Autoren möchten MICINN (PTA Programm unterstützt Montserrat Porta de la Riva), AGAUR (Promotionsstipendium an Laura Fontrodona), Instituto de Salud Carlos III (Miguel Servet Programm zur Unterstützung Julián Cerón) und Marie-Curie-IRG, ISCIII und IDIBELL für die Finanzierung anerkennen das Labor.

1. Ein Protokoll: Kultivieren Worms zum Bleichen 11 Große Populationen von C. elegans durch Kultivierung von ihnen gewonnen werden, entweder in flüssigen Medien oder auf festen Medien in Platten. Sie sind meist auf festem NGM (Nematode Growth Media) und gefüttert mit E. gewachsen coli-Bakterien, die zu den Platten entweder lebend oder tot (getötet von UV 12, 13 oder durch Hitze durch Kälte 14) hinzugefügt wird. Das häufigste Verfahren nutzt Live-OP50 E. coli, die einen Defekt in der Synthese von Uracil ist und nicht in eine dicke Schicht, die Würmer verschleiern würden überwachsen. <ol><li> Mix 3 g NaCl, 17 g Agar-Agar und 2,5 g Pepton und fügen Sie 975 ml H 2 O. Autoklavieren für 50 min. </li><li> Kühlen Sie den Kolben auf 55 ° C </li><li> 1 ml 1 M CaCl 2, 1 ml 5 mg / ml Cholesterin in Ethanol, 1 ml 1 M MgSO 4 und 25 ml 1 M KPO 4-Puffer (alle von ihnen aber zuvor Cholesterin Autoklaved). </li><li> Mit einer sterilen Verfahren verzichten die NGM-Lösung in Petrischalen, füllen Platten bis zu 2/3 ihres Volumens. </li><li> Nach dem Trocknen ist es ratsam, Platten bei Raumtemperatur stehen lassen für 2-3 Tage vor der Verwendung zum Nachweis von Verunreinigungen. Bereiten Sie einen Streifen von OP50 E. coli aus einem Glycerin-Lager (OP50 kann aus dem Caenorhabditis Genetics Center bezogen werden). </li><li> Wählen Sie eine einzelne Kolonie wachsen und es in LB über Nacht bei 37 ° C unter Rühren. </li><li> Überschüssige Feuchtigkeit von den Platten durch Entfernen des Deckels in der laminaren Strömung eingedampft, und OP50 zum Zentrum der Platten mit einer sterilen Pasteur-Pipette. </li><li> Lassen Sie das OP50 E. coli Rasen wachsen bei Raumtemperatur oder bei 37 ° C über Nacht für 8 Stunden. </li><li> Fügen Sie die gewünschte Menge der Würmer an den Platten (wenn bei 37 ° C Platten sollten bei Raumtemperatur vor dem Gebrauch gekühlt werden). </li></ol> TIPPS: <ul><li> Das Ausgießen der gleichen Anzahl der Medienin den Platten mit einer Pipette oder einem Pumpspender sorgt für die gleiche Menge an Agar zu den Platten und erleichtert die Verlagerung der Platte ohne Notwendigkeit, die Stereomikroskop neu auszurichten. </li><li> Die Platten (beide entkernt und ungesetzte mit Bakterien) können mehrere Wochen nach der Zubereitung verwendet werden, wenn in einem Behälter bei Raumtemperatur oder 4 ° C gelagert </li><li> Vermeiden Ausplattieren der Bakterien an die Kante der Platte. Wenn der Rasen erstreckt sich auf die Kanten der Platte die Würmer kriechen können die Seiten, trocknen aus und sterben. </li><li> Würmer leben länger, wenn die Bakterien auf den Platten ausgesät bereits tot sind 15. </li></ul> 2. Protokoll B: Behandlung mit alkalischem Natriumhypochlorit-Lösung (&quot;Bleaching&quot;) 11 Das Bleichen Technik wird für die Synchronisierung verwendet C. elegans Kulturen an der ersten Larvenstadium (L1). Das Prinzip der Methode liegt in der Tatsache, dass Würmer empfindlich auf Bleichmittel sind, während die Eischale schützt Embryos davon. Nach der Behandlung mit alkalischen Hypochlorit-Lösung werden