Dieses Protokoll ermöglicht die effiziente Isolierung und Kultur von Maus-RPE-Zellen. Gesunde primäre Maus RPE-Kulturen sind wertvolle Modelle, um die Mechanismen der zugrunde liegenden Augenerkrankungen zu verstehen. Konfluente und lebensfähige RPE-Kulturen erhalten innerhalb von drei Tagen und können wochenlang angebaut werden.
Dieses Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um die Mechanismen zu verstehen, die der frühaltersbedingten Makuladegeneration zugrunde liegen, die die Hauptursache für Blindheit bei älteren Menschen in den industrieländern Ländern ist. Es ist wichtig, die Sezierschritte zu visualisieren. Details sind entscheidend für den Erfolg des Protokolls, zum Beispiel, wie man mit den Augäpfeln umgeht, damit die Sklera nicht gestanzt wird, wo genau Schnitte durchgeführt werden sollten, und wie man die Augenmuscheln in Trypsin einbettet, damit sie offen bleiben.
Beginnen Sie mit der Vorbereitung aller notwendigen Reagenzien für das Protokoll. Dann beginnen Sie, den Augapfel zu reinigen, indem Sie sorgfältig alle Bindegewebe, Blut und Muskeln entfernen, mit Dumont Nummer fünf Zangen und abgewinkelte Schere, ohne irgendwelche Schnitte in der Sklera zu machen. Übertragen Sie den Augapfel regelmäßig auf ein frisches Gericht mit drei MilliliterHEPES-freiem HBSS-Puffer, um das Auge frisch und sauber zu halten und Verunreinigungen zu vermeiden.
Verwenden Sie den Sehnerv als Griff, um den Augapfel zu halten und ein Loch in der Mitte der Hornhaut mit einer scharfen Kohlenstoffstahl-Nummer 11 Klinge zu machen. Machen Sie drei Einschnitte in der Hornhaut durch das Loch mit Dumont Nummer fünf Schere, um sicherzustellen, dass es genügend Platz, um die Linse zu entfernen. Halten Sie den Sehnerv und üben Sie leichten Druck auf die Ora serrata mit der Basis der abgewinkelten Schere, bis die Linse vollständig herauskommt.
Halten Sie das Irisepithel intakt, um die Ablösung der neuronalen Netzhaut und RPE während der Inkubation zu verhindern. Legen Sie das Auge in HEPES-freien HBSS-Puffer. Inkubieren Sie die Augen ohne Linsen in Hyaluronidase-Lösung bei 37 Grad Celsius für 45 Minuten in einem 5%Kohlendioxid-belüfteten Inkubator, um die neuronale Netzhaut vom RPE zu lösen.
Legen Sie jedes Auge in einen neuen Brunnen mit 1,5 Milliliter kaltem HBSS HEPES Puffer pro Brunnen und inkubieren Sie es auf Eis für 30 Minuten. Nach dem Waschen jedes Auge in ein 35-Millimeter-Kulturgericht mit frischem HBSS HEPES Puffer geben. Schneiden Sie die Hornhaut durch die ursprünglichen Schnitte mit acht Zentimeter Vannas Schere, bis die Ora serrata erreicht ist, dann unter die Ora serrata geschnitten, um die Iris Epithel und Hornhaut zu entfernen.
Halten Sie die Ora serrata mit gekrümmter Pinzette und mit abgewinkelten Mikrozangen, ziehen Sie die neuronale Netzhaut weg, um sicherzustellen, dass die RPE-Schicht nicht geschnitten wird. Schneiden Sie dann die innere Befestigung am Sehnerv. Schneiden Sie den Sehnerv und übertragen Sie jede Augentasse auf eine andere 12 Wellplatte mit 1,5 Milliliter frisches Trypsin-EDTA pro Brunnen.
Stellen Sie sicher, dass die Augenbecher geöffnet bleiben und vollständig in das Trypsin eingetaucht sind. Inkubieren Sie die Augenbecher bei 37 Grad Celsius für 45 Minuten in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator. Sammeln Sie jede Augentasse zusammen mit allen RPE-Platten, die während der Trypsin-Inkubation abgelöst wurden, und übertragen Sie sie in eine 12-Well-Platte mit 1,5 Milliliter FBS-Lösung pro Brunnen.
