Diese Arbeit wurde von der American Cancer Society (PF-07-103 bis 01-CSM), die National Institutes of Health (R01 GM61275 und P30 CA042014), die Leukämie-und Lymphom-Gesellschaft und der Huntsman Cancer Foundation unterstützt.

siRNA-Transfektion und Zell-Vorbereitung <ol><li> Bereiten Sie ein 4-gut LabTek II chambered Deckglas, indem 0,5 ml Fibronektin (10μg/mL) in jede Vertiefung, die verwendet werden. Inkubieren für 10-15 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Bereiten siRNA / Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen)-Komplexe für die reverse Transfektion laut Hersteller Anweisungen. Verwenden Sie die empfohlenen Mengen für eine Vertiefung einer 24-well Schale pro Kammer verwendet werden (100 &amp;mgr; l insgesamt) werden. Eine analoge Produkt / Protokoll für siRNA-Transfektion ersetzt werden können. </li><li> Entfernen Sie die Fibronektin aus den Vertiefungen der Kammer Deckglas. Add 100 &amp;mgr; von siRNA / Lipofectamine RNAiMAX Komplexe in jede Vertiefung, die verwendet werden. </li><li> Aliquot 20.000 Histon H2B-mCherry-exprimierenden Zellen (in 500μL) pro Well mit Transfektionsansatz. </li><li> Lassen Zellen für ~ 24 Stunden vor dem Auswechseln der Transfektion Gemisch mit 1ml von regelmäßigen Zellkulturmedium inkubiert. </li><li> Inkubieren Zellen weitere 24 Stunden vor der Bildaufnahme (48 Stunden nach der Transfektion). </li></ol> Mikroskop-Setup und Bildaufnahme <ol start="7"><li> Es gibt drei wesentliche Teile der Bildaufnahme Setup: 1) eine Zelle Inkubator, der auf dem Mikroskoptisch passt und sorgt für eine konstante feuchten Umgebung von 37 ° C und 5% CO 2, 2) einem inversen Mikroskop mit einem automatisierten Bühne ausgestattet, automatisierten Fluoreszenz-und Hellfeld Fensterläden und automatisierte Filterräder und 3) ein Softwarepaket, das integriert und steuert die Bühne, Fensterläden und Filterräder. In unserer Imaging-Setup verwenden wir ein maßgeschneidertes Zellinkubator von OKO Lab, die mit dem LabTek II chambered Deckglas verwendet werden können. Die Bühne, Fensterläden und Filterräder werden von der Metamorph-Software gesteuert. Hinweis: Die OKO Lab Bühne-Top-Inkubator-System wird mit Adaptern für eine Vielzahl von verschiedenen Teller, Schüssel oder Deckglas Größen. </li><li> Positionieren Sie den LabTek II chambered Deckglas in den Inkubator durch das Öffnen der Deckel des vorgewärmten und äquilibriert Inkubator, indem die Kammern Deckglas in den Adapter, und hält in Platz mit Knetmasse. Lassen Sie die Abdeckung auf der Kammern Deckglas, so dass das Zellkulturmedium nicht austrocknet. Schließen Sie den Deckel und die Position der gesamten Inkubator auf dem Mikroskoptisch, dass der Inkubator fest an ihrem Platz gehalten. </li><li> Mit Metamorph, richten Sie Ihren Experiment durch Auswahl von &quot;Apps / Mehrdimensionale Bildaufnahme&quot; in der Menüleiste der Software. Dadurch öffnet sich ein Fenster, in dem Sie die Frequenz und die Länge der Zeitraffer auswählen können, die Belichtungszeit für jede Farbe (wenn dies mehrere Einstellungen), die Anzahl und Lage der Bühne Positionen, und die Anzahl der z-Abschnitten (falls gewünscht). . Wählen Sie, wo die Daten-Dateien speichern Tipp: Wenn Sie andere Software als Metamorph, die Funktionen können leicht unterschiedlich, aber das Gesamtkonzept ist die gleiche. Mikromanager, ein Open-Source ImageJ-basierte Software zur Erfassung, die kompatibel mit den meisten Hardware-Setups ist, ist eine hervorragende Alternative. </li><li> . Für die Zwecke dieses Protokolls, wir werden die Bilder bei zwei Wellenlängen (Hellfeld und mCherry) alle 15 Minuten für 8 Stunden bei 15 Tischpositionen Hinweis zu erwerben: Wenn bessere zeitliche Auflösung gewünscht wird, dann können Sie verkürzen die Zeitspanne zwischen den Aufnahmen, aber kann weniger Bühne Positionen eingesetzt werden, und damit weniger mitotischen Zellen werden zur Analyse zur Verfügung. Es ist wichtig, wenn man Zeitabständen zu berücksichtigen, die Zeit für das Filterrad zwischen Filter-Sets Schalter erforderlich. </li><li> Bestimmen Sie die optimale Belichtungszeit für jede Wellenlänge, indem Sie zunächst mit Schwerpunkt auf einem Feld von Zellen mit Hilfe von Hellfeld. In der Software, stellen Sie die Autofokus-Funktion nur für die Hellfeld-Kanal (dieser wird die Software auf Autofokus ermöglicht in jeder Phase Position vor jedem Erwerb). Hinweis: Wir verwenden ein 40x trockenen Phasen-Kontrast-Ziel, hervorragende Auflösung, ohne die Notwendigkeit für Öl geben . Andere Ziele können in Abhängigkeit von der optischen Auflösung wünschen übrig. </li><li> Wechseln Sie auf die mCherry Wellenlänge und Snap ein Bild mit einem 50 ms Belichtung. Stellen Sie die Belichtungszeit auf das erforderliche Minimum, um ein gutes Bild zu sehen. Es ist wichtig, die Menge an Licht ausgesetzt nachhaltige Lebensfähigkeit der Zellen zu gewährleisten begrenzen. Als allgemeine Regel gilt, können dies am besten durch einen Graufilter (zur Anregung Lichtstrom zu reduzieren) und eine längere Belichtung Zeit, anstatt durch eine Erhöhung der Beleuchtungsstärke erreicht werden. