Wir möchten die Finanzierung von den National Institutes of Health (R15 GM065444-03 bis LB) und die Interne Research Program des National Institutes of Health (NIH) und dem National Institute of Diabetes and Digestive und Nierenkrankheiten (KO) zu bestätigen. Eine NSF award (DBI-0923402) finanzierte die Übernahme der LSM700 konfokalen Mikroskop. Wir möchten auch um allgemeine Unterstützung und hilfreiche Anmerkungen zum Manuskript von Dr. Andy Goldene anzuerkennen. Kredit geht an das gesamte C. elegans-Community für den Austausch von Ressourcen, Protokolle und Ideen.

1. Nematode Kulturen <ol><li> Besorgen Sie sich die entsprechende C. elegans Stamm aus der Caenorhabditis Genetics Stock Center (CGC) oder von einem Kollegen. </li><li> Wachsen Nematoden auf NGM-Agar-Platten mit einem OP50 Bakterienrasen (3) ausgesät. Für die Analyse der GFP-Stämme Wachstum bei 25 ° C empfohlen. </li><li> Der Tag vor Ihrer Mikroskopie Experiment, Pick mindestens 40 L4-Larven auf ausgesät Platten und legen die Platten bei 25 ° C über Nacht. Diese Würmer werden junge Erwachsene für das Experiment werden. </li></ol> 2. Injektionen Wenn es wünschenswert, Strukturen wie Lysosomen oder Mitochondrien Ansicht ist, können Erwachsene mit Fluoreszenzfarbstoff injiziert werden, bevor Visualisierung. <ol><li> Bereiten Sie getrocknete Agarose Injektion Pads. (Dies kann man viele Tage vorher getan werden) <ol><li> Bereiten geschmolzenen 2% Agarose in Wasser. Mit einer Pasteurpipette legen 2 Tropfen auf einen 22X54 mm Deckglas. Stellen Sie ein weiteres Deckglas kreuzweise auf der Oberseite des Drop. Um die richtige Dicke zu erreichen, auf der obersten Deckglas drücken, bis der Durchmesser des Pads ist ca. 1,5 cm. Lassen Sie sitzen für 5-10 Minuten. </li><li> Entfernen Sie die obere Deckglas. Entwässern der Agarose-Pad, indem Sie es in einem 80 ° C im Ofen für 1 Stunde oder lassen auf dem Labortisch über Nacht sitzen. </li></ol></li><li> Bereiten Mitotracker oder LysoTracker Lösung. <ol><li> Verdünnen fluoreszierendes Mittel in Egg Buffer. Wir verwenden in der Regel eine 1:10 Verdünnung der Mitotracker oder LysoTracker. </li><li> Die Injektionsnadel wird von einem 1,2 OD Glaskapillare gemacht. Ziehen Sie die Injektionsnadel mit einer Nadel Abzieher. </li><li> Verwenden Sie einen zog Pastuer Pipette wieder füllen die Nadel mit dem verdünnten Farbstoff. </li><li> Legen Sie die Nadel im Licht-frei, feuchten Kammer bis zur Verwendung. </li></ol></li><li> Pre-Injection: Einrichten des Mikroskops und Nadel. <ol><li> Berg Injektionsnadel auf Injektionsgeräts. Unser Gerät ist ein Narishige Direktantrieb Mikromanipulator auf die Bühne eines Nikon TE200 inversen Mikroskop mit DIC Imaging-Fähigkeit ausgestattet, montiert. </li><li> Schließen Sie die Nadel auf einer 1,2 mm ID Schlauch, der an den Druckregler angeschlossen ist. Entweder Druckluft oder Stickstoff kann als externe Druckquelle verwendet werden. Stellen Sie den Regler auf 20-25 psi. </li><li> Geben Sie 2 Tropfen schweres