Wir danken der National Science Foundation (CHE-0847145) und die Henry Dreyfus Teacher-Scholar Awards Program für die großzügige Unterstützung dieser Forschung. Wir möchten ausdrücklich anerkennen Christine Davis, Direktor der Mikroskopie und Imaging in der Fakultät für Biologie an der University of Richmond für ihre Unterstützung bei der Querschnitts-Bildgebung. Besonderer Dank an Drs gegeben. T. Leopold, R. Kanters, D. Kellogg, R. Miller, und W. Case, sowie, Russ Collins, Phil Joseph, Carolyn Marks, Mandy Mallory und John Wimbush - von denen alle machen Undergraduate Research möglich an der Universität von Richmond. Ein sehr persönliches Dankeschön an alle aktuellen, vergangenen und zukünftigen Bachelor-Forscher in der Leopold Research Lab gegeben.

1. Hexanethiolate Monolayer Protected Goldcluster Synthese Hexanethiolate funktionalisierten Monoschicht geschützten Goldcluster (MPL) sind nach einem 2:1 1-Hexanthiol (C6), Gold Molverhältnis einer durchschnittlichen Struktur der Au 225 (C6) 75 zu produzieren. 4-9 Spezifische Änderungen an der Brust Reaktion synthetisiert, wie Ligand-Typ, bestimmte Thiol-to-Gold-Verhältnis, Temperatur und Reaktionszeit Fördermenge, oder Post-Synthese-Behandlungen, können 9-11 Ernte ein breites Spektrum von MPC mit unterschiedlichen Kerngrößen und funktionelle Schutz-Gruppe. 4 Die MPC ungefähre ( Durchschnitt) Kompositionen von MPC mit verschiedenen Alkanthiol Gruppen funktionalisiert werden durch Protonen (1 H) Kernspinresonanz (NMR)-Analyse von Jod-zerlegt Proben bestimmt werden. <ol><li> Lösen Sie 1,1 g Tetraoctylammoniumbromid (TOABr) in 30 ml Toluol mit entsprechenden Abzug Belüftung. </li><li> Lösen Sie 0,38 g Natriumborhydrid (NaBH 4) in ca. 20 ml 18 MOhm hochgereinigt Wasser (UP H 2 O) und lassen Sie sie über Eis für mindestens 30 min kalt stellen. </li><li> Lösen Sie 0,31 g Tetrachlorogoldsäure (HAuCl 4) in ca. 20 ml UP H 2 O und quantitativ die Lösung Mischung auf die TOABr-Toluol-Lösung mit einer zusätzlichen ~ 5 ml UP H 2 O, um Phasen-Transfer der wässrigen Gold Lösung für das nicht-wässrigen Lösung. Stir rigoros unter leichtem für 30 min begrenzt, so dass die gebrannte Orange wässrige und klare wässrige Phasen gut vermischen. </li><li> Übertragung sowohl der klaren wässrigen und nicht wässrigen Phasen Burnt Orange in einen Scheidetrichter. Verwerfen der wässrigen (unteren) Schicht und dekantieren des nicht-wässrigen (top)-Schicht in eine saubere Flasche. </li><li> Add C6 in einem Verhältnis von 2:1 mit HAuCl 4 der wässrigen Lösung. Stir für 30 min zu einer Au (I) polymer, wie durch einen Farbwechsel von rot-orange, um eine hellgelbe, fast farblose Lösung gefunden zu bilden. </li><li> Übertragen Sie die Reaktionsmischung auf eine isolierte Eisbad und Chill bis 0 ° C für mindestens 30 min unter Rühren. </li><li> Quantitativ und schnell fügen Sie die gekühlte NaBH 4-Lösung zum Reaktionsgemisch, um Au (I) auf ein metallisches Gold in Gegenwart von Thiolen zu reduzieren, sofort bildet eine dicke, schwarze Lösung von MPC bei der Zugabe. Stir Reaktion über Nacht bei 0 ° C. </li><li> Übertragen Sie die Reaktionsmischung in einen Scheidetrichter, verwerfen Sie die wässrige (untere Schicht) in einen Abfallbehälter Becherglas und Rotations-Verdampfung der wässrigen (oben) Toluolschicht in der Nähe komplette Trockenheit Verlassen eines schweren, schwarzen Schlamm in den Kolben. </li><li> Niederschlag den Mittelmeer-Partnerländern, indem Acetonitril und damit über Nacht sitzen. </li><li> Sammeln PLM nach Vakuumfiltration unter Verwendung einer Glasfritte mittlerer Porosität mit Gummi-Armaturen und Nebenwirkungen bewaffneten Kolben mit Aspirator und spülen Sie mit reichlich Acetonitril. </li><li> Lassen MPCs an der Luft trocknen, wiegen Produkt, charakterisieren durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und NMR-Analyse und Speicherung begrenzt für die zukünftige Verwendung. Erhalten TEM-Aufnahmen von Drop-Casting MPCs in Toluol auf Formvar / carbon Trägerfolie auf Kupfer Gitter (400 mesh) und den Betrieb des TEM Instrument 80-100 kV gelöst. Die durchschnittliche Kerngröße kann anhand Bildanalyse-Software wie Image J (freeware) werden. </li></ol> 2. Film Assembly: Dithiol-Verbindung MPC Film Assembly for Protein Monolayer Elektrochemie Die Gold-Substrat wird zunächst elektrochemisch gereinigt und verändert mit einer C6 SAM vor dem Eintauchen in abwechselnden Lösungen dithiol Verbindungsmoleküle und C6 geändert MPCs um ein &quot;dip-Zyklus&quot;, die mehrmals wiederholt, um schließlich bilden eine Dithiol-linked MPC Film Montage . Wie in früheren Studien beschrieben, 2 der ursprünglichen Plasmid für die Pseudomonas aeruginosa Azurin (AZ) Protein wurde freundlicherweise von Dr. Corey Wilson von der Rice University und AZ gegeben wurde, als eine gereinigte und lyophilisierte Pulver von der University of Richmond Professor Dr. Jonathan vorgesehen Dattelbaum, die anschließend mit 4,4 mM Kaliumphosphatpuffer (KPB, pH = 7,0, μ = 10 mM) wurde rehydriert zu einer 5-10 uM Lösung zu erstellen, wie durch UV-sichtbaren (UV-Vis) verifiziert. <ol><li> Montieren Sie die elektrochemischen (Echem) Sandwich-Zelle in der folgenden Reihenfolge von unten nach oben: Zuerst Lucite Halteplatte, gold Substrat als Arbeitselektrode, Messing