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle weiteren Wellenlängen verwendet werden. Hinweis: Um die langfristige Lebensfähigkeit der Zellen bei einer bestimmten Belastung für Ihr Experiment zu bestimmen, können Sie die Gesamtzahl der Bilder einer Zelle überleben kann über die gewünschte Zeitraffer durch eine einstweilige Umgestaltung der Zeitpunkt Abstand Vorschau von Minuten auf Sekunden (dh, 10 min. wird 10 Sekunden). Wenn Ihre Zellen überleben 100-200 Aufnahmen (oder dieentsprechende Anzahl), dann wird Ihre Exposition ist in Ordnung. Wenn nicht, reduzieren Sie Ihre Anregungslicht, Belichtungszeit oder die Gesamtzahl der Bilder auf Ihren vollständigen Experiment simulieren. </li><li> Als nächstes wählen Sie und markieren Sie eine entsprechende Anzahl von Positionen der Bühne, so dass Sie auf eine ausreichende Stichprobe der Zellpopulation erreichen können. Metamorph zeichnet die Positionen und wird dort als Gegenleistung für jede Akquisition. Tipp: ich generell versuchen, Positionen, in denen gibt es viele Zellen zu Bild zu finden, aber nicht so viele, dass sie zu dicht sind. Außerdem ist es wichtig, genügend Positionen wählen, so dass Sie eine gute Chance, unter Einhaltung einer großen Anzahl von Zellen voran durch Mitose wird. </li><li> Nachdem alle Zeitraffer, Wellenlänge Belichtungszeit, und Tischposition Informationen aufgezeichnet worden sind, wählen Sie die Schaltfläche &quot;Vorschau&quot; auf dem Bildschirm, um festzustellen, ob die Software die Steuerung der Geräte entsprechend. </li><li> Sobald Sie zufrieden sind, wählen Sie die Schaltfläche &quot;Erfassen&quot; auf dem Bildschirm auf den Erwerb beginnen. Dann lehnen Sie sich zurück und lassen Sie den Computer und Mikroskop, um die Arbeit zu tun. Hinweis: Beachten Sie die Automatisierung durch mindestens eine volle Runde der Akquisition um sicherzustellen, dass alles richtig funktioniert. </li></ol> Bildverarbeitung und-analyse <ol start="16"><li> Nach der Übernahme abgeschlossen ist, ist der nächste Schritt, um die Bilddaten in eine Form, die einfacher zu handhaben ist zu übertragen. Für die Zwecke dieses Protokolls, werde ich zunächst zeigen, wie man Filme mit Metamorph erzeugen, dann wie Bildmontagen mit dem ImageJ Programm zu generieren. Entweder Format nützlich sein wird für die Quantifizierung Zwecke. </li><li> Der erste Schritt ist, um die Daten zu überprüfen. Dazu wählen Sie &quot;Apps / Review Mehrdimensionale Daten&quot; in der Menüleiste. Wählen Sie den Speicherort der Dateien und wählen Sie &quot;Ansicht&quot;. Dies ermöglicht es Ihnen, den Stapel von Bildern aus jedem Stadium Position einzeln zu überprüfen. Wählen Sie die gewünschte Stufe Position, dann &quot;Load Images&quot;. Sie können durch die Daten-Frame-by-Frame Voraus. </li><li> Für diejenigen Bühne Positionen, in denen Zellen gehen durch Mitose (wie von DNA-und Zell-Morphologie bestimmt), können Sie Filme und Montagen mit Metamorph, oder mit anderen Programmen wie ImageJ (kostenlos erhältlich über NIH). </li><li> Um einen Film in Metamorph, wählen Sie &quot;Bearbeiten / Speichern Film&quot; in der Menüleiste. Du wirst in der Lage sein, die Bilder zu verwenden, die Geschwindigkeit und den Dateityp des Films auszuwählen. Dann wählen Sie &quot;Save Movie&quot;. </li><li> Um eine Montage und ich spare den Bildstapel als. Stk Datei, die auch in anderen Programmen wie ImageJ verwendet werden. </li><li> Öffnen Sie die Datei in ImageJ und vorab den Rahmen, bis Sie eine Zelle durchläuft Mitose zu finden. . Crop den Bereich um die Zelle und wählen Sie &quot;Bild / Duplizieren&quot; Hinweis: Vergewissern Sie sich, um alle Frames duplizieren. </li><li> Um eine Montage, wählen Sie &quot;Bild / Stacks / Make Montage&quot; in der Menüleiste. Hier können Sie festlegen, welche Bilder Sie sind, der Größe und Form der Montage werden soll, und ob Sie die Grenzen zwischen den Frames. Wählen Sie diese und klicken Sie auf &quot;Okay&quot;. .. Speichern Sie die Montage als tif-Datei und führen Sie einen weiteren Verarbeitung in beiden ImageJ oder Adobe Photoshop Tipp: Ändern Sie montage-Dateien aus dem 16-Bit-Format, das von Metamorph auf 8-Bit-Format verwendet zur leichteren Bildverarbeitung. </li><li> Zur Berechnung der Zeit in verschiedenen Stadien der Mitose bestimmen t = 0 (erste Anzeichen für DNA-Kondensation oder Zellabrundung), die Anzahl der Frames, bis Chromosomen am Äquator (Zeit in Prophase / Prometaphase), Frames ausgerichtet sind, bis Chromosomen zu trennen beginnen (Zeit in der Metaphase) und Frames, bis die Zellen beginnen zu glätten (Anaphase / Telophase / Cytokinese). Die berechnete Zeit in jeder mitotischen Phase hängt von dem Zeitintervall zwischen den einzelnen Bildern. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/1878/1878fig1tmb.jpg" border="0" /> Abbildung 1 zeigt die Ergebnisse einer typischen Kontroll-siRNA-Transfektion Experiment mit einem HeLa Zelllinie Histon H2B-mCherry. Diese Methode der hat effektiv auf mitotische Timing quantifizieren und enthüllt eine unerwartete Rolle für die nucleoporin Nup153 in das Timing der späten Mitose 1. Bitte <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/1878/1878fig1.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 1 zu sehen.