Mineralöl (Parafin-Öl) auf die Injektion Pad. </li><li> Ort der Injektion Pad auf das Mikroskop und senken Sie die Nadel in das Öl. Prüfen Sie, ob Flüssigkeit fließt frei machen von der Nadel, wenn Druck ausgeübt wird. Bewerben Einspritzdruck und beobachten, ob Flüssigkeit fließt der Nadel. Wenn nicht, müssen Sie vorsichtig brechen das Ende der Nadel. Die Nadel kann durch vorsichtiges Fahren die Spitze in ein kleines bisschen gebrochen Deckglas auf die Injektion Pad gelegt gebrochen werden. Nachdem die Nadel fließt, an den nächsten Schritt. </li></ol></li><li> Injection. <ol><li> Etwa 1 Stunde vor dem Betrachten Embryonen, Übertragung jungen erwachsenen Würmer in den Öltropfen auf der Injektion Pad. Führen Sie diesen Transfer mit dem Binokular. Verwenden Sie einen Platindraht Wurm holen mit einer Spitze für die Übertragung von Würmern. </li><li> Vereinbaren von 3 bis 10 Würmer, so dass sie direkt liegend auf dem Pad. Für die Injektion ist es am einfachsten, wenn die Würmer sind parallel zueinander ausgekleidet und ein wenig weniger als ein Wurm Länge auseinander. Sobald die Würmer auf der Injektion Pad, ist es wichtig, schnell zu arbeiten und füllen Sie das Injektionsverfahren, bevor die Würmer vor Austrocknung sterben. </li><li> Legen Sie die Deckgläser mit Würmern auf dem Mikroskoptisch der Injektion Mikroskop. Schwerpunkt in den mittleren Teil (Rhachis) des distalen Gonaden Röhre. Dann nutzen Sie die Mikromanipulator an die Spitze der Nadel in der gleichen Bildebene zu bewegen. Bewegen Sie die Bühne horizontal, so dass der Wurm durch die Nadel beschädigt ist. Sobald die Spitze der Nadel ist im Inneren der Spindel, Druck auszuüben und damit die Gonade mit dem Farbstoff-Mischung füllen. Inject sowohl Gonade Arme aller Würmer auf der Injektion Pad. </li><li> Nach der Injektion einen zog Pasteur-Pipette auf etwa 0,5 ml Egg Buffer, um die Würmer zu liefern. Dies wird ihnen vor dem Tod der Austrocknung zu halten und es ihnen ermöglichen, von der Injektion zu erholen. </li><li> Lassen Sie die Würmer für 1-2 Stunden bei Raumtemperatur in ein Licht-frei, Feuchtekammer erholen. </li></ol></li></ol> 3. Agarose-Pad für die Anzeige von Embryonen <ol><li> Bereiten geschmolzenen 2% Agarose in Egg Buffer. </li><li> Mit einer Pasteur-Pipette, legte 3 Tropfen geschmolzenen Agarose auf einen sauberen Objektträger. </li><li> Legen Sie gleiten zwischen zwei anderen Folien, die eine Schicht Kennzeichnung Klebeband auf sie haben. Diese dienen als Abstandhalter, die sicherstellen, dass Ihre Agarose-Pad die richtige Dicke wird. </li><li> Legen Sie einen zweiten sauberen Objektträger senkrecht nach unten auf die Agarose Tropfen. Drücken Sie nach unten, bis Oberschlitten ruht auf dem Band von Führungsschlitten. </li><li> Kurz bevor Sie bereit sind, Embryonen für die Beobachtung montiert sind, entfernen Sie die obere Folie. </li></ol><ol><li> Wenn Würmer nicht gespritzt haben, folgen die nächsten beiden Schritte. Andernfalls überspringen. <ol><li> Wählen