Wir danken dem Hamilton-Programmierer und Spezialisten für anhaltende Unterstützung und Eva Blaas für die technische Unterstützung. T5-207: SJ wird durch Ti-Pharma unterstützt; Diese Arbeit wurde von zwei NWO Investitionszuschüsse (911-07-031 und 40-00506-98-10011), The Prinses Beatrix Fonds Wetenschapsprijs 2009 und der Neuroscience Campus Amsterdam unterstützt.

1. Automatisierte adhärente Zellkultur-Verfahren (Abbildung 1) 20 <ol><li> Bereiten Sie die automatisierte Zellkultur-System für die Eingabe von Zellkultur-Platten. Legen Sie Verbrauchsmaterialien (z. B. Pipettenspitzen, Zellkultur-Platten, Assay-Platten) in das System mit Hilfe der grafischen Benutzeroberfläche (GUI). Für ausreichende Zellkulturmedien, Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und Trypsin in das Robot-System. </li><li> Manuelles Samen zwei OmniTray Platten mit 2 x 10 6 Zellen pro Platte, der SH-SY5Y Neuroblastom-Zelllinie. Pflegen Sie Zellen in Opti-MEM mit 10% fötalem Rinderserum (FBS). Legen Sie die Platten in der Zellkultur Roboters über das GUI. Die Zellen werden bei 37 ° C und 5% CO 2 inkubiert werden. </li><li> Wählen Sie die Zellkultur-Protokoll eingeleitet 20 sein muss. Man kann von einem adhärente Zellkultur-Prozess 22, Kultivierung und Expansion von embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) der Maus Feeder-Zellen 23 oder Kultivierung der Aussetzung cel wähltels 22. </li><li> Wählen Sie die adhärente Zellkultur-Protokoll (Abbildung 1) und sorgen für adhärente Zelllinie spezifische Parameter-Dateien sind so eingestellt, dass die Einmündung Schwelle (Bereich der OmniTray Platte, die Zellen enthält) auf 70% gesetzt wird. Set insgesamt Trypsinierung Zeit, um zwei Minuten. </li><li> Weisen Sie den Roboter zu neuen OmniTray Platten vorzubereiten, mit einer Aussaat Zellzahl von 2 x 10 6 Zellen pro Platte. </li><li> Eingang OmniTray Platten in die Zellkultur in einem automatisierten adhärente Zellkultur-Protokoll (Abbildung 1). Dieses Protokoll umfasst die folgenden Schritte aus: Platten werden inkubiert und abgebildet, bis sie den vordefinierten Zusammenfluss Schwelle zu erreichen. Wenn Zellen nicht erreichen Zusammenfluss Schwelle innerhalb von 5 Lesungen, sind Platten aus dem System entfernt. Beim Erreichen der benutzerdefinierten Zusammenfluss Schwelle, werden die Zellen gewaschen, trypsiniert und gezählt. Eine vordefinierte Anzahl von Zellen zu neuen OmniTray Platten gegeben und wenn es eine ausreichende Anzahl von Zellen, einer bestimmten tauber von Assay-Platten sind an Deck transportiert und eine definierte Anzahl von Zellen verzichtet in jedes Well. Assay-Platten können direkt abgebildet werden mit dem integrierten Mikroskop oder Output aus dem System zur weiteren Verarbeitung. </li><li> Weisen Sie das System auf 4 Assay-Platten pro OmniTray Platte vorbereiten, mit einer Gesamtfläche von 5.000 Zellen pro Vertiefung. </li></ol> 2. shRNA Virus Produktion und Beschichtung in Assay-Platten (Dauer: 6 Tage) <ol><li> Wachsen Bakterien Glycerin Aktien, welche die shRNA-Vektoren (Open Biosystems, TRC1) über Nacht in 2 ml Luria-Bertani-Medium Medien mit 100 ug / ml Ampicillin (Sigma-Aldrich). </li><li> Auszug Plasmide nach dem Protokoll des Herstellers (Promega Wizard MagneSil