elektrischen Kontakt zur Gold-Arbeitselektrode, zuerst Gummidichtung, Viton-O-Ring, dass die Elektrode Bereich definiert (0,32 cm 2), Glas Zellkörper, zweite Gummidichtung, und zweitens Lucite Halteplatte. Die gesamte Zelle wird zusammengehalten durch Gewindestangen gehalten und sorgfältig angezogen Flügelmuttern. Die Zelle ist mit einem handelsüblichen gekauft Referenzelektrode, dass ein Glaszylinder Häuser mit 1 M gesättigte KCl, Ag / AgCl Referenz-Draht und eine Pt-Hilfselektrode Draht montiert. </li><li> Elektrochemisch sauber the Goldsubstrat indem Cyclovoltammetrie (CV) in das Potenzial Fenster von 0,2 bis 0,9 V, 0,2 bis 1,2 V und 0,2 bis 1,35 V (gegen Ag / AgCl, KCl) bei 100 mV / s in einer Lösung von 0,1 MH 2 SO 4 und 0,01 M KCl. </li><li> Messen Sie den Ladestrom des gereinigten blanken Gold-Substrat, indem CV unter &quot;Normalbedingungen&quot;, darunter ein potenzielles Fenster von 0,1 bis 0,4 V (gegen Ag / AgCl, KCl) gescannt bei 100 mV / s in KPB. 1 Discard KPB und spülen nacheinander mit UP H 2 O, Ethanol (EtOH), UP H 2 O und EtOH. </li><li> Setzen Sie das gereinigte Goldsubstrat auf ~ 300 ul 5 mM C6-Lösung in EtOH und über Nacht sitzen, um eine geordnete C6 SAM zu bilden. Discard C6-Lösung aus der Zelle und spülen Sie nacheinander mit EtOH, UP H 2 O, EtOH und UP H 2 O. </li><li> Messen Sie den Ladestrom des SAM bei Standardbedingungen. Discard KPB und spülen Sie nacheinander mit UP H 2 O, EtOH, UP H 2 O und EtOH. Der Ladestrom sollte deutlich von der bloßen Gold Messung (Schritt 2.3) verringert werden. 1 </li><li> Setzen Sie das SAM modifizierte Gold-Substrat ~ 300 ul 5 mM 1,9-nonanedithiol (NDT)-Lösung in EtOH und lassen Sie sie für 1 Stunde auf interdisperse NDT sitzen Verknüpfung Moleküle innerhalb der C6 SAM. Discard NDT-Lösung und spülen Sie sukzessive und gründlich mit EtOH, UP H 2 O, EtOH, UP H 2 O, und Methylenchlorid (CH 2 Cl 2). </li><li> Setzen Sie den Gold-Substrat zu einer MPC-Lösung von CH 2 Cl 2 (~ 1 mg / mL) unter Rühren durch langsames Einleiten von N 2-Gas für 1 Stunde. Wenn nötig, ersetzen verdampft MPC Lösung mit mehr CH 2 Cl 2. Dies ist die Verankerung MPC Schicht der Folie Montage. Discard MPC-Lösung und sukzessive wieder gründlich mit CH 2 Cl 2, UP H 2 O, und KPB. </li><li> Messen Sie den Ladestrom des MPC-Schicht bei Standardbedingungen. Discard KPB und spülen Sie nacheinander mit UP H 2 O und CH 2 Cl 2. </li><li> Setzen Sie den Gold-Substrat auf ~ 300 ul 5 mM NDT Lösung von CH 2 Cl 2 unter Rühren durch langsames Einleiten von N 2-Gas für 20 min. </li><li> Discard NDT und gründlich mit CH 2 Cl 2. Wiederholen Sie die Schritte 2,7 und 2,8 auf den zweiten MPC Schicht der Folie Montage hinterlegen. </li><li> Um weitere MPC-Schichten, die Schritte 2.9 und 2.10 Kaution wiederholt werden. Mit jedem zusätzlichen MPC Schicht eine entsprechende Erhöhung der Ladestrom zu beobachten ist. </li><li> Nach der vernetzten MPC-Film abgeschlossen ist, spülen Sie den Film veränderte Substrat mit KPB. AZ-Protein ist auf der MPC-Film Montage durch Einspritzen von ~ 150 ul ~ 5-10 uM Lösung von AZ KPB in die Echem Sandwich-Zelle und damit zu sitzen verschlossen und im Kühlschrank mindestens 1 Stunde adsorbiert. </li><li> Entfernen Sie die Echem Zelle aus dem Kühlschrank und lassen Sie ihn in der Nähe von Raumtemperatur zurückzukehren. Gründlich mit KPB, füllen Echem Zelle mit KPB und Blase KPB gründlich mit N 2-Gas für 10 min. </li><li> Protein-Monoschicht elektrochemische Untersuchungen werden als CV in das Potenzial Fenster von -0,25 V durchgeführt bis 0,25 V (gegen Ag / AgCl, KCl) gescannt bei 100 mV / sec in KPB. </li></ol> 3. Film Assembly: Dithiol-Verbindung MPC Film Assembly for Optical-Tracking Vor wachsenden MPC Schichten für optische Auswertung werden Glasträger Abschnitte mit Piranha-Lösung (ACHTUNG! 02.01 konzentrierter H 2 SO 4 und H 2 O 2) vorgereinigt und mit (3-Mercaptopropyl)-trimethoxysilan (3-MPTMS ). 1-2 MPC Filme werden dann auf diese modifizierten Glas montiert Folien mit der &quot;dip-Zyklus&quot;-Technik wie zuvor beschrieben. <ol><li> Spülen Sie ein 3-MPTMS modifizierte Glasträger mit CH 2 Cl 2 und stellen Sie es in einer MPC-Lösung von CH 2 Cl 2 (~ 1 mg / mL) für 1 h unter Rühren auf einem Schüttler bei niedriger Geschwindigkeit. Damit ist der erste MPC Schicht der Folie Montage durch Verankerung MPCs der Mercaptane Endgruppen des Silans. Spülen Sie die Folie gründlich mit CH 2 Cl 2, trocken und mit N 2-Gas. Werfen Sie einen UV-Vis-Spektrum (400 bis 1000 nm) der Folie, und spülen Sie wieder mit CH 2 Cl 2. </li><li> Legen Sie die Folie in einer 5 mM NDT Lösung von CH 2 Cl 2 für 1 Stunde unter Rühren auf einem Schüttler bei niedriger Geschwindigkeit. Spülen Sie die Folie mit CH 2 Cl 2. </li><li> Legen Sie die Folie in einer MPC-Lösung für 1 Stunde unter Rühren auf einem Schüttler bei niedriger Geschwindigkeit. Damit ist die zweite MPC Schicht der Folie Montage. Spülen Sie die Folie gründlich mit CH 2 Cl 2, trocken, mit N 2-Gas, und werfen Sie einen UV-Vis-Spektrum (400 bis 1000 nm) der Folie. Die Absorption über das gesamte Spektrum sollte zunehmend als zusätzliche MPC Schichten, um den Film Montage adsorbiert werden. </li><li> Um weitere MPC-Schichten, Str. Kautioneps 3,2-3,3 wiederholt werden. </li></ol> 4. Charakterisierung der Monolayer Protected Gold-Cluster Film Assemblies von Cross Sectional Transmission Electron Microscopy TEM-Querschnitte sind durch re-embedding en face eingebetteten Filmen. 