Sie jungen erwachsenen Würmer von der Platte, die am Tag zuvor vorbereitet wurde. Sie sollten in der Lage sein Embryonen innerhalb der jungen Erwachsenen zu sehen. </li><li> Wählen 5-20 Würmer auf eine ungesetzte NGM Platte. Lassen Sie die Würmer kriechen auf der ungesetzte Platte für ein paar Minuten, so dass die Würmer die meisten der Bakterien, die ihnen stecken wird verlieren. </li></ol></li><li> Erhalten junge Embryonen aus adulten Würmern <ol><li> Legen Sie ein 5-20 ul Tropfen Egg Buffer in der Mitte eines 18 mm 2 Glas Deckglas (a Deckglas Dicke von 1,5 vorzuziehen ist). </li><li> Bewegen Sie Würmer aus der ungesetzte Platte oder Injektion Pad in die Tropfen Egg Buffer. </li><li> Aufschneiden Würmer mit einer 26 Gauge Kanüle. Schneiden Sie den Wurm in der Nähe der Vulva. Sie sollten sehen, Embryonen austreten des Wurms. </li></ol></li><li> Berg auf Objektträger <ol><li> Kehren Sie die Objektträger, die mit der Agarose-Pad vorbereitet war und senken Sie es auf das Deckglas mit Embryonen. </li><li> Wenn erweiterte Zeitraffer erforderlich ist, verwenden Vaseline auf die Ränder der Deckgläser Dichtung Austrocknung zu verhindern. </li></ol></li></ol> 5. Mikroskopie <ol><li> Das Finden der geeigneten Embryonen. <ol><li> Legen Sie gleiten auf Mikroskoptisch. Scan mit 10X-Objektiv von Embryonen zu finden. </li><li> Um Embryonen im Frühstadium, Suche nach Embryonen, die in den Prozess der Vollendung mütterlichen Meiose sind. Meiotische Embryonen aus späteren Embryonen unterschieden werden, weil sie nicht eine Verkürzung erfahren haben. (Nach Embryonen Meiose abgeschlossen haben, können Sie eine deutliche Lücke zwischen der Zellmembran und die Eierschale am vorderen Ende.) </li><li> Sobald Sie festgestellt haben einen entsprechend inszeniert Embryo, Umzug in ein höherer Vergrößerung Objektiv für die Aufnahme der Embryogenese. </li></ol></li><li> Imaging <ol><li> In diesem Beispiel werden wir vorstellen, dass die Embryonen mCherry auszudrücken: H2B und GFP:: Ub markierten Proteine. Wir sind mit dem Zeiss LSM700 konventionellen Laser-Scanning-Mikroskop. </li><li> Bilder werden gesammelt, indem die 63X 1.4NA Linse. Die 488 und 555 Laser sind mit minimaler Laserleistung und maximale Verstärkung eingesetzt. AZ-Stack ist alle 10-15 Sekunden gesammelt. Je nach Ausmaß der Bleichen, sind zu 30-60 Zeitpunkten gesammelt. Z-Stapel Bilder werden in einer maximalen Projektion auf die Grafik für die endgültige Zeitraffer-Video zusammengebrochen. </li></ol></li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/2852/2852fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Düngung zu First Mitose in C. elegans. <img src="/files/ftp_upload/2852/2852fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Mikroinjektion Verfahren. Zusätzliche Video 1 Zeitraffer-Video der GFP:.. Ubiquitin sowie LysoTracker Blue in einer meiotischen Embryo <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2852/2852fig3.avi">Klicken Sie hier, um das Video anzusehen.</a>