Tfx). </li><li> Produce Virus mit dem RNAi Consortium High-Throughput Lentivirale Produktion (96-Well-Platte) Protokoll 24. Arbeiten mit Lentivirus ist relativ sicher, weil die Viruspartikel zur Transduktion verwendet replikationsdefizient und Split-Gen Verpackung Strategien sind für ihre Produktion verwendet. Doch bei der Arbeit mit Lentivirus, sind zusätzliche biologische Sicherheit erforderlichen Verfahren, um das Risiko, sich selbst und andere 25 zu minimieren. Alle Experimente müssen in einem MLII oder BSL2 Sicherheitsniveau Labor durchgeführt werden. Alle Kunststoffe (Pipetten, Plastikgeschirr, Medien), die in Kontakt mit Lentivirus Partikel hätte sein sollen mit Bleichmittel für 24 Stunden vor der Entsorgung inkubiert werden. </li><li> Berechnen Sie die Multiplizität der Infektion (MOI) der Lentivirus durch Ermittlung des Prozentsatzes der GFP-positiven Zellen mit dem pLKO.1 GFP-Plasmid (Sigma-Aldrich). </li><li> Platte Lentivirus in Assay-Platten, mit einer MOI von 3. </li></ol> 3. Lentivirale Transduktion und neuronale Differenzierung von SH-SY5Y Zellen (Dauer: 6 Tage) <ol><li> Die Zellen werden auf die Assay-Platten gegeben (siehe Schritt 1.7). Last-Assay-Platten, die shRNA Lentivirus in die automatisierte Zellkultur-System. </li><li> Nach 24 Stunden, die Medien auf dieAssay-Platten werden Opti-MEM geändert werden, das 0,5% FBS und 0,1 uM Retinsäure auf die Differenzierung zu beginnen. Differenzierung von SH-SY5Y Zellen ermöglicht die Visualisierung von neuritischen Strukturen und synchronisiert die Zellteilung. </li><li> Weiter Inkubation der Testplatten bei der Differenzierung Medien für 5 Tage. Dies gewährleistet maximale Zuschlag von Ziel-Gen-Expression. </li><li> Am Tag 5 mit 50 uM H 2 O 2 auf die Hälfte der Assay-Platten für 24 Stunden auf die Translokation von DJ1 zu den Mitochondrien stimulieren. </li><li> Am Tag 6, fügen Mitotracker CmxROS (Invitrogen) zu den Zellen, in einer Endkonzentration von 200 nM pro Vertiefung und inkubieren bei 37 ° C für 30 Minuten. </li><li> Man kann das System Speicherfolien direkt mit dem HC-Imager oder Platten können aus dem System zur weiteren Verarbeitung exportiert werden zu unterweisen. </li></ol> 4. Automatisierte Immunfärbung von Assay-Platten (Dauer: 2 Tage) Die Bildqualität ist paramount für die Durchführung eines empfindlichen und zuverlässigen HCS. Schäden an der zellulären Monoschicht durch ungenaue Pipettieren kann zu schlechter Bildqualität und reproduzierbare Ergebnisse führen. Um Zellschicht Schaden zu minimieren, wurde die Immunfärbung unter Verwendung eines Roboter-Station. Das Verfahren ist ähnlich wie eine, die zuvor 26 beschrieben, sondern wurde angepasst, um den Durchsatz zu erhöhen und Verbrauchsmaterialien Nutzung. <ol><li> Fix-Zellen mit 100 ul 4% Paraformaldehyd auf 37 vorgewärmten ° C. Inkubieren für 20 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Wash-Zellen mit 200 ul PBS für 5 Minuten, 3 mal. </li><li> Inkubieren Testplatten mit 200 ul PBS mit 0,1% Triton (PBST) für 10 Minuten. </li><li> Wash-Zellen mit 200 ul PBS für 5 Minuten, 3 mal. </li><li> Inkubieren Assay-Platten mit 200 pl Blockpuffer (PBST mit 5% FBS) für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Wash-Zellen mit 200 ul