Wenn RPE-Platten in der Trypsin-Lösung verbleiben, verwenden Sie eine Mikropipette, um sie mit fbS-Lösung in den Brunnen zu übertragen. Halten Sie jeden Augenbecher am Sehnerv fest und schütteln Sie ihn mit dem Gesicht nach unten in die 12-Well-Platte mit 1,5 Millilitern 20%FBS im HBSS HEPES Puffer, bis eine vollständige Ablösung der RPE-Platten erreicht ist. Sammeln Sie alle RPE-Platten und RPE-Cluster mit einer Mikropipette, vermeidung von weißen Stücken von Sklera oder Aderhaut, die die Kulturen kontaminieren könnten, und legen Sie sie in einem 15 Milliliter Rohr.
Ziehen Sie zwei Augen von der gleichen Maus in einem Rohr. Dann zentrifugieren Sie das RPE-Gemisch bei 340 x g für zwei Minuten bei Raumtemperatur und entsorgen Sie den Überstand. Setzen Sie das RPE-Pellet vorsichtig in einer Ein-Milliliter-Mischung aus 0,25%trypsin-EDTA aus und inkubieren Sie es eine Minute lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius, um die RPE-Blätter in einzelne Zellen zu zerlegen.
Dann sanft Pipette nach oben und unten 10 Mal, Vermeidung von Blasenbildung. Fügen Sie neun Milliliter frisch zubereitetes RPE-Medium hinzu, um das Trypsin zu verdünnen und das Gemisch bei 340 x g für zwei Minuten bei Raumtemperatur zu zentrieren. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet vorsichtig in 150 Mikroliter RPE Medium mit 5%FBS wieder auf.
Als nächstes entfernen Sie PBS aus der unteren Kammer des zuvor vorbereiteten lamininbeschichteten Membraneinsatzes und fügen 700 Mikroliter RPE-Medium dazu. Entfernen Sie das Laminin aus der oberen Kammer des Membraneinsatzes und verteilen Sie die RPE-Zellsuspension tropfenweise und gleichmäßig auf die Mitte der Kammer. Legen Sie den Membraneinsatz mindestens 24 Stunden lang ungestört in einen 5% Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius.
Überprüfen Sie dann den Membraneinsatz unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die meisten RPE-Zellen am Einsatz befestigt sind und der Zusammenfluss mindestens 50% Ist, ändern Sie das Medium während der ersten 72 Stunden nicht. RPE-Zellen, die mit diesem Protokoll isoliert wurden, zeigten die typische RPE-Größe, Morphologie und Pigmentierung. Eine hochpolarisierte RPE-Monoschicht mit zwei Kernen, die durch enge Kreuzungen verbunden sind, zusammen mit dem Vorhandensein von apikalen Mikrovilli und Basalfalten, wurde nach einer Woche beobachtet.
Die Polarisation der RPE-Monoschicht wurde durch TER-Werte bestätigt, wobei der Durchschnitt über 200 Ohm Zentimeter quadratisch lag, der im Laufe der Zeit stabil blieb. Bei Phagozytose-Assays, die auf FITC-markierten Rinder-POS durchgeführt wurden, wurde die Verschluckung und Verdauung von POS beobachtet, was auf die Bildung einer funktionellen konfluenten Monoschicht von RPE-Zellen hindeutet. Lebensfähige Kulturen benötigen eine kurze Sezierzeit, die mit Erfahrung erreicht wird.
Einige RPE-Zellen können an der neuronalen Netzhaut befestigt bleiben, aber wenn mehrere RPE-Blätter befestigt bleiben, wird das Protokoll nicht erfolgreich sein. Frische Hyaluronidase muss jedes Mal verwendet werden, um dieses Problem zu verhindern. Diese funktionellen primären Maus RPE Zellkulturen sind ein wertvolles Werkzeug, um die Pathobiologie des RPE bei vielen Augenerkrankungen zu studieren.
Dieses Protokoll ermöglichte es beispielsweise, die Pathobiologie des RPE in einem Mausmodell der Makuladegeneration zu untersuchen.