<ol>
	<li>Mackay, D. R., Elgort, S. W., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleoporin+Nup153+has+separable+roles+in+both+early+mitotic+progression+and+the+resolution+of+mitosis.">The nucleoporin Nup153 has separable roles in both early mitotic progression and the resolution of mitosis.</a> Mol Biol Cell. 20, 1652-1660 (2009).</li><li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells.">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38, 2-16 (2006).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Meraldi, P., Draviam, V. M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+and+checkpoints+in+the+regulation+of+mitotic+progression.">Timing and checkpoints in the regulation of mitotic progression.</a> Dev Cell. 7, 45-60 (2004).</li><li>Mora-Bermudez, F., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+structural+dynamics+of+chromosomes+in+living+cells+by+fluorescence+microscopy.">Measuring structural dynamics of chromosomes in living cells by fluorescence microscopy.</a> Methods. 41, 158-167 (2007).</li><li>Prosser, S. L., Fry, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+of+the+centrosome+cycle+in+mammalian+cells.">Fluorescence imaging of the centrosome cycle in mammalian cells.</a> Methods Mol Biol. 545, 165-183 (2009).</li><li>Malureanu, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BubR1+N+terminus+acts+as+a+soluble+inhibitor+of+cyclin+B+degradation+by+APC/C(Cdc20)+in+interphase.">BubR1 N terminus acts as a soluble inhibitor of cyclin B degradation by APC/C(Cdc20) in interphase.</a> Dev Cell. 16, 118-131 (2009).</li><li>Anderson, D. J., Hetzer, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reshaping+of+the+endoplasmic+reticulum+limits+the+rate+for+nuclear+envelope+formation.">Reshaping of the endoplasmic reticulum limits the rate for nuclear envelope formation.</a> J Cell Biol. 182, 911-924 (2008).</li><li>Beaudouin, J., Gerlich, D., Daigle, N., Eils, R., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+envelope+breakdown+proceeds+by+microtubule-induced+tearing+of+the+lamina.">Nuclear envelope breakdown proceeds by microtubule-induced tearing of the lamina.</a> Cell. 108, 83-96 (2002).</li><li>Marcus, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+spindle+behavior+using+confocal+microscopy.">Visualization of spindle behavior using confocal microscopy.</a> Methods Mol Med. 137, 125-137 (2007).</li><li>Steigemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora+B-mediated+abscission+checkpoint+protects+against+tetraploidization.">Aurora B-mediated abscission checkpoint protects against tetraploidization.</a> Cell. 136, 473-484 (2009).</li><li>Draviam, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+genomic+screen+identifies+a+role+for+TAO1+kinase+in+spindle-checkpoint+signalling.">A functional genomic screen identifies a role for TAO1 kinase in spindle-checkpoint signalling.</a> Nat Cell Biol. 9, 556-564 (2007).</li><li>Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+RNAi+screening+by+time-lapse+imaging+of+live+human+cells.">High-throughput RNAi screening by time-lapse imaging of live human cells.</a> Nat Methods. 3, 385-390 (2006).</li><li>Stegmeier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaphase+initiation+is+regulated+by+antagonistic+ubiquitination+and+deubiquitination+activities.">Anaphase initiation is regulated by antagonistic ubiquitination and deubiquitination activities.</a> Nature. 446, 876-881 (2007).</li></ol>