die Embryonen in flüssigen Medien ohne Nahrung, die dem Schlüpfen erlaubt, verhindert aber die weitere Entwicklung inkubiert. <ol><li> Erlauben Würmer bis erwachsenen Stadium wachsen. </li><li> Recover graviden Erwachsenen in 15 ml Röhrchen durch Waschen Platten mit M9-Puffer. </li><li> Pellet-Würmer durch Zentrifugieren für 2 Minuten bei 400 × g (~ 1500 rpm auf einem Standard-Tischzentrifuge) bei Raumtemperatur und Überstand verwerfen. </li><li> Führen Sie 1-3 Wäschen, bis der Puffer erscheint klar von Bakterien. </li><li> Fügen Sie die gewünschten Bleichlösung (Tabelle I) und agitieren für einige Minuten (Zerstörung des adulten Gewebe sollte unter dem Binokular beobachtet werden und die Reaktion gestoppt, wenn Spuren von Erwachsenen noch sichtbar sind, das dauert in der Regel zwischen 3 und 9 Minuten, abhängig von mehreren Bull., wie das Volumen der Schnecke Pellet, in der Diskussion erwähnt) (Abb. 3). </li><li> Die Reaktion durch Zugabe M9 buffer, um den Schlauch zu füllen. </li><li> Schnell zentrifugieren (seit Behandlung kann immer noch aktiv sein) für 1 Minute bei 400 xg und Überstand verwerfen. </li><li> Waschen Pellet dreimal durch Füllen des Röhrchens mit M9-Puffer. </li><li> 1 ml M9-Puffer zu dem Pellet, oder legen die Eier zu ungesetzte NGM-Platten, und inkubieren Sie bei der gewünschten Temperatur unter leichtem Schütteln. Die richtige Belüftung sollte zur Verfügung gestellt (Abb. 4) werden. </li></ol> TIPPS: <ul><li> Es gibt verschiedene Bleich-Lösungen, wählen Sie diejenige, die besser funktioniert in Ihren Händen (Tabelle 1, Abb. 1). </li><li> Eier bereits auf den Platten vorgesehene aus der Entsorgung der Oberfläche des Agar mit einem weichen Material wie beispielsweise ein Stück eines Röntgenfilms gewonnen werden. </li><li> Zu viele Überreste von erwachsenen Tieren beeinträchtigen können Synchronisation, da sie eine Versorgung mit Lebensmitteln für die frisch geschlüpften Larven bilden. </li><li> Höhere Temperaturen leicht beschleunigen die Entwicklung, die unbequem ist if jede Schnecke überspringt Synchronisierung, weil der Unterschied in der Entwicklung zwischen synchronisiert und synchronisiert Würmern wird bei höheren Temperaturen größer. </li><li> Bleichbad erst kurz vor seiner Verwendung durchgeführt werden. Außerdem verliert Bleichmittel Potenz nach offen für eine Weile wurde, teilweise aufgrund der Lichtempfindlichkeit. Wir schlagen vor, Aliquot jeder neuen Flasche in kleine bernsteinfarbenen Flaschen, einen solchen Schaden zu verhindern und zu minimieren Lichtquelle ausgesetzt haben. </li></ul> 3. Protokoll C: Worm Plating <ol><li> Warten Sie zwischen 12 und 24 Stunden (time to Embryonalentwicklung, hängt von der Temperatur) nach dem Bleichen wurde durchgeführt und erholen Würmer durch Zentrifugation (2 Minuten bei 400 xg). </li><li> Überstand verwerfen, Saatgut Würmer auf den erforderlichen Platten und lassen Sie die restliche Flüssigkeit trocken. </li><li> Zeigen Platten bei der erforderlichen Temperatur. </li></ol> TIPPS: <ul><li> L1-Larven in M9-Puffer bei 15 ° C Schütteln bei mindestens eine Woche aufbewahrt werden wiThout offensichtlichen Veränderungen. </li><li> seien Sie vorsichtig bei der Berechnung der Würmer man so will, weil zu viele Samen kann das Essen schneller als erwartet ausschöpfen und ruinieren Ihr Experiment. Rund 500 L1 kann im Erwachsenenalter