PBS für 5 Minuten, 3 mal. </li><li> Inkubieren mit dem follaufgrund Primärantikörper über Nacht bei 4 ° C: <ol><li> Goat DJ1 N20 (Santa Cruz, 5 pg / ml) </li><li> Kaninchen β-III Tubulin (Sigma-Aldrich, 1 pg / ml) </li></ol></li><li> Am folgenden Tag, waschen Sie die Zellen mit 200 ul PBS für 5 Minuten, 3 mal. </li><li> Inkubieren Testplatten mit den folgenden Sekundärantikörper 1 Stunde bei Raumtemperatur: <ol><li> AlexaFluor 488 Esel anti-Ziege (Invitrogen, 2 pg / ml) </li><li> AlexaFluor 647 Ziege Anti-Kaninchen (Invitrogen, 2 pg / ml </li></ol></li><li> Wash-Zellen mit 200 ul PBS für 5 Minuten, 3 mal. </li><li> Inkubieren Zellen mit Hoechst (Invitrogen, 1 pg / ml) für 10 Minuten. </li><li> Wash-Zellen mit 200 ul PBS für 5 Minuten, 3 mal. </li><li> Shop-Platten bei 4 ° C, bis sie abgebildet werden kann. </li></ol> 5. Hoher Gehalt Bildaufnahme und Bildanalyse (Dauer: 5 Tage) <ol><li> Bild insgesamt 30 Felder pro Well mit dem 20x Objektiv. Visualisieren Sie DJ1 mit dem FITC-Filter gesetzt, die Mitochondrien mit der TRITC-Filter gesetzt, β-III Tubulin mit dem Cy5 Filter gesetzt und die Kerne mit dem UV-Filter-Set (Abbildung 3). </li><li> Analysieren Sie die Bilder mit der Compartmental Analysis BioApplication (Cellomics, ThermoFisher), um die durchschnittliche Intensität der Mitotracker Signal innerhalb der Mitochondrien zu bestimmen. (4B, F). </li><li> Zur Bestimmung der durchschnittlichen Überlappung Koeffizient zwischen DJ1 und den Mitochondrien, analysieren die Bilder mit der Cellomics Kolokalisation BioApplication (Cellomics, ThermoFisher). Definieren regions of interest (ROI) wie folgt: ROI A - Kern (Abbildung 4A, E), ROI B - Mitochondrien (Abbildung 4 B, F). Ausschließen ROI A von ROI B der Analyse von nur das Zytoplasma zu gewährleisten. Definieren Sie die Mitochondrien als Zielregion I und DJ1 als Zielregion II (4C, G). </li><li> Analysieren Sie die Bilder mit Hilfe der neuronalen Profiling BioApplication (Cellomics, ThermoFisher), um die durchschnittliche Länge der Neuriten aus der β-III Tubulin-Färbung (Abbildung Spur4D, H). </li><li> Speicherfolien mit dem Opera LX automatisierte konfokalen Leser (Perkin-Elmer). Bild insgesamt 30 Felder pro Well mit dem 60x Objektiv mit Eintauchen in Wasser. Visualisieren Mitochondrien mit der 561 nm-Laser und Kerne mit UV-Anregung. </li><li> Analysieren Sie die Bilder mit der Spot-Edge-Ridge (SER) Texturmerkmalen Algorithmus. Die SER-Ridge-Filter überträgt Intensität in Pixel bilden Kamm-Mustern. Je fragmentierter die Mitochondrien, desto höher ist die SER-Ridge-Score (Abbildung 8). </li></ol> 6. Datennormalisierung und Analyse <ol><li> Importieren Sie die Daten aus der Bildanalyse-Software in die BioConductor CellHTS2-Paket für die R-Software-Umgebung (R-Version 2.11.1, BioConductor Version 2.6). </li><li> Logarithmus zur Basis (2) Transformation der Daten vor dem pro Platte Median basierte Normalisierung 27, 28. Wenden Sie nicht die Varianz Anpassung pro Platte. </li><li> Zur Identifizierung von Modifikatoren für einen Phänotyp, verwenden Sie eine Zwei-Wege-ANOVA zwischen den different Behandlungsgruppen dh Scrambled infizierten unbehandelten Zellen vs verschlüsselt Toxin behandelten Zellen vs Zielgen unbehandelten Zellen vs