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Nach der Fusion mit dem Sperma, erfährt der Zygote eine Reihe von dynamischen Ereignissen. Diese Ereignisse verwandeln die Eizelle von einer relativ statischen Zelle in der sich rasch entwickelnden Embryo. In vielen Organismen, sind zytoplasmatische Umlagerungen von entscheidender Bedeutung für Gründung embryonale Polarität und für Ei-Aktivierung. Die C. elegans Embryo bietet eine ausgezeichnete Gelegenheit zur Beobachtung dieser frühen Ereignisse des Ei-Aktivierung und Embryogenese. Der Embryo ist transparent und frühen Entwicklungsstadium Ereignissen relativ rasch nach der Befruchtung. C. elegans-Forscher haben viele nützliche transgene Stämme, fluoreszierend ausdrückliche markierten Proteine ​​in der frühen Entwicklung beteiligt generiert. Mit diesen Stämmen zusammen mit RNAi oder Mutanten bietet ein leistungsstarkes System zum Präparieren der molekularen Signalwege, die Entwicklung eines vielzelligen Organismus (5, 6, 7, 8) zugrunde liegen. Dieses Video Artikel stellt einen praktischen Ansatz für die Verwendung dieser Werkzeuge und Techniken, um Ereignisse in der frühen Embryogenese in C. Rekord elegans. Die reifen C. elegans Eizelle ist in Prophase der Meiose I festgenommen und befindet sich in der Samenblase der erwachsenen Hermaphroditen befruchtet. Nach der Befruchtung, geht die Eizelle durch den Rest der Meiose I und II. Diese Stufen können beobachtet mit fluoreszenzmarkierten Histon H2B (5) werden. Während Abschluss der mütterlichen Meiose bleibt die Spermien-DNA kondensiert (siehe Abbildung 1). Nach Abschluss der Meiose wird der mütterlichen und väterlichen DNA dekondensierten und die beiden Vorkerne bilden. Der mütterliche Vorkern wandert in Richtung der väterlichen Vorkern und sie kommen zusammen in der Nähe der Mitte des Embryos. Mitose schnell erfolgt nach pronukleären Treffen. Alle diese Ereignisse in weniger als einer Stunde. So können Zeitraffer-Mikroskopie dieser Abfolge von Ereignissen ohne weiteres durchgeführt werden. Die Durchführung dieser Technik erfordert bestimmte Anlage in Nematoden Kultivierung sowie grundlegende Kenntnisse in der Mikroskopie Neben einem konfokalen Mikroskop zugreifen. Die hier vorgestellten Beispiel nutzt eine transgene C. elegans-Stamm, zwei fluoreszierende Proteine, GFP ausdrückt: Ubiquitin und mCherry: H2B. Ein konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop wird verwendet, um die dynamische Lokalisierung der beiden Proteine ​​zu beobachten. Darüber hinaus zeigen wir, dass die Injektion von fluoreszenzmarkierten LysoTracker verwendet werden, um das Schicksal der Lysosomen in den Embryo nach der Befruchtung zu folgen. Injection eines markierten Tracker kann auch zur Visualisierung von Mitochondrien oder lokalen Kalziumkonzentration (9) durchgeführt werden. Theoretisch könnte die Injektion Protokoll verwendet, um jede Art von fluoreszenzmarkierten Moleküls in den Embryo sehen zu können. Dies könnte beschriftet kleine Moleküle, Proteine, Lipide, etc. In einigen Fällen sind, kann es nicht notwendig sein, um tatsächlich zu injizieren gekennzeichnet Tracker wie die Würmer leicht Aufnahme einige Farbstoffe wie MitoTracker (10). Allerdings haben wir versucht, sowohl Einweichen und Injektion von LysoTracker und gefunden haben viel bessere Ergebnisse mit Einspritzung für die Visualisierung in Embryonen. Technische Überlegungen: Die technischen Herausforderungen bei diesem Verfahren besprochen werden, die Mikroinjektion Technik sowie die Schwierigkeit, in der Bildgebung sehr frühen Embryonen. Bezüglich microinjections, ist die Dicke der Agarose Injektion Pad für den erfolgreichen Injektionen. Wenn das Pad zu dick ist, wird die Würmer auszutrocknen und sterben schnell. Wenn das Pad zu dünn ist, wird die Würmer nicht mit dem Pad-Stick während der Injektion Prozess. Die frühen Embryonen können empfindlich gegenüber Umwelteinflüssen wie Temperatur und Pufferbedingungen. Wildtyp-Embryonen zu initiieren Dekondensation der Spermien-DNA und pronukleären Migration innerhalb einer Minute oder so der Vollendung der Meiose II (4). Innerhalb von 20 Minuten sollte der erste Zytokinese beginnen. Wenn Embryonen zu sehr hohen Intensität des Laserstrahls ausgesetzt sind bzw. überhitzt oder zermahlen bei der Montage, kann dieser Vorgang gestört werden. Solche Embryonen werden Verhaftung Entwicklung. Wenn dies geschieht, sollte das Experiment mit verminderter Laserleistung oder eine dickere Agarose Pad wiederholt werden. C. elegans Embryonen nicht sezernieren ihre Eierschale bis kurz nach der Befruchtung. Während