Mit den jüngsten Fortschritten in der Bildgebung und fluoreszierendes Protein-Technologie, hat Live-Bildgebung zu einem routinemäßigen Bestandteil der zellulären Analyse 2. Eine Vielzahl von GFP (und andere Farbvarianten 3)-markierte Proteine ​​sind überall erhältlich oder relativ leicht zu konstruieren und können verwendet werden, um eine Reihe von Zellteilung Kennzeichen einschließlich DNA / Chromosom Dynamik 4, 5, Zentrosom Vervielfältigung 6, Cyclin B Dynamik zu verfolgen 7, Kernhülle Abbau und Wiedereinbau 8, 9, Mitosespindel Bildung 10 und verschiedenen Stadien der Cytokinese 11. Tagged Proteine ​​können allein oder in Kombination verwendet werden, wenn die Anregungs / Emissionsspektren von fluoreszierenden Tags kompatibel sind, so dass die Koordination zwischen bestimmten Ereignissen zu beurteilen. Wenn größere räumliche und / oder temporale Auflösung ist / sind erwünscht, auch weiterhin die konfokale Mikroskopie, ob Laser-Scanning-, Spinning-Disk oder Resonanz Scannen verwendet werden kann, und die Liste der anspruchsvolle Mikroskopie-Optionen mit zunehmenden Auflösung zu wachsen. Live-Bildgebung der Mitose in Säugetierzellen ist auch für den Einsatz in High-Throughput-RNAi und kleinen Molekül-Bildschirme 12-14 angepasst worden. Während also ein s erste Experimente mit dieser Technik kann relativ einfach, sind die Möglichkeiten für den Aufbau dieser Strategie umfangreich.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Lipofectamine RNAiMAX</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>13778-075</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lab Tek II Chambered Coverglass (4-well)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>12-565-337</td>
<td>Additional chamber sizes are available</td>
</tr>
<tr>
<td>Fibronectin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>F1141</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stage-top cell incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>OKO Lab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Can use any appropriate chamber</td>
</tr>
<tr>
<td>Automated inverted fluorescence microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Can use any appropriate microscope</td>
</tr>
<tr>
<td>Software package</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Metamorph</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Can use any appropriate software</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