Zielgen behandelten Zellen (Abbildungen 5-7). </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Mutationen innerhalb DJ1 führen zu frühem Beginn-rezessiven Parkinson 21, aber es ist unklar, wie Verlust von DJ1 Anlass zu der Krankheits-Phänotyp. Es ist bekannt, dass defizienten Zellen von DJ1 anfälliger für oxidativen Stress induzierten Zelltod und in Reaktion auf oxidativen Stress, DJ1 transloziert aus dem Zytoplasma in die Mitochondrien 29, 30 sind. Mit dem Bau HC-Assays für diese Phänotypen zu überwachen, können wir Gene identifizieren, die oder regulieren beeinflussen Phänotypen mit DJ1 verbunden. Dieser Ansatz kann helfen, entschlüsseln die Signalwege innerhalb der DJ1 Funktionen und dass in der Krankheitsentstehung beteiligt sein könnten. Beispiel für eine epistatisch Interaktion mit DJ1 (Abbildung 5): Knockdown von DJ1 in Zellen ausgesetztauf Toxin führt zu einer größeren Verlust der Lebensfähigkeit der Zellen (BAR-B: image-B), um Zellen mit Rührei Lentivirus infiziert Vergleich (BAR-A: image-A). Knockdown des Zielgens A hat eine ähnliche Wirkung wie die in Zellen mit einer DJ1 Knockdown (BAR-C: image-C) beobachtet. Knockdown der beiden DJ1 und Zielgen A führt zu einer deutlich größeren Verlust der Lebensfähigkeit der Zellen als Verlust einer der beiden Gen allein (BAR-D:-D Bild). Dies deutet auf eine epistatisch Interaktion zwischen DJ1 und Zielgen A. Beispiel eines Gens regulieren DJ1 Translokation (Abbildung 6): Wenn die Zellen mit einem Toxin ausgesetzt sind, DJ1 transloziert aus dem Zytoplasma in die Mitochondrien, die durch eine höhere Überschneidung Koeffizient zwischen DJ1 und die Mitochondrien (BAR-A quantifiziert wird: image Ein Vergleich BAR-C: Bild C). In Zellen, in denen Zielgen B zum Schweigen gebracht worden ist, weniger DJ1 transloziert zu den Mitochondrien, wenn die Zellen sind, um das Toxin ausgesetzt. Dies deutet darauf hin, dass Zielgen B ist auf den Transport von DJ1 in die Mitochondrien beteiligt. (BAR-B:<html> Bild B und BAR-D: Bild D) Beispiel für ein Gen in Neuronenauswuchs (Abbildung 7) beteiligt: ​​Knockdown des Zielgens C in Wildtyp-SH-SY5Y Zellen führt zu einer deutlichen Erhöhung der Neuritenlänge (BAR-B: image-B), um Zellen mit Lentiviren Ausdruck verschlüsselt infiziert Vergleich shRNA (BAR-A: Bild A). Dieser Effekt wird in Zellen mit Toxin (BAR-C und D) inkubiert verloren. Beispiel für ein Gen in der mitochondrialen Morphologie (Abbildung 8) beteiligt: ​​Die Infektion von Wildtyp-SH-SY5Y Zellen mit shRNA Targeting-Gen D führt zu einer Abnahme in der mitochondrialen SER-Ridge-Segmentierung Wert (Abbildung 8, Bild C und D) im Vergleich zu Zellen mit Rührei Lentivirus (Abbildung 8, Bild A und B) infiziert. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3452/3452fig1_lg.jpg"><img alt="Abbildung 1." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig1.jpg" /></a> Abbildung 1 Überblick über die automatisierte Zellkultur-Protokoll.: ntent &quot;&gt; <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3452/3452fig2_lg.jpg"><img alt="Abbildung 2." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig2.jpg" /></a> Abbildung 2 Schematische Darstellung der Screening-Prozess, Bildanalyse und statistischen Methoden während der Screening-Verfahren verwendet:. I) Die Zellen werden kultiviert, bis sie konfluent und anschließend vernickelt in der Assay-Platten, die die shRNA Lentivirus sind. Die Zellen werden für 5 Tage differenziert und Toxin wird dann auf die Platten für 24 Stunden zugegeben. Assay-Platten werden von dem System und immungefärbt. Die Zeit, für jeden der Prozesse genommen ist in Klammern angegeben. ii) Daten erfasst mit einem HC-Imager (Zelllebensfähigkeit, Protein-Translokation und Neuronenauswuchs) und einem automatisierten konfokalen Imager (mitochondriale Morphologie). Daten zu CellHTS2 Paket innerhalb R exportiert, Basis (2) transformiert und normalisiert anmelden. Zwei-Wege-ANOVA wird verwendet, um signifikante Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Variablen zu identifizieren. Abbildung 3. Composite-Bilder von Zellen durch HC Bildgebung erworben. A) Unbehandelte Zellen, B) Zellen mit H 2 O 2 behandelt. DJ1 ist grün, die Mitochondrien in rot und die Zellkerne in blau gekennzeichnet. Neuriten Färbung ist nicht hervorgehoben. <img alt="Abbildung 4." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig4.jpg" /> Abbildung 4. Quantifizierung der mehrere zelluläre Funktionen aus einer HCS erhalten. AD) Unbehandelte SH-SY5Y Zellen. EH) H 2 O 2 behandelt SH-SY5Y Zellen. A, E) Kerne Segmentierung und Definition von ROI A, B, F) Identifizierung und Quantifizierung von Mitochondrien, ROI B, C, G) Identifizierung von DJ1, Target-Kanal II; D, G) Identifizierung und Berechnung der durchschnittlichen Neuritenlänge. Cells nahe an den Rand des Bildes aus der Analyse ausgeschlossen. Inset sind Bilder vor der Analyse. <imgalt = &quot;Bild 5&quot;. src = &quot;/ files/ftp_upload/3452/3452fig5.jpg&quot; /&gt; Abbildung 5. Identifizierung eines Gens in Epistase mit DJ1 (Briefe an den Stäben auf die Beschriftung der Bilder entsprechen). Bilder A bis D sind SH-SY5Y Zellen mit Mitotracker CMXRos (rot), die für die Quantifizierung von Zell-Gesundheit verwendet wurde beschriftet. <img alt="Abbildung 6." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig6.jpg" /> Abbildung 6. Identifizierung eines Gens regulieren DJ1 Translokation (Briefe an den Stäben auf die Beschriftung der Bilder entsprechen). Bilder A bis D sind SH-SY5Y Zellen für DJ1 (grün), Mitochondrien (rot) und Zellkerne (blau), die für die Quantifizierung der DJ1 Translokation in den Mitochondrien eingesetzt wurden beschriftet. <img alt="Abbildung 7." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig7.jpg" /> Abbildung 7. Identifizierung eines Gens in Neuronenauswuchs beteiligt (Briefe an den Stäben auf die Beschriftung der Bilder entsprechen). Bilder A bis D sind SH-SY5Y Zellen für β-III Tubulin (grün) und Zellkerne (blau), die für die Quantifizierung der Neuritenlänge verwendet wurden beschriftet. <img alt="Abbildung 8." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig8.jpg" /> Abbildung 8. Identifizierung eines Gens bei der Regulierung der mitochondrialen Morphologie beteiligt. Bild A und C sind zusammengesetzte Bilder von SH-SY5Y Zellen mit Rührei shRNA oder shRNA Targeting-Gen D bzw. infiziert. Mitochondrien sind rot gefärbt, während Kerne in blau gefärbt sind. Bild B und D sind Visualisierungen der SER-Ridge Quantifizierung.

