die Aufnahmen mit einem inversen konfokalen Mikroskop. Es wird in der Form angepasst Mort et al ursprünglichen Methode. (2010) 6. Die vorliegendeVerfahren ermöglicht die Abbildung in einer 6-Well-Format und entfernt die Abhängigkeit von Nuclepore Membranen und auf Matrigel, um die Kultur zu unterstützen. Statt mit einem kleinen Block von 1% Agarose, um die embryonale Haut zu stabilisieren. Entfernen der Abhängigkeit von Matrigel ist besonders in Situationen, in denen die Reaktion der embryonalen Haut löslichen Wachstumsfaktoren im Mittelpunkt der Untersuchung wichtig. Unsere ursprüngliche Methode wurde bereits verwendet worden, um neue Einblicke in die Entwicklung Melanoblasten 10-13 zu gewinnen, und wir erwarten, dass die Verbesserungen, die wir hier beschreiben, wird es stärker als experimentelle Technik vor allem, wenn mehrere parallele Kulturen sind eine Voraussetzung zu machen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM high glucose</td>
			<td style="width:132px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:119px;">F0475</td>
			<td style="width:167px;">without phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Streptomycin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:132px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutamax</td>
			<td style="width:132px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Live imaging chamber</td>
			<td style="width:132px;">Custom made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lummox dishes</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">94.6077.410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">6-well plate</td>
			<td style="width:132px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">657-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Single edged razor blade</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1244-3170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:132px;">Biogene</td>
			<td style="width:119px;">300-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fine pastette</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kebab skewers</td>
			<td style="width:132px;">Waitrose</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Bamboo BBQ skewers 30cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Toothbrush</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:132px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">633185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Suture thread</td>
			<td style="width:132px;">Look</td>
			<td style="width:119px;">SP115</td>
			<td>Black silk suture thread</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of mouse embryonic skin and live-imaging of melanoblast migration

Melanoblasten sind die Neuralleiste Vorläufer von Melanozyten; die Zellen zur Herstellung des Pigments in Haut-und Haar verantwortlich. Melanoblasten wandern durch die Epidermis des Embryos, wo sie anschließend besiedeln die Entwicklungs Haarfollikel 1,2. Neuralleiste Zellmigration wird weitgehend in vitro untersucht, aber in vivo-Methoden sind immer noch nicht gut entwickelt, vor allem in Säugetiersystemen. Eine Alternative ist die ex vivo organotypischen Kultur 6.3 zu verwenden. Kultur von embryonalen Maus-Haut erfordert die Aufrechterhaltung eines Luft-Flüssigkeits-Interface (ALI) über die Oberfläche des Gewebes 3,6. Hochauflösende Live-Bildgebung von embryonalen Maus-Haut hat sich durch den Mangel an einer guten Methode, die nicht nur unterhält diese ALI, sondern ermöglicht auch die Kultur umgekehrt werden und daher mit kurzen Arbeitsabstand und die meisten Objektive konfokalen Mikroskopen behindert. Dieser Artikel beschreibt die jüngsten Verbesserungen an einen Method dass verwendet eine gasdurchlässige Membran, diese Probleme zu überwinden und hochauflösenden konfokalen Imaging der embryonalen Haut in Ex-vivo-Kultur 6. Durch die Verwendung eines spezifischen Melanoblasten Cre-Rekombinase exprimierenden Mauslinie in Kombination mit der R26YFPR Reporter Linie sind wir in der Lage, innerhalb dieser Hautkulturen fluoreszenz beschriften Sie die Melanoblasten Bevölkerung. Die Technik ermöglicht Live-Bildgebung von Melanoblasten und der Beobachtung ihres Verhaltens und ihrer Wechselwirkungen mit dem Gewebe, in dem sie sich entwickeln. Repräsentative Ergebnisse sind enthalten, um die Fähigkeit zu leben-Bild 6 Kulturen parallel zu demonstrieren.