der kurzen Zeit zwischen der Befruchtung und die Sekretion der Eierschale sind Embryonen, die nicht außerhalb der Mutter (11) lebensfähig. Einige Labors haben diese Herausforderung durch bildgebende Embryonen in utero (5, 12) vermieden werden. In utero Imaging bietet gewisse Vorteile, wie zB die Fähigkeit, Ereignisse, die während oder kurz nach der Befruchtung auftreten zu erfassen. Allerdings erfordert diese Technik die Verwendung einer Mikroskopie-System, das für tiefe Gewebe-Imaging ermöglicht. Systeme wie Zwei-Photonen-oder Multi-Photonen sind speziell für diese (13, 14) geeignet. Bei Verwendung eines herkömmlichen Laser-Scanning-oder Spinning-Disk-konfokalen Mikroskop, die besten Bilder werden aus Embryonen gewonnen, die have wurde von den erwachsenen Wurm geschnitten wie hier beschrieben. Imaging System Überlegungen: Die Art der konfokalen Imaging-System verwendet wird, hängt die Bedürfnisse der Nutzer. Im Allgemeinen sind die Laser-Scanning-Systeme zu empfehlen, wenn man will, um Bilder mit der höchsten Auflösung möglich zu erwerben. Auf der anderen Seite sind sich drehende Scheibe Systeme besser für die Bildgebung hochdynamische Prozesse geeignet, da der Bildaufnahme ist relativ schnell und Bleichen / Phototoxizität wird reduziert. Die spezifischen bildgebenden Parameter werden in Abhängigkeit von den experimentellen Aufbau und der konfokalen Imaging-System eingesetzt werden. In mehrdimensionale Bildgebung, muss man die Anzahl der Kanäle, Fokusebenen und Zeit-Punkte gesammelt zu betrachten. Aufgrund der Begrenzung der Auswirkungen von Bleichen und Phototoxizität, kann eine endliche Anzahl von Bildern in einem bestimmten Experiment erworben werden. So, wenn Sie die Anzahl der Kanäle, die erworben werden erhöht, werden Sie wahrscheinlich benötigen, um die Anzahl der Brennebenen und / oder Zeitpunkte und umgekehrt zu reduzieren. Die Gesamtzahl der Bilder, die erworben werden können, werden durch die Intensität des Fluorophors als auch die Empfindlichkeit des konfokalen Mikroskops verwendet abgebildet beeinflusst werden. Intensivere Fluorophore und empfindlicher Instrumente erfordern kürzere Belichtungszeiten und damit weniger produzieren Bleichen und Phototoxizität. Eine große Anzahl oder Imaging-Systeme stehen zur Verfügung. Wir geben Informationen über die Systeme, die in unseren eigenen Labors verwendet wurden. Für die Bildgebung Wurm Embryonen, die durch sich drehende Scheibe konfokale Mikroskopie, verwenden wir eine Nikon TE2000U inversen Mikroskop mit einer 60X/1.4 NA Plan Apo Ziel ausgestattet. Das Mikroskop ist ein Yokogawa CSU10 Spinning-Disk-Einheit, eine Hamamatsu C9100-13 EM-CCD-Kamera und ein Spectral Angewandte Forschung LMM5 Laser Merge-Modul mit vier Festkörperlaser mit einer Leistung von 405, 491, 561 und 655 nm verbunden. Mit diesem System können wir erfassen ein oder zwei Kanäle, 6-12 Fokusebenen und 25 bis 50 Zeitpunkten (bei 30 bis 60 Sekunden-Intervallen). Eine typische Belichtungszeit ist 100 bis 200 Millisekunden. Für die Bildgebung Embryonen mit Laser-Scanning-konfokale Mikroskopie, verwenden wir ein Zeiss LSM700 mit 2 Kanälen und vier Festkörperlaser (405, 488, 555 und 635 nm) ausgestattet. Dieses System ist mit einem Zeiss Axio Observer inversen Mikroskop mit einer Plan-Apo 63X/1.4NA Ziel für Embryo Bildgebung verwendet angebracht. Das System nutzt die Zeiss ZEN-Software für die Bilderfassung, die auch begrenzte Bildverarbeitung und-analyse. Bei der Abbildung mit zwei Fluorochrome wir in der Regel zu sammeln 1-5 Fokusebenen (~ 0,5 mu m auseinander) und sammeln eine Z-Stack alle 15 Sekunden. Kollektionen werden fortgesetzt, bis signifikante photobleaching aufgetreten. Zur Erzeugung des endgültigen Zeitraffer-Video, Z-Stapel Bilder konsolidiert mit der maximalen Projektion-Werkzeug in der ZEN-Software. Videos werden von der Software als AVI-Dateien exportiert.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Zusammensetzung </th></tr><tr><td> Egg Buffer </td><td></td><td></td><td> 5 mM Hepes pH 7,2, 110mm NaCl, 4mm KCl, 5 mM Mg-Acetat, 5 mM CaCl 2 </td></tr><tr><td> Mitotracker </td><td> Invitrogen </td><td> M-7512 </td><td></td></tr><tr><td> LysoTracker </td><td> Invitrogen </td><td> L-7525 </td><td></td></tr><tr><td> Injection Kapillarpipette </td><td> Harvard Apparatus, Kent, Großbritannien </td><td> GC120F-10 </td><td></td></tr><tr><td> Needle Puller </td><td> Kopf </td><td> Modell 700C </td><td></td></tr><tr><td> Mikroinjektor Apparatus </td><td> Tritech Forschung </td><td> Minj-1 Mikroinjektion Regulator </td><td></td></tr></tbody></table>