2, 12 Hierzu wird zunächst Anbringen eines MPC-Film auf einem 3-MPTMS modifizierte Glasträger auf ein sauberes, Standard-Mikroskop montiert getan Dauerpräparate mit Embed 812 Epoxidharz für erlaubt verbessertes Handling während des Verfahrens weiter unten. Seien Sie vorsichtig mit der aufgebrachten Wärme höheren Temperaturen wird die PLM innerhalb des Films zu zersetzen. <ol><li> Mix einbetten 812 Epoxidharz und damit für mindestens 12 Stunden zu verdicken. </li><li> Füllen Sie eine &quot;00&quot; BEEM Kapsel mit Epoxidharz und invertieren auf der Oberseite des MPC Film Probe (hergestellt in Abschnitt 3). Legen Sie den Druck auf die Kapsel, so dass eine Blase an der Spitze der Kapsel steigt, wodurch eine Abdichtung zwischen dem Epoxidharz und MPC Film Probe. Lassen Sie für mindestens 18 Stunden bei 60 ° C polymerisieren und dann kühlen die Dias auf Raumtemperatur. </li><li> Hitze gerahmte Dias für 20 sec auf einem Aluminium-Heizplatte bei 200 ° C, um die Entfernung des Blocks mit angeschlossenem MPC en face Film zu erleichtern. </li><li> Schneiden Sie die Probe mit dem Film aus der BEEM Kapsel Block mit einem Juwelier gesehen. </li><li> Re-betten die zu entfernende Bereich in einem Silizium-flache Form mit dem MPC-Film nach oben mit Blick auf den Innenraum des Siliziums gut. Füllen Sie das Silizium auch mit Epoxidharz bei Raumtemperatur und lassen Sie es mindestens 18 Stunden bei 60 ° C polymerisieren Kühlen Sie die Probe auf Raumtemperatur. </li><li> Erhalten dünne Probe Abschnitten von 60-80 nm auf einem Leica UCT Ultramikrotom mit einem Diamant-Messer Schnitte senkrecht geschnitten, um des Messers Schneide. </li><li> Ort geschnitten Abschnitte über Formvar / carbon Trägerfolie auf Kupfer Gitter (400 mesh) und nehmen TEM-Aufnahmen vorbereitet Querschnitte der MPC-Film Baugruppen. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3441/3441fig1.jpg" /> Abbildung 1 Double-Layer-Ladestrom Überwachung des MPC Film Wachstum für insgesamt 5 Eintauchen Zyklen (Wechsel Exposition gegenüber MPC und NDT-Lösungen). Ladestrom erhöht systematisch mit jedem Eintauchen Zyklus, den Zusatz &quot;Schichten&quot; des MPC, um den Film (Abb. 2). Die Cyclovoltammogramme wurden unter Verwendung eines potentiellen Fenster von 0,1 bis 0,4 V (gegen Ag / AgCl, KCl) bei 100 gescannten mV / s in 4,4 mM Kaliumphosphatpuffer (pH = 7,0, μ = 10 mm). Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von ML Vargo, CP Gulka, JK Gerig, CM Manieri, JD Dattelbaum, CB Marks, NT Lawrence, ML Trawick und MC Leopold, Langmuir 26 (1), 560-569. Copyright 2010 American Chemical Society. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3441/3441fig2.jpg" /> Abbildung 2 (a) Schematische Darstellung der AZ Protein adsorbiert zu einem Dithiol-linked MPC Film Montage. (B) Typische Cyclovoltammogramm für AZ adsorbiert MPC Film Montage unter Verwendung eines potentiellen Fenster von -0,25 bis +0,25 V (gegen Ag / AgCl, KCl) bei 100 mV / s gescannt in 4,4 mM Kaliumphosphatpuffer (pH = 7,0, μ = 10 mm). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3441/3441fig3.jpg" /> Abbildung 3 Vertreter UV-Vis spektralen Überwachung einer Dithiol-linked MPC Film Wachstum auf einem 3-MPTMS modifizierte Glasträger. Ein Sprung Zyklus besteht aus einer Exposition der Glasträger zu NDT Linker Lösung folgte ein Engagement in MPC-Lösung. Jeder weitere Dip Ergebnisse des Wachstums in der Schichtdicke und einer gleichzeitigen Absorption zu erhöhen. Da die Zahl der Tauchzyklen steigt, ist die Oberflächen-Plasmon-Band allmählich bei ~ 520 nm definiert. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von ML Vargo, CP Gulka, JK Gerig, CM Manieri, JD Dattelbaum, CB Marks, NT Lawrence, ML Trawick und MC Leopold, Langmuir 26 (1), 560-569. Copyright 2010 American Chemical Society. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3441/3441fig4.jpg" /> Abbildung 4 Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) Querschnitt Bildanalyse einer Dithiol-linked MPC Film Montage. Kleines Bild: Typische TEM-Aufnahme von hexanethiolate funktionalisierten MPCs in dem Film Montage verwendet. TEM-Analyse ermittelt eine durchschnittliche Gold Kerndurchmesser von den Mittelmeer-Partnerländern zu ~ 2 nm mit Hilfe von Image J-Analyse. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von ML Vargo, CP Gulka, JK Gerig, CM Manieri, JD Dattelbaum, CB Marks, NT Lawrence, ML Trawick und MC Leopold, Langmuir 26 (1), 560-569. Copyright 2010 American Chemical Society.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Protein-Monoschicht Elektrochemie ist eine effektive Technik, um Wechselwirkungen zwischen Redox-Proteinen und synthetischen adsorptive Plattformen zu studieren. Die Wirksamkeit dieser Strategie ist jedoch abhängig von der Fähigkeit, eine Adsorption-Schnittstelle mit einem hohen Grad an molekularer Ebene steuern Ingenieur. Die MPC-basierten Plattformen, die das Protokoll erstellt stellen speziell entwickelt Plattformen, die in der Lage, eine homogenere Proteinadsorption Umgebung 3 ermöglichen und erleichte...