time-lapse imaging of mitosis after sirna transfection

Änderungen in der zellulären Organisation und Chromosom Dynamik, die während der Mitose auftreten, sind eng aufeinander abgestimmt, um genaue Vererbung der genomischen und zellulären Inhalte zu gewährleisten. Hallmark Ereignisse der Mitose, wie Chromosom Bewegung, kann ohne weiteres auf eine einzelne Zelle auf der Grundlage einer Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie von Säugetier-Zelllinien, die spezifische GFP-markierten Proteine ​​verfolgt werden. In Kombination mit RNAi-basierte Erschöpfung, kann dies eine leistungsfähige Methode der Ermittlung der Bühne (n) der Mitose, wo Mängel auftreten, nachdem das Vorkommen eines bestimmten Proteins gesenkt worden sind. In diesem Protokoll, präsentieren wir eine grundlegende Methode zur Beurteilung der Wirkung von abbauenden eine mögliche mitotischen regulatorisches Protein über den Zeitpunkt der Mitose. Die Zellen werden mit siRNA transfizierten, in einen Tischinkubation Kammer und bebildert mit Hilfe eines automatisierten Fluoreszenz-Mikroskop. Wir beschreiben, wie Sie Software verwenden, um die Einrichtung eines Zeitraffer-Experiment, wie die Bildsequenzen Prozess entweder noch Bildmontagen oder Filme zu machen, und wie zur Quantifizierung und Analyse der Zeitpunkt der Mitosestadien mit einer Zell-Linie Ausdruck mCherry- getaggt Histon H2B. Schließlich diskutieren wir wichtige Überlegungen für die Gestaltung eines Zeitraffer-Experiment. Diese Strategie ist eine Ergänzung zu anderen Ansätzen und bietet die Vorteile von 1) Empfindlichkeit gegenüber Veränderungen in der Kinetik, die nicht beobachtet, wenn man Zellen einer Population und 2) Analyse der Mitose ohne die Notwendigkeit, den Zellzyklus mit medikamentösen Behandlungen zu synchronisieren könnte. Die visuelle Informationen aus solchen bildgebenden Experimenten ermöglicht nicht nur die sub-Stadien der Mitose zu beurteilen, sondern können auch unerwartete Erkenntnis, dass sich nicht unmittelbar aus Zellzyklusanalyse durch FACS sichtbar.