Abbildung 2 zeigt repräsentative Ergebnisse aus einer Zeitraffer-Experiment mit embryonalen Haut von Tyr :: CREB x R26YFPR Embryonen E14.5. 6 embryonale Hautkulturen wurden durch konfokale Mikroskopie 18 Stunden abgebildet alle 2 min. Die Freeware-Bildanalyse-Software ImageJ wurde verwendet, um das Verhalten der YFP-markierte Melanoblasten in den sechs Filmen zu analysieren. Die Melanoblasten waren mit der wrMTrck Plugin von Jesper Pedersen entwickelt Søndergaard (automatisch verfolgt <a href...

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Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Wir beschreiben die Dissektion und Ex-vivo-Kultur von embryonalen Maus-Haut. Das Kultursystem unterhält eine Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche über die Gewebeoberfläche und ermöglicht die Abbildung auf einem inversen Mikroskop. Melanoblasten eine Komponente der Entwicklungs Haut, fluoreszierend markiert damit ihr Verhalten unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie beobachtet werden.

Ex-vivo-Kultur von embryonalen Maus-Haut-und-Live-Darstellung von Migration Melanoblasten

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

12.5K Aufrufe.  University of Edinburgh.  Wir beschreiben die Dissektion und Ex-vivo-Kultur von embryonalen Maus-Haut. Das Kultursystem unterhält eine Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche über die Gewebeoberfläche und ermöglicht die Abbildung auf einem inversen Mikroskop. Melanoblasten eine Komponente der Entwicklungs Haut, fluoreszierend markiert damit ihr Verhalten unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie beobachtet werden. 

Serie: Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Method for Culture of Early Hühnerembryonen ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Forschung

Biologie

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Live-Imaging von Gliazellen Migration in der Drosophila Eye Imaginalscheibe

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Live-Bildgebung Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migrationen

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In-vivo-Imaging und therapeutische Behandlungen in einem orthotopen Mausmodell des Eierstockkrebs

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

Isolierung und Kultivierung von Zellen aus dem Nephrogene Zone der embryonalen Maus Niere

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and uterine carcinomas, where death rates have fallen in recent years, ovarian cancer cure rates have remained relatively unchanged over the past two decades 1. This is largely due to the lack of appropriate screening tools for detection of early stage disease where surgery and chemotherapy are most effective 2, 3. As a result, most patients present with advanced stage disease and diffuse abdominal involvement. This is further complicated by the fact that ovarian cancer is a heterogeneous disease with multiple histologic subtypes 4, 5. Serous ovarian carcinoma (SOC) is the most common and aggressive subtype and the form most often associated with mutations in the BRCA genes. Current experimental models in this field involve the use of cancer cell lines and mouse models to better understand the initiating genetic events and pathogenesis of disease 6, 7. Recently, the fallopian tube has emerged as a novel site for the origin of SOC, with the fallopian tube (FT) secretory epithelial cell (FTSEC) as the proposed cell of origin 8, 9. There are currently no cell lines or culture systems available to study the FT epithelium or the FTSEC. Here we describe a novel ex vivo culture system where primary human FT epithelial cells are cultured in a manner that preserves their architecture, polarity, immunophenotype, and response to physiologic and genotoxic stressors. This ex vivo model provides a useful tool for the study of SOC, allowing a better understanding of how tumors can arise from this tissue, and the mechanisms involved in tumor initiation and progression.

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

The fallopian tube (FT) is emerging as an alternative site of origin for serous ovarian carcinoma (SOC). This protocol describes a novel method for the isolation and ex vivo culture of fallopian tube epithelial cells. This system recapitulates the in vivo epithelium and allows the study of SOC pathogenesis.

Ex vivo-Kultur von primären humanen Eileiter Epithelzellen

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Ein System für<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultivierung von embryonalen Pankreas

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur Verfahren zur embryonalen Maus Herz

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.