<table border="1"><tr><th> Name des Reagenzes und Ausrüstung </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> Tetraoctylammoniumbromid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 294136 </td></tr><tr><td> Natriumborhydrid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 213462 </td></tr><tr><td> Tetrachlorogoldsäure </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 254169-5G </td></tr><tr><td> 1-Hexanthiol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 234192 </td></tr><tr><td> Transmission Electron Microscope </td><td> JEOL </td><td> 1010 </td></tr><tr><td> Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer </td><td> Bruker Avance </td><td> 300 MHz </td></tr><tr><td> Formvar / carbon Trägerfolie auf Kupfer Gitter (400 mesh) </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> FCF400-Cu </td></tr><tr><td> Gold-Substrat </td><td> Verdampft Metall Films Corp </td><td> Brauch </td></tr><tr><td> Ag / AgCl Referenz-Elektrode </td><td> Mikroelektroden, Inc. </td><td> MI-401F </td></tr><tr><td> Potentiostaten </td><td> CH Instruments, Inc. </td><td> CHI650A, CHI610B </td></tr><tr><td> 1,9-Nonanedithiol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N29805 </td></tr><tr><td> (3-Mercaptopropyl)-trimethoxysilan </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 175617 </td></tr><tr><td> Ultraviolet Visible Spectrophotometer </td><td> Agilent </td><td> 8453 </td></tr><tr><td> Embed 812 Epoxidharz </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 14120 </td></tr><tr><td> &quot;00&quot; BEEM Kapsel </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 70000-B </td></tr><tr><td> Silicon flache Form </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 70900 </td></tr><tr><td> Diamant-Messer </td><td> Diatome </td><td> 21-ULE, S12801 </td></tr></table>