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Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Hier beschreiben wir eine grundlegende Protokoll, um Bild und Quantifizierung der mitotischen Zeitpunkt der Live-Säugetier-Zellkultur-Zellen nach siRNA-Transfektion.

Zeitraffer-Imaging der Mitose Nach siRNA-Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

time-lapse-imaging-of-mitosis-after-sirna-transfection

Research

JoVE Journal

Biology

16.9K Aufrufe.  University of Utah. Hier beschreiben wir eine grundlegende Protokoll, um Bild und Quantifizierung der mitotischen Zeitpunkt der Live-Säugetier-Zellkultur-Zellen nach siRNA-Transfektion.

Serie: Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Okay, so what I'd like to do today is to show you how to construct a flow chamber, a fusion chamber for imaging on an upright microscope. What then I then do is I create two spaces using film. So what I do is I take the para film, I cut it into small strips.Next I'm going to, this will basically form the channels for the, the walls, and I dry them with a tilted air. I put the cover slip on top of the para, And here's the finished. Then I heat it on a heat block to melt the param and basically create a seal.So what this is, is the, the cover glass here, and then on top of the cover glass is two layers of phim as you see right here. And then on top of this, again, there's a, it's a 22 by two two mil meter cover slip. This one right here, which I pressed against the param to fall the seal.Okay, so the liquid goes in in one direction here and I can suck it out with a filter paper here in this direction. And I'll show you how to do that in a bit. So what I like to do is I like to put it in a humidified chamber, which is very simple.Take two kind of elevated strips and have a filter of paper underneath. And to keep it noisy as I, I put the cover, cover slip on the flow chamber on. Now the way you introduce a solution to the chamber is that you just put the pipet tip at the entrance of the chamber and you just split.Now what I do is I incubate the chamber with the lid closed for 10 minutes. What I usually do to suck the liquid out from the other side is to use it, get a filter paper and cut it into thin strips like this. And I take one of these thin strips and I simultaneously apply the solution into the entrance while putting the filter paper at the exit to suck the exchange, the solution.So you'll see the liquid flowing through the solution. And then I wait for five minutes for the mid close. Now what I'm ready to do is to actually put that the actin it and the actin, I actually have to polymerize, I polymerize inside the flow chamber and it's just the same procedures before.So because like this, and then now that the action is polymerized, I wash out all the un excess un polymerized action using a large volume of just buffer. So here I have about a hundred microliters and it's a few reaction chamber volumes worth of buffer. Just, you know, when the filter paper becomes saturated, I have to change the direction.Okay?And so I'm ready to do imaging with this. So perfusion chamber with actin attached to it. Now I take the slide, mount it under the microscope, and since I'm imaging with an oil objective, I'm gonna put some immersion oil on the top surface of the cover, grass touch, such so assess solution or protein or anything on acting inside.So what I do is I can actually exchange the solution side while I'm doing the time lapse imaging. As such.