time-lapse microscopy of early embryogenesis in caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans wurde oft als Modellsystem in Studien der frühen Entwicklungsprozessen eingesetzt. Die Transparenz der Embryonen, die genetischen Ressourcen und der relativen Leichtigkeit der Umwandlung sind Qualitäten, die C machen elegans ein hervorragendes Modell für die frühe Embryonalentwicklung. Laser-basierte konfokale Mikroskopie und fluoreszenzmarkierten tags Forschern erlauben, spezifische zelluläre Strukturen und Proteine ​​in den sich entwickelnden Embryo zu folgen. Zum Beispiel kann man folgen bestimmten Organellen, wie Lysosomen oder Mitochondrien, mit fluoreszenzmarkierten Farbstoffen. Diese Farbstoffe können zu den frühen Embryo durch Mikroinjektion werden in die Erwachsenenwelt Gonade geliefert. Auch die Lokalisierung von spezifischen Proteinen, gefolgt unter Verwendung von fluoreszierenden Protein-Tags werden. Beispiele sind hier vorgestellte Nachweis der Verwendung eines fluoreszierenden Farbstoff lysosomalen sowie fluoreszierend markierten Histon-und Ubiquitin-Proteinen. Die markierten Histon wird verwendet, um die DNA sichtbar zu machen und damit identifizieren die Phase des Zellzyklus. GFP-markierten Ubiquitin zeigt die Dynamik der ubiquitinierte Vesikel im frühen Embryo. Beobachtungen von markierten Lysosomen und GFP:: Ubiquitin kann verwendet werden, um festzustellen, ob es Kolokalisation zwischen ubiquitinierte Vesikel und Lysosomen werden. Eine Technik für die Mikroinjektion des lysosomalen Farbstoff wird vorgestellt. Techniken zur Erzeugung transgenenic Stämme werden an anderer Stelle (1, 2) vorgestellt. Für die Bildgebung sind Embryonen von erwachsenen Hermaphroditen Nematoden geschnitten und montiert auf 2% Agarose-Pads, gefolgt von Zeitraffer-Mikroskopie auf einem Standard-Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop oder eine sich drehende Scheibe konfokalen Mikroskop. Diese Methode sorgt für die hohe Auflösung Visualisierung der frühen Embryogenese.