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+normalization+methods+for+Drosophila+RNAi+genomic+screens+and+development+of+a+robust+validation+scheme.">An analysis of normalization methods for Drosophila RNAi genomic screens and development of a robust validation scheme.</a> J. Biomol. Screen. 13, 777-784 (2008).</li><li>Canet-Aviles, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease+protein+DJ-1+is+neuroprotective+due+to+cysteine-sulfinic+acid-driven+mitochondrial+localization.">The Parkinson's disease protein DJ-1 is neuroprotective due to cysteine-sulfinic acid-driven mitochondrial localization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 9103-9108 (2004).</li><li>Blackinton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+a+stabilized+cysteine+sulfinic+acid+is+critical+for+the+mitochondrial+function+of+the+parkinsonism+protein+DJ-1.">Formation of a stabilized cysteine sulfinic acid is critical for the mitochondrial function of the parkinsonism protein DJ-1.</a> J. Biol. Chem. 284, 6476-6485 (2009).</li><li>Gupta, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+selective+inhibitors+of+cancer+stem+cells+by+high-throughput+screening.">Identification of selective inhibitors of cancer stem cells by high-throughput screening.</a> Cell. 138, 645-659 (2009).</li><li>Luo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+RNAi+screen+identifies+multiple+synthetic+lethal+interactions+with+the+Ras+oncogene.">A genome-wide RNAi screen identifies multiple synthetic lethal interactions with the Ras oncogene.</a> Cell. 137, 835-848 (2009).</li><li>Mouchet, E. H., Simpson, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+assays+in+oncology+drug+discovery:+opportunities+and+challenges.">High-content assays in oncology drug discovery: opportunities and challenges.</a> IDrugs. 11, 422-427 (2008).</li><li>Vogt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos.">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Dev. Dyn. 238, 656-663 (2009).</li><li>Pardo-Martin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+in+vivo+vertebrate+screening.">High-throughput in vivo vertebrate screening.</a> Nat. Methods. 7, 634-636 (2010).</li><li>Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens.">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> J. Vis. Exp. (40), e1900-e1900 (2010).</li><li>Ross, P. J., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+complex+neuropsychiatric+disease+with+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling complex neuropsychiatric disease with induced pluripotent stem cells.</a> F1000. Biol. Rep. 2, 84-84 (2010).</li><li>Ebert, A. D., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cells+and+drug+screening:+opportunities+and+challenges.">Human stem cells and drug screening: opportunities and challenges.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 9, 367-372 (2010).</li><li>An, W. F., Tolliday, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+assays+for+high-throughput+screening.">Cell-based assays for high-throughput screening.</a> Mol. Biotechnol. 45, 180-186 (2010).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren

Mit der sinkenden Kosten für HT / HC zelluläre Screening-Systeme, mit der Verfügbarkeit von leistungsfähigen genomweiten Werkzeuge, um Genfunktionen verändern kombiniert werden HT / HC-Bildschirme zum Alltag in der Wissenschaft. Der Ansatz wurde bereits erfolgreich auf den verschiedensten Bereichen der Forschung wie die Identifizierung von Drug Targets in der Krebstherapie 9, 31-33 und 34-36 der Embryonalentwicklung angelegt und hat sogar das Potenzial für den Einsatz in der Entschlüsselung der Signalwege in neuropsychiatrischen Störungen 37,38 beteiligt. Doch die Umsetzung eines solchen