in einem 55 mm-Platte erreichen, ohne Ihr Essen. </li></ul> 4. Protokoll D: C elegans Observation D.1 Nomarski Beobachtung Differential-Interferenz-Kontrast-Mikroskopie ist eine optische Mikroskopie Beleuchtung Technik verwendet, um den Kontrast in ungefärbten transparenten Proben zu erhöhen. Das Wort bezieht sich auf das Nomarski Prisma verwendet, nach seinem Erfinder benannt. Durch die Beobachtung Tiere am Leben sind wir in der Lage, die Physiologie des Tieres mit den Änderungen nur von Immobilisierung ableiten zu untersuchen. Darüber hinaus, da kein Fixiermittel zugesetzt wird, können fluoreszierende Marker in vivo beobachtet werden. Diese Tatsache und die Möglichkeit des Schmelzens Fluoreszenzmarker um ein Gen von Interesse machen es möglich, die Prozesse in w folgendermaßenelche das Protein des Studiums beteiligt sein können. Durch Verwendung der Technik in diesem Protokoll beschrieben wurde, kann nicht nur lebende Würmer beobachtet werden, aber sie können auch gewonnen und wieder ausplattiert. Agar-Pad Vorbereitung (kurz vor der Verwendung): <ol><li> Planen 2% Agarose in Wasser und schmelzen. Halten Sie schmolz bei 65 ° C </li><li> Legen Sie zwei Objektträger mit einem Stück Klebeband auf sie an beiden Seiten eines dritten, sauberen Objektträger. </li><li> Mit Hilfe einer Pasteurpipette einen Tropfen Agar auf die saubere Oberfläche. </li><li> Decken Sie die Agar mit einem anderen sauberen Objektträger auf der Oberseite der drei Schlitten senkrecht gestellt. </li><li> Drücken Sie vorsichtig, damit der Agar Drop auf die Dicke des Bandes Abstandshalter abgeflacht. </li><li> Nachdem der Agar erstarrt, ziehen Sie vorsichtig die verschweißte Folien und trennen Sie die zwei übrigen Folien, indem ein relativ zu dem anderen. </li></ol> Montage lebenden Tieren <ol start="7"><li> Geben Sie einen Tropfen (10 ul) von 1 mM Levamisol oder Natriumazid 10-30 mm auf ter Mitte des Pads. </li><li> Übertragen Sie Tiere in der Dropdown-Wurm mit Hilfe eines Pick. </li><li> Vorsichtig einen Deckglas über die Tiere und befestigen Sie es an beiden Seiten mit etwas Nagellack oder Silikon. </li></ol> TIPPS: <ul><li> Halten Aliquots 2% Agarose bei 4 ° C </li><li> Geschmolzener Agarose auf 65 ° C für mindestens einen Tag aufbewahrt werden. </li><li> Hinweis: Levamisol ist ein Nikotinsäure-Rezeptor-Agonisten, die spastischen Lähmung hervorruft 16. </li><li> Seien Sie vorsichtig, ist Natriumazid extrem giftig! </li></ul> D.2 Ethanol Fixierung und DAPI-Färbung Das hier beschriebene Protokoll stellt eine schnelle Möglichkeit, Färben Würmer mit DAPI jedoch wegen der dissecation der Wurm einige Strukturen kann einige Veränderung zu präsentieren. Es gibt einige andere Methoden, um Würmer zu vorangegangenen DAPI-Färbung wie die Fixierung mit Carnoy-Lösung oder Formaldehyd, die eine bessere Erhaltung der Integrität des Wurms 17 fix. Ethanol Fixierung (modifiziert nach 18) <ol><li> Platz ~ 10 ul M9-Puffer (oder Wasser) auf einen Objektträger. </li><li> Mit einem Pick-Wurm sorgfältig übertragen 10-25 Würmer auf den Rückgang. </li><li> Mit Filterpapier oder eine Mikro-Pipette entfernen Sie so viel wie möglich M9-Puffer ohne Entfernen der Würmer oder lassen sie trocknen. </li><li> Fügen Sie ~ 10 ul 90% Ethanol und trocknen lassen. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 4 ein-oder zweimal. </li></ol> 4 &#39;,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-Färbung <ol start="6"><li> Mischen Sie DAPI mit den gewünschten Montage Medien bis zu einer Endkonzentration von 2 ng / ul. </li><li> Sobald das Ethanol vollständig verdunstet ist, 7 ul des DAPI: Montiermedium Mischung. </li><li> Legen Sie ein Deckglas und befestigen Sie es an beiden Seiten mit etwas Nagellack oder Silikon. Folien bereit sein wird für die Beobachtung etwa 5 min nach der Zugabe von DAPI. </li></ol> TIPPS: <ul><li> Die Montage medIA enthält Glycerin, so eine kleine Menge genügt, um die ganze Vorbereitung zu decken. </li><li> Es gibt eine breite Palette an kommerziellen Montage Medien (Fluoromount oder zu verlängern, zum Beispiel), hängen ihre Qualität und Preis, wie lange Sie wollen Ihre Probe zu speichern. </li><li> Seien Sie vorsichtig, ist ein bekanntes Mutagen DAPI, die stark bindet an AT-reiche Regionen in der DNA. </li></ul> Rezepte Nematoden-Wachstumsmedium (NGM) 1,7% (w / v) Agar 50 mM NaCl 0,25% (w / v) Pepton 1 mM CaCl 2 5 pg / ml Cholesterin 25 mM KPO 4 1 mM MgSO 4 M9-Puffer 22mm KH 2 PO 4 42 mM Na 2 HPO 4 86 mM NaCl 1 mM MgSO 4 Bleich-Lösungen getestet <table border="1"><tbody&gt; <tr><td></td><td> Rezept Nr. 1 </td><td> Rezept Nr. 2 </td><td> Rezept # 3 </td><td> Rezept Nr. 4 </td><td> Rezept Nr. 5 </td></tr><tr><td> Wasser (ml) </td><td> 2,75 </td><td> 3,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 1,5 </td></tr><tr><td> Natriumhydroxid (ml) </td><td> 1,25 (1M) </td><td> 0,5 (5M) </td><td> 2,5 (1M) </td><td> 2,5 (2M) </td><td> 2,5 (1M) </td></tr><tr><td> Natriumhypochlorit ~~~V 4% (ml) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> insgesamt (ml) </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr></tbody></table> Tabelle I. Verschiedene Bleichlösung Rezepte für diesen Artikel getestet. Rezepte # 3 und # 4 sind 2x, und sollte auf dem gleichen Volumen M9 hinzugefügt werden. Rezepte für # 1, # 2 und # 5 wurden bereits 2, 11, 19 berichtet. Endkonzentrationen: # 1 0,25 M NaOH, ~~~V NaOCl 0,8%<html> , # 2 NaOH 0,5 M, NaOCl ~ 0,8%, # 3 NaOH 0.625M, NaOCl ~ 1%, # 4 NaOH 1 M, ~ 1,6% NaOCl, Nr. 5 NaOH 0,5 M, NaOCl ~ 0,8%. 5. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig1.jpg" alt="1" /> Abbildung 1. Vergleich von fünf verschiedenen Bleichlösungen bei zwei verschiedenen Inkubationszeiten. N2 Würmer zweimal mit M9 wurden in fünf 15 ml konischen Röhrchen mit jeweils Bleichlösung aufgeteilt. Die Röhrchen wurden kräftig geschüttelt und 1 ml in ein neues Röhrchen mit M9, um die Reaktion nach der angegebenen Zeit zu stoppen übertragen. Nach dem Bleichen Verfahren Würmer wurden mit 1 ml M9 bei 20 ° C für 24 Stunden inkubiert. In jedem Fall wurde unteres Bild nur nach dem Bleichen, oberes Bild 24 Stunden später genommen. _upload/4019/4019fig2.jpg &quot;alt =&quot; Bild 2 &quot;/&gt; Abbildung 2. Die Temperatur der Bleichlösung beeinflusst die Wirksamkeit der Behandlung. Gleiche Volumina von N2 Viren mit dem gleichen Bleichlösung entweder vorher auf Eis für 20 Minuten gekühlt oder gehalten bei 25 ° C für die gleiche Zeit wurden gebleicht. Die beiden Spalten auf der linken Bilder zeigen gerade nach dem Bleichen. Nach der Behandlung Würmer wurden in 15 ml konischen Röhrchen mit 1 ml M9 bei 20 ° C für 24 Stunden inkubiert. Spalten auf der rechten Display-Bilder 24 Stunden später. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Das Verhältnis Wurm Pellet: Zeit des alkalischen Hypochlorit Inkubation beeinflusst die Wirksamkeit der Behandlung 50, 100, 250 und 500 ul der Wurm Pellet mit 2 ml Bleichlösung # 3 für 3, 6 und 9 Minuten inkubiert wurden.. Geschlüpften L1, tote Embryonen und Überreste von Erwachsenen-Fragmente wurden nach der Inkubation bei 20 ° C für 2 quantifiziert<html> 4 Stunden in 15 ml konischen Röhrchen mit 1 ml M9-Puffer. Etwa drei konfluenten 55 mm Platten mit erwachsenen Würmer sind nötig, um eine 100 mu l Pellet Wurm zu bekommen. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Die richtige Belüftung ist für das Ausbrüten und das Überleben von C. erforderlich elegans Embryonen. A 100 ul Pellet N2 Würmer wurden für 6 Minuten gebleicht und inkubiert in 15 ml konischen Röhrchen mit 1, 5 oder 10 ml, wie angegeben, M9, bei 20 ° C für 24 Stunden. Der obere Teil der Abbildung zeigt Bilder der Kulturen nach 24 Stunden, in denen Pfeile, die Eier nicht ausbrüten wollte zeigen. Am unteren Rand gibt es eine graphische Darstellung, die Menge der Larven (hellgrau) und toten Embryonen (dunkelgrau) 48 Stunden nach dem Bleichen an den angegebenen Bedingungen. tp_upload/4019/4019fig5.jpg &quot;alt =&quot; Bild 5 &quot;/&gt; Abbildung 5. Lebenszyklus von C. elegans. ein. Ungefähre Länge der Würmer in verschiedenen Stadien. Stunden benötigt, um jede Phase in Abhängigkeit von der Temperatur (modifiziert nach 20). B. Nomarski (up) und DAPI (unten) Bilder von verschiedenen Würmern zu den angegebenen Entwicklungsstadien zu erreichen. Wichtigsten Merkmale in jeder Phase werden vergrößert L1: Pfeil zeigt die Vorstufen der somatischen Gonade und der Keimbahn Frühe L4: Black Arrow (Nomarski) zeigt die Entwicklung Vulva; weiße Pfeile (DAPI) zeigen die beiden Arme Mid-Gonaden... Ende der L4: Pfeil zeigt die Entwicklung Vulva an der sogenannten Weihnachtsbaum Bühne Junger Erwachsener:. schwarze Pfeil zeigt einen Embryo in der Gebärmutter, Punkte Pfeilspitze auf der Samenblase, weißer Pfeil zeigt eine Eizelle Gravid Erwachsenen:. Pfeilspitze (DAPI) weist darauf hin, befruchteten Embryonen. Arrow in DAPI-Bild zeigt Spermatheka. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig6.jpg" alt="6" /> Abbildung 6. Vulva Morphologie bei L3, L4 und adulte Stadien. Im L3-Stadium nur ein kleines Lumen, wo die Vulva gebildet beobachtet werden kann. Bei L4, dehnt sich dieses Lumen bilden die so genannten &quot;Weihnachtsbaum&quot;. Beim Erwachsenen die Vulva ist bereits geschlossen. Gelbe Linien zeigen die Position der Vulva diese drei Stufen. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig7.jpg" alt="7" /> Abbildung 7. DAPI-Färbung bei L3, L4 früh, spät L4 und adulte Stadien. Bei L3, wird Keimbahn verlängert. Bei L4, Arme Gonade vorhanden U-Form Morphologie. Am späten L4-Stadium Spermien können im distalen Teil der Gonade beobachtet werden. Jugendliche präsentieren Oozyten. Die Adult Keimbahn präsentiert Eizellen und Embryonen. Gelbe Linien Abgrenzung Keimbahnen an the verschiedenen Stufen angegeben. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig8.jpg" alt="8" /> 8. C elegans Entwicklung bei 15 und 25 ° C N2 Würmer wurden gebleicht, Übernachtung in M9 und Rühren bei 15 ° C, übertragen, um Platten gewachsen und die angegebenen Zeiten bei den angegebenen Temperaturen inkubiert.