Überwachung Aktin Demontage mit Zeitraffer-Mikroskopie

Forschung

Biologie

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Zwei-Photonen-Axotomie und Zeitraffer-konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafisch-Embryonen

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound transgenic fish which express different fluorescent reporters in neighboring cell types provide a means of following cellular interactions 2 and/or tissue-level responses to experimental manipulations over time. In this video, we demonstrate methods that can be used for imaging multiple transgenically labeled cell types serially in individual fish over time courses that can span from minutes to several days. The techniques described are applicable to any study seeking to correlate the "behavior" of neighboring cells types over time, including: 1) serial 'catch and release' methods for imaging a large number of fish over successive days, 2) simplified approaches for separating fluorophores with overlapping excitation/emission profiles (e.g., GFP and YFP), 3) use of hypopigmented mutant lines to extend the time window available for high-resolution imaging into late larval stages of development, 4) use of membrane targeted fluorescent reporters to reveal fine morphological detail of individual cells as well as cellular details in larger populations of cells, and 5) a previously described method for chemically-induced ablation of transgenically targeted cell types; i.e., nitroreductase (NTR) mediated conversion of prodrug substrates, such as metronidazole (MTZ), to cytotoxic derivatives 3,5.
As an example of these approaches, we will visualize the ablation and regeneration of a subtype of retinal bipolar neuron within individual fish over several days. Simultaneously we will monitor several other retinal cell types, including neighboring non-targeted bipolar cells and potential degeneration-stimulated retinal stem cells (i.e., M&#971;ller glia). This strategy is being applied in our lab to characterize cell- and tissue-level (e.g., stem cell niche) responses to the selective loss and regeneration of targeted neuronal cell types.

In this video, techniques for multicolor confocal time-lapse imaging and targeted cell ablation are provided. Time-lapse imaging is used to monitor the behavior of multiple cell types of interest in vivo. Targeted cell ablation facilitates the study neural circuit function and cell-specific neuronal regeneration paradigms.

Multicolor Zeitraffer-Imaging transgener Zebrafische: Visualisierung von Retinal Stammzellen durch gezielte Nervenzellen Ablation Activated

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Zeitraffer-Mikroskopie der frühen Embryogenese in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

Quantitative Analyse der ungerichtete Migration von Zellen unter Verwendung Zeitraffer-Video-Mikroskopie

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

Langfristige, High-Resolution Konfokale Zeitraffer Bildgebung<em&gt; Arabidopsis Cotyledon</em&gt; Epidermis während der Keimung

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Hochauflösende Zeitraffer-Imaging und automatische Analyse von Dynamik der Mikrotubuli in lebenden menschlichen Endothelzellen aus der Nabelvene

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

Eine vielseitige Methode für die Montage von Arabidopsis verlässt für intravitalen Zeitraffer Aufnahmen

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

Spezifische Kennzeichnung von mitochondrialen Nukleoiden für die Zeitraffer-Struktur-Beleuchtungsmikroskopie

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because the larval body wall and most internal organs are transparent. However, continuous live imaging of intact Drosophila larvae for longer than 30 min has been challenging because it is difficult to noninvasively immobilizeimmobilizing larvae for a long time. Here we present a larval mounting method called LarvaSPA that allows for continuous imaging of live Drosophila larvae with high temporal and spatial resolution for longer than 10 hours. This method involves partially attaching larvae to the coverslip using a UV-reactive glue and additionally restraining larval movement using a polydimethylsiloxane (PDMS) block. This method is compatible with larvae at developmental stages from second instar to wandering third instar. We demonstrate applications of this method in studying dynamic processes of Drosophila somatosensory neurons, including dendrite growth and injury-induced dendrite degeneration. This method can also be applied to study many other cellular processes that happen near the larval body wall.

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

This protocol describes a method for mounting Drosophila larvae to achieve longer than 10 h of uninterrupted time-lapse imaging in intact live animals. This method can be used to image many biological processes close to the larval body wall.

LarvaSPA, Eine Methode zur Montage von Drosophila Larva für Langzeit-Zeitraffer-Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...