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Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Dieser Artikel beschreibt eine Technik zur Visualisierung der frühen Ereignisse der Embryogenese in den Nematoden<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;.

Zeitraffer-Mikroskopie der frühen Embryogenese in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

time-lapse-microscopy-of-early-embryogenesis-in-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

17.8K Aufrufe.  University of Alabama in Huntsville. Dieser Artikel beschreibt eine Technik zur Visualisierung der frühen Ereignisse der Embryogenese in den Nematoden Caenorhabditis elegans.

Serie: Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Überwachung Aktin Demontage mit Zeitraffer-Mikroskopie

Forschung

Biologie

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zeitraffer-Imaging der Mitose Nach siRNA-Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

Isolation und In-vitro- Aktivierung von Caenorhabditis elegans Sperma

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

Quantitative Analyse der ungerichtete Migration von Zellen unter Verwendung Zeitraffer-Video-Mikroskopie

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Grundlegende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisation und Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

Verwendung von Zeitraffer-Mikroskopie zur Anoxie-induzierten Suspended Animation in Visualisieren<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryonen

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Prostaglandin Extraktion und Analyse in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

Messung von Sauerstoff Verbrauchsmengen in intakten Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

Spezifische Kennzeichnung von mitochondrialen Nukleoiden für die Zeitraffer-Struktur-Beleuchtungsmikroskopie

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits obesity and many associated diseases including cardiovascular disorders, type II diabetes, and cancer. To advance the current understanding of lipid metabolic regulation, quantitative methods to precisely measure in vivo lipid storage levels in time and space have become increasingly important and useful. Traditional approaches to analyze lipid storage are semi-quantitative for microscopic assessment or lacking spatio-temporal information for biochemical measurement. Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology that enables rapid and quantitative detection of lipids in live cells with a subcellular resolution. As the contrast is exploited from intrinsic molecular vibrations, SRS microscopy also permits four-dimensional tracking of lipids in live animals. In the last decade, SRS microscopy has been widely used for small molecule imaging in biomedical research and overcome the major limitations of conventional fluorescent staining and lipid extraction methods. In the laboratory, we have combined SRS microscopy with the genetic and biochemical tools available to the powerful model organism, Caenorhabditis elegans, to investigate the distribution and heterogeneity of lipid droplets across different cells and tissues and ultimately to discover novel conserved signaling pathways that modulate lipid metabolism. Here, we present the working principles and the detailed setup of the SRS microscope and provide methods for its use in quantifying lipid storage at distinct developmental timepoints of wild-type and insulin signaling deficient mutant C. elegans.

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows selective, label-free imaging of specific chemical moieties and it has been effectively employed to image lipid molecules in vivo. Here, we provide a brief introduction to the principle of SRS microscopy and describe methods for its use in imaging lipid storage in Caenorhabditis elegans.

Markierungsfreie Bildgebung der Lipidspeicherdynamik in Caenorhabditis elegans mit stimulierter Raman-Streumikroskopie

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...