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Wir haben nichts zu offenbaren.

Nematoden-Synchronisation Mehrere Bleichlösungen beschrieben worden. Wir haben versucht, fünf verschiedene Rezepte (Tabelle I) und, in unseren Händen, sie zeigten keine signifikanten Unterschiede in der Synchronisation der Wurm Populationen (Abb. 1). Allerdings haben unsere Experimente zeigen, dass Parameter wie Temperatur (Abb. 2), das Verhältnis Bleichlösung: Volumen von Würmern (Abb. 3) und dem Volumen der M9, mit dene...

basic caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation

Die Erforschung der Molekular-und Entwicklungsbiologie der Fadenwurm Caenorhabditis elegans wurde in den frühen Siebzigern von Sydney Brenner begonnen und es wurde seither als Modellorganismus 1 verwendet. C. elegans besitzt wichtige Eigenschaften wie Einfachheit, Transparenz und kurze Lebensdauer, die es ein geeignetes experimentelles System für die biologische Grundlagenforschung seit vielen Jahren 2 haben. Entdeckungen in diesem Nematoden weitreichende Auswirkungen haben, da viele zelluläre und molekulare Prozesse, die Kontrolle tierischer Entwicklung evolutionär konservierte 3 sind. C. elegans Lebenszyklus durchläuft einem embryonalen Stadium und vier Larvenstadien, bevor die Tiere das Erwachsenenalter erreichen. Die Entwicklung kann dauern 2 bis 4 Tage je nach Temperatur. In jeder der Stufen mehrere charakteristische Züge beobachtet werden kann. Das Wissen um seine komplette Zelllinie 4,5 zusammen mit dem tiefen annotatIon seines Genoms machen diese Nematoden in ein großes Modell in so unterschiedlichen Bereichen wie der Neurobiologie 6, Alterung 7,8, Stammzellbiologie 9 und 10 Biologie Keimbahn. Ein zusätzliches Feature, das macht C. elegans ein attraktives Modell, mit zu arbeiten ist die Möglichkeit der Erlangung Populationen von Würmern in einem bestimmten Stadium durch einen relativ einfachen Protokoll synchronisiert. Die einfache Wartung und Verbreitung dieser Nematoden zugegeben, um die Möglichkeit der Synchronisation ein mächtiges Werkzeug, um große Mengen von Würmern, die für eine Vielzahl von kleinen oder High-Throughput-Experimente wie RNAi-Screens, Mikroarrays, massiven Sequenzierung verwendet werden können, zu erhalten, Immunoblot oder in situ Hybridisierung, unter anderem. Wegen seiner Transparenz, C. elegans Strukturen können unter dem Mikroskop nach Differential Interference Contrast Mikroskopie unterschieden werden, die auch als Nomarski micros bekanntzu kopieren. Verwendung einer fluoreszierenden DNA-Bindemittel, DAPI (4 &#39;,6-Diamidino-2-phenylindol), zum Beispiel, auf die spezifische Erkennung und Lokalisierung von einzelnen Zellen sowie subzellulären Strukturen / Defekte der sie zu führen.

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Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Die Einfachheit in der Pflege und Verbreitung des Nematoden<em&gt; C elegans</em&gt; Machen es zu einem schönen Modell-Organismus zu arbeiten. Die Möglichkeit zum Synchronisieren von Würmern ermöglicht die Arbeit mit einer signifikanten Menge an Themen gleichzeitig Entwicklungsstadium, was erleichtert die Untersuchung eines bestimmten Prozesses in vielen Tieren.

Grundlegende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisation und Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

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Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

46.1K Aufrufe.  Bellvitge Institute for Biomedical Research. Die Einfachheit in der Pflege und Verbreitung des Nematoden C elegans Machen es zu einem schönen Modell-Organismus zu arbeiten. Die Möglichkeit zum Synchronisieren von Würmern ermöglicht die Arbeit mit einer signifikanten Menge an Themen gleichzeitig Entwicklungsstadium, was erleichtert die Untersuchung eines bestimmten Prozesses in vielen Tieren.