synthesis, assembly, and characterization of monolayer protected gold nanoparticle films for protein monolayer electrochemistry

Kolloidales Gold-Nanopartikel geschützt mit Alkanthiolat Liganden genannt Monoschicht geschützten Goldcluster (MPL) synthetisiert und anschließend in Film-Baugruppen, die als Adsorptions-Plattformen für Protein-Monoschicht Elektrochemie (PME) dienen. PME ist als Modellsystem für die Untersuchung elektrochemischer Eigenschaften von Redox-Proteine, indem man sie auf eine Adsorption Plattform auf eine modifizierte Elektrode, die auch als Redox-Partner für Elektronentransfer (ET)-Reaktionen eingesetzt. Studien haben gezeigt, dass Gold-Nanopartikel Film Versammlungen dieser Art für eine homogenere Proteinadsorption Umgebung zu schaffen und zu fördern ET ohne Abstandsabhängigkeit im Vergleich zu den traditionellen Systemen mit Alkanthiol selbstorganisierten Monoschichten (SAM) geändert. In diesem Papier und der MPL 3.1 funktionalisiert mit hexanethiolate Liganden synthetisiert werden unter Verwendung eines modifizierten Brust Reaktion 4 und charakterisiert mit UV-sichtbaren (UV-Vis-Spektroskopie), Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und Proton (1 H) Kernspinresonanz (NMR). MPC Filme sind auf SAM modifizierten Goldelektrode Schnittstellen mit einem &quot;dip-Zyklus&quot; Methode der alternierenden MPC Schichten und dithiol Verbindungsmoleküle montiert. Film Wachstum bei Gold-Elektrode elektrochemisch durch die Messung von Veränderungen der Double-Layer-Ladestrom des Systems verfolgt. Analog-Filme auf Silan modifizierte Glasträger montiert ermöglichen optische Überwachung von Film-Wachstum und Querschnitts-TEM-Analyse liefert eine geschätzte Schichtdicke. Während Film Montage, Manipulation der MPC-Ligand-Schutz sowie die interpartikulären Gelenkmechanismus für vernetzte Filme, die leicht anpassbar sind erlaubt, eine Schnittstelle mit Redox-Protein mit verschiedenen Adsorptions-Mechanismus. Zum Beispiel kann Pseudomonas aeruginosa Azurin (AZ) hydrophob zu Dithiol-linked Filme hexanethiolate MPCs und Cytochrom c (Cyt c) können elektrostatisch mit einer Carbonsäure modifizierten MPC Grenzschicht immobilisiert werden adsorbiert werden. In diesem Bericht haben wir auf dem Film-Protokoll für die AZ-System ausschließlich konzentrieren. Untersuchungen, die die Adsorption von Proteinen an MPC modifizierten synthetischen Plattformen könnte weiter das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Biomolekülen und künstliche Materialien, und somit Hilfe zur Entwicklung von Biosensor-Systeme, ET Modellierung von Systemen und synthetischen biokompatiblen Materialien. 5-8