Systems erfordert einen erheblichen Aufwand an Zeit und Aufwand bei der Prozessoptimierung oft unter ein Minimum von 6 Monaten. Alle Schritte, wie Trypsinierung Zeiten, Pipettieren Geschwindigkeiten und Aussaatdichten müssen angepasst werden, um sicherzustellen, dass die Zellen gesund sind und wachsen ständig. Prävention von bakterieller Kontamination ist eine der schwierigsten Herausforderungen für automatisierte Zellkultur mit wöchentlicher Reinigung Protokolle in combination mit konstanter Spülung aller Gleitlagerröhre Linien mit 70% Ethanol, die für frei von Verunreinigungen Kulturen. Es wird auch notwendig sein, die Robotik zu verbessern, so dass zusätzliche Instrumente, wie die konfokale Mikroskope für eine höhere Auflösung und -80 ° C Tiefkühltruhen für Compound Storage integriert werden kann. Es gibt auch Einschränkungen, die angegangen, um die empfindlichen, Geschwindigkeit und Nutzen dieser Methode, um Gen-Netzwerke zu studieren und zu identifizieren Gene in pathogenen molekularen Mechanismen beteiligt zu verbessern werden müssen. Zur Durchführung einer HT / HC-Bildschirm und sicherstellen, dass zuverlässige Daten erhoben werden, haben verschiedene Aspekte optimiert werden. Erstens ist die Zuverlässigkeit der Messung entscheidend und ist abhängig von der Robustheit und Empfindlichkeit des Tests. Zum Beispiel sind die oben beschriebenen Assays geeignet für kleinere Bildschirme, sind aber schwierig, auf einer genomweiten Maßstab, aufgrund der Anzahl Verarbeitungsschritte vor der Bildaufnahme erforderlich sind, umzusetzen.So müsste man, um stabile Zelllinien, die Reporter-Gen, das für die direkte Bildgebung erlauben würde und zu einer verminderten Variation aufgrund der reduzierten Anzahl von Bearbeitungsschritten zu konstruieren. Derzeit Gestaltung eines Assays, die genau zeigt und zuverlässig quantifiziert einem Phänotyp von Interesse ist ein großer Engpass bei der HC Screening-Prozess. Viele Bildschirme sind in Säugetierzellen mit unterschiedlichen RNAi-Bibliotheken, die alle aus dem Off-Target-Effekte, begrenzt Gen-Silencing Effizienz und unvollständiger Genomabdeckung leiden durchgeführt. So Bibliotheken müssen gemacht, die sind spezifischer, potenter und haben eine bessere Abdeckung werden. Die Bemühungen sind im Gange, um zu schaffen, wie Es ist zu hoffen, solche Bemühungen wird die Reproduzierbarkeit der HT / HC Eindrehen verbessern<html> en Treffer. Eine Einschränkung der viele großformatige Zelle based screens sind, dass sie in Neuroblastom-Zellen durchgeführt werden, weil sie genetisch manipuliert werden kann und kultiviert, um eine große Anzahl mit relativer Leichtigkeit. Allerdings ist die Relevanz der &quot;Besucher&quot; in ex vivo Zellkultur-Modellen zu identifizieren in vivo-Funktion fragwürdig, zumal das Gehirn von hoch spezialisierten Zelltypen, die ein dichtes und kompliziertes Netzwerk von synaptischen Verbindungen zu funktionieren, wie eine hoch integrierte Einheit bilden besteht. Als Folge ist es üblich, dass Zugriffe, die anhand des Screening-Ansatzes oben beschrieben, sind in Sekundär-Bildschirme mit zusätzlichen Techniken und in mehr physiologisch relevanten Modelle 39 validiert. Zur Verbesserung der Übersetzung Zugriffe während HCS identifiziert, müssen repräsentativer und komplexer Modelle, wie zB primären Zellen und differenzierten Stammzellen oder Co-Kultur-Systemen entwickelt und angepasst für HT / HC Ansätze. ntent &quot;&gt; Mit einer Kombination aus automatisierten Zellkultur-und HC-Bildgebung kann man schnell gewinnen neue Einblicke, wie Neuronen funktionieren und welche Wege sind wichtig, um die Entwicklung der Krankheit. Kombinieren HCS / HTS-Daten mit Informationen aus anderen&quot; Gebieten der &quot;Ansätze generiert, wird es dann möglich sein, eine