Serie: Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

Messung Caenorhabditis elegans Life Span auf festen Medien

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Forschung

Biologie

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

Isolation und In-vitro- Aktivierung von Caenorhabditis elegans Sperma

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide range of species, including mammals. It also causes a decrease in body weight and fertility, as well as lower levels of plasma glucose, insulin, and IGF-1 in these animals. This treatment is often referred to as dietary restriction (DR) or caloric restriction (CR). The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as an important model organism for studying the biology of aging. Both environmental and genetic manipulations have been used to model DR and have shown to extend lifespan in C. elegans. However, many of the reported DR studies in C. elegans were done by propagating animals in liquid media, while most of the genetic studies in the aging field were done on the standard solid agar in petri plates. Here we present a DR protocol using standard solid NGM agar-based plate with killed bacteria.

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Here we present a protocol for performing solid plate-based dietary restriction in C. elegans with killed bacteria.

Solide Plate-basierte diätetische Einschränkung in Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ease of growth and small size. This small size, though, has disallowed a number of technical approaches found in other model systems. For example, blood transfusions in mammalian systems and grafting techniques in plants enable asking questions of circulatory system composition and signaling. The circulatory system of the worm, the pseudocoelom, has until recently been impossible to assay directly. To answer questions of intercellular signaling and circulatory system composition C. elegans researchers have traditionally turned to genetic analysis, cell/tissue specific rescue, and mosaic analysis. These techniques provide a means to infer what is happening between cells, but are not universally applicable in identification and characterization of extracellular molecules. Here we present a newly developed technique to directly assay the pseudocoelomic fluid of C. elegans. The technique begins with either genetic or physical manipulation to increase the volume of extracellular fluid. Afterward the animals are subjected to a vampiric reverse microinjection technique using a microinjection rig that allows fine balance pressure control. After isolation of extracellular fluid, the collected fluid can be assayed by transfer into other animals or by molecular means. To demonstrate the effectiveness of this technique we present a detailed approach to assay a specific example of extracellular signaling molecules, long dsRNA during a systemic RNAi response. Although characterization of systemic RNAi is a proof of principle example, we see this technique as being adaptable to answer a variety of questions of circulatory system composition and signaling.

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

The model organism C. elegans uses pseudocoelomic fluid as a passive circulatory system. Direct assay of this fluid has not been previously possible. Here we present a novel technique to directly assay the extracellular space, and use systemic silencing signals during an RNAi response as a proof of principle example.

Vampiric Isolation der extrazellulären Flüssigkeit aus<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Prostaglandin Extraktion und Analyse in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)1. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT2. Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).

Beobachtung und Quantifizierung der Telomere und repetitiver Sequenzen mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Die Hybridisierung (FISH) mit PNA-Sonden in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

Methoden zur Untersuchung Veränderungen inhärenten Proteinaggregation mit dem Alter in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture a full picture of the multiple levels of molecular processing and changes between different conditions. This protocol presents the method of isolating DNA, RNA, and protein from the same sample of the nematode Caenorhabditis elegans to remove the variation introduced when these biomolecules are isolated from replicates of similarly treated but ultimately different samples. Nucleic acids and protein are extracted from the nematode using the acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction method, with subsequent precipitation, washing, and solubilization of each. We show the successful isolation of RNA, DNA, and protein from a single sample from three strains of nematode and HeLa cells, with better protein isolation results in adult animals. Additionally, guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform-extracted protein from nematodes improves the resolution of larger proteins, with enhanced detectable levels as observed by immunoblotting, compared to the traditional RIPA extraction of protein.
The method presented here is useful when investigating samples using a multiomic approach, specifically for the exploration of the proteome and transcriptome. Techniques that simultaneously assess multiomics are appealing because molecular signaling underlying complex biological phenomena is thought to occur at complementary levels; however, it has become increasingly common to see that changes in mRNA levels do not always reflect the same change in protein levels and that the time of collection is relevant in the context of circadian regulations. This method removes any intersample variation when assaying different contents within the same sample (intrasample.)

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for the isolation of RNA, DNA, and protein from the same sample, in an effort to reduce variation, improve reproducibility, and facilitate interpretations.

Kombinierte Nukleotid- und Protein Extraktionen in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

Messung von Sauerstoff Verbrauchsmengen in intakten Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

Reinigung und Analyse von Caenorhabditis elegans Extrazelluläre Vesikel

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...