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Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Alkanthiolat stabilisiert Goldkolloide als Monoschicht geschützt Cluster (MPL) bekannt sind, synthetisiert, charakterisiert und montiert zu dünnen Filmen als Adsorptions-Schnittstelle für Protein-Monoschicht Elektrochemie von einfachen Redox-Protein wie<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Azurin (AZ) und Cytochrom<em&gt; C</em&gt; (Cyt<em&gt; C</em&gt;).

Synthesis, Assembly und Charakterisierung von Monolayer Protected Gold-Nanopartikeln Films für die Protein-Monoschicht Elektrochemie

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

synthesis-assembly-characterization-monolayer-protected-gold

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.4K Aufrufe.  University of Richmond. Alkanthiolat stabilisiert Goldkolloide als Monoschicht geschützt Cluster (MPL) bekannt sind, synthetisiert, charakterisiert und montiert zu dünnen Filmen als Adsorptions-Schnittstelle für Protein-Monoschicht Elektrochemie von einfachen Redox-Protein wie Pseudomonas aeruginosa Azurin (AZ) und Cytochrom C (Cyt C).

Serie: Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

Gold Nanostar Synthesis mit einem Silver Seed vermitteltes Wachstum Methode

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Forschung

Biotechnik

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the monitoring of therapeutic efficiency.1-3 The circulating low molecular weight proteome (LMWP) composed of small proteins shed from tissues and cells or peptide fragments derived from the proteolytic degradation of larger proteins, has been associated with the pathological condition in patients and likely reflects the state of disease.4,5 Despite these potential clinical applications, the use of Mass Spectrometry (MS) to profile the LMWP from biological fluids has proven to be very challenging due to the large dynamic range of protein and peptide concentrations in serum.6 Without sample pre-treatment, some of the more highly abundant proteins obscure the detection of low-abundance species in serum/plasma. Current proteomic-based approaches, such as two-dimensional polyacrylamide gel-electrophoresis (2D-PAGE) and shotgun proteomics methods are labor-intensive, low throughput and offer limited suitability for clinical applications.7-9 Therefore, a more effective strategy is needed to isolate LMWP from blood and allow the high throughput screening of clinical samples. 
Here, we present a fast, efficient and reliable multi-fractionation system based on mesoporous silica chips to specifically target and enrich LMWP.10,11 Mesoporous silica (MPS) thin films with tunable features at the nanoscale were fabricated using the triblock copolymer template pathway. Using different polymer templates and polymer concentrations in the precursor solution, various pore size distributions, pore structures, connectivity and surface properties were determined and applied for selective recovery of low mass proteins. The selective parsing of the enriched peptides into different subclasses according to their physicochemical properties will enhance the efficiency of recovery and detection of low abundance species. In combination with mass spectrometry and statistic analysis, we demonstrated the correlation between the nanophase characteristics of the mesoporous silica thin films and the specificity and efficacy of low mass proteome harvesting. The results presented herein reveal the potential of the nanotechnology-based technology to provide a powerful alternative to conventional methods for LMWP harvesting from complex biological fluids. Because of the ability to tune the material properties, the capability for low-cost production, the simplicity and rapidity of sample collection, and the greatly reduced sample requirements for analysis, this novel nanotechnology will substantially impact the field of proteomic biomarker research and clinical proteomic assessment.

We developed a technology based on mesoporous silica thin film for the selective recovery of low molecular weight proteins and peptides from human serum. The physico-chemical properties of our mesoporous chips were finely tuned to provide substantial control in peptide enrichment and consequently profile the serum proteome for diagnostic purposes.

Niedermolekulare Protein Enrichment auf mesoporösem Siliciumdioxid Dünnschichten für Biomarker Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with conventional one-sample-at-a-time synthesis techniques, a more recent high-throughput approach has been developed enabling the synthesis and testing of large libraries of polyanhydrides1. This will facilitate more efficient optimization and design process of these biomaterials for drug and vaccine delivery applications. The method in this work describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries. In this robotically operated method (Figure 1), linear actuators and syringe pumps are controlled by LabVIEW, which enables a hands-free automated protocol, eliminating user error. Furthermore, this method enables the rapid fabrication of micro-scale polymer libraries, reducing the batch size while resulting in the creation of multivariant polymer systems. This combinatorial approach to polymer synthesis facilitates the synthesis of up to 15 different polymers in an equivalent amount of time it would take to synthesize one polymer conventionally. In addition, the combinatorial polymer library can be fabricated into blank or protein-loaded geometries including films or nanoparticles upon dissolution of the polymer library in a solvent and precipitation into a non-solvent (for nanoparticles) or by vacuum drying (for films). Upon loading a fluorochrome-conjugated protein into the polymer libraries, protein release kinetics can be assessed at high-throughput using a fluorescence-based detection method (Figures 2 and 3) as described previously1. This combinatorial platform has been validated with conventional methods2 and the polyanhydride film and nanoparticle libraries have been characterized with 1H NMR and FTIR. The libraries have been screened for protein release kinetics, stability and antigenicity; in vitro cellular toxicity, cytokine production, surface marker expression, adhesion, proliferation and differentiation; and in vivo biodistribution and mucoadhesion1-11. The combinatorial method developed herein enables high-throughput polymer synthesis and fabrication of protein-loaded nanoparticle and film libraries, which can, in turn, be screened in vitro and in vivo for optimization of biomaterial performance.

This method describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries.

Kombinatorische Synthese von und High-Throughput-Protein Release von Polymer Film-und Nanopartikel-Bibliotheken

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of this hydrogel are two protein block-copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. A highly hydrophilic random coil is inserted into one of the block-copolymers for water retention. Mixing of the two protein block copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit with crosslinkers at either end that rapidly self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is very stable under both acidic and basic conditions, at temperatures up to 50 &#176;C, and in organic solvents. The hydrogel rapidly reforms after shear-induced rupture. Incorporation of a &#34;docking station peptide&#34; into the hydrogel building block enables convenient incorporation of &#34;docking protein&#34;-tagged target proteins. The hydrogel is compatible with tissue culture growth media, supports the diffusion of 20 kDa molecules, and enables the immobilization of bioactive globular proteins. The application of the intein-mediated protein hydrogel as an organic-solvent-compatible biocatalyst was demonstrated by encapsulating the horseradish peroxidase enzyme and corroborating its activity.

We present the synthesis of a split-intein-mediated protein hydrogel. The building blocks of this hydrogel are two protein copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. Mixing of the two protein copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit that self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is highly pH- and temperature-stable, compatible with organic solvents, and easily incorporates functional globular proteins.

Synthese einer Intein-vermittelten Protein-Hydrogel Künstliche

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

Fluorescence Recovery nach der Zusammenführung ein Droplet, um die zweidimensionale Diffusion eines Phospholipidschicht Messen

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control over the drug release. However, most of the relevant technologies are still in the development process and are unprocurable by clinics. Here, we describe a facile fabrication of these photo-responsive NPs with commercially available gold NPs and thermo-responsive liposomes. Calcein is used as a model drug to evaluate the encapsulation efficiency and the release kinetic profile upon heat/light stimulation. Finally, we show that this photo-triggered release is due to the membrane disruption caused by microbubble cavitation, which can be measured with hydrophone.

This protocol describes a simple preparation method for gold nanoparticle integrated photo-responsive liposomes with the commercially available materials. It also shows how to measure the microbubble cavitation process of the synthesized liposomes upon the treatment of pulsed laser.

Synthese von Gold-Nanopartikeln Integrated Photo-responsive Liposomen und Messung ihrer Mikroblasen Kavitation auf Pulse Laseranregung

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Mikrostrukturierung und Montage von 3D-Micro-Ader

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs). Achieving sufficient cellular uptake of SPIONs is a challenge that has traditionally been met by exposing cells to elevated concentrations of SPIONs or by prolonging exposure times (up to 72 hr). However, these strategies are likely to mediate toxicity. Here, we present the synthesis of the protein-based SPION magnetoferritin as well as a facile surface functionalization protocol that enables rapid cell magnetization using low exposure concentrations. The SPION core of magnetoferritin consists of cobalt-doped iron oxide with an average particle diameter of 8.2 nm mineralized inside the cavity of horse spleen apo-ferritin. Chemical cationization of magnetoferritin produced a novel, highly membrane-active SPION that magnetized human mesenchymal stem cells (hMSCs) using incubation times as short as one minute and iron concentrations as lows as 0.2 mM.

A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.

Synthese von kationisiertem Magnetoferritin für ultraschnelle Magnetisierungs von Zellen

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Synthesis of Functionalized 10-nm Polymer-coated Gold Particles for Endothelium Targeting and Drug Delivery

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting and drug delivery are some of the applications of these AuNPs, but endothelial extracellular matrices&#39; defensive properties hamper particle uptake. To address this issue, we describe a synthesis method for ultrasmall gold nanoparticles to improve vascular delivery, with customizable functional groups and polymer lengths for further adjustments. The protocol yields 2.5 nm AuNPs that are capped with tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC). The replacement of THPC with hetero-functional polyethylene glycol (PEG) on the surface of the AuNP increases the hydrodynamic radius to 10.5 nm while providing various functional groups on the surface. The last part of the protocol includes an optional addition of a fluorophore to allow the AuNPs to be visualized under fluorescence to track nanoparticle uptake. Dialysis and lyophilization were used to purify and isolate the AuNPs. These fluorescent nanoparticles can be visualized in both in vitro and in vivo experiments due to the biocompatible PEG coating and fluorescent probes. Additionally, the size range of these nanoparticles render them an ideal candidate for probing the glycocalyx without disrupting normal vasculature function, which may lead to improved delivery and therapeutics.

We describe a method of synthesizing biocompatible 10-nm gold nanoparticles, functionalized by coating poly-ethylene glycol onto the surface. These particles can be used in vitro and in vivo for delivering therapeutics to nanoscale cellular and extracellular spaces that are difficult to access with conventional nanoparticle sizes.

Synthese von funktionalisierten 10 nm Polymer beschichteten Goldpartikeln für Targeting Endothel und Drug-Delivery

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting ...

Assembly and Characterization of Biomolecular Memristors Consisting of Ion Channel-doped Lipid Membranes

The ability to recreate synaptic functionalities in synthetic circuit elements is essential for neuromorphic computing systems that seek to emulate the cognitive powers of the brain with comparable efficiency and density. To date, silicon-based three-terminal transistors and two-terminal memristors have been widely used in neuromorphic circuits, in large part due to their ability to co-locate information processing and memory. Yet these devices cannot achieve the interconnectivity and complexity of the brain because they are power-hungry, fail to mimic key synaptic functionalities, and suffer from high noise and high switching voltages. To overcome these limitations, we have developed and characterized a biomolecular memristor that mimics the composition, structure, and switching characteristics of biological synapses. Here, we describe the process of assembling and characterizing biomolecular memristors consisting of a 5 nm-thick lipid bilayer formed between lipid-functionalized water droplets in oil and doped with voltage-activated alamethicin peptides. While similar assembly protocols have been used to investigate biophysical properties of droplet-supported lipid membranes and membrane-bound ion channels, this article focuses on key modifications of the droplet interface bilayer method essential for achieving consistent memristor performance. Specifically, we describe the liposome preparation process and the incorporation of alamethicin peptides in lipid bilayer membranes, and the appropriate concentrations of each constituent as well as their impact on the overall response of the memristors. We also detail the characterization process of biomolecular memristors, including measurement and analysis of memristive current-voltage relationships obtained via cyclic voltammetry, as well as short-term plasticity and learning in response to step-wise voltage pulse trains.

Soft, low-power, biomolecular memristors leverage similar composition, structure, and switching mechanisms of bio-synapses. Presented here is a protocol to assemble and characterize biomolecular memristors obtained from insulating lipid bilayers formed between water droplets in oil. The incorporation of voltage-activated alamethicin peptides results in memristive ionic conductance across the membrane.

Montage und Charakterisierung der biomolekularen Memristors bestehend aus Ionenkanal-dotierte Lipidmembranen

The ability to recreate synaptic functionalities in synthetic circuit elements is essential for neuromorphic computing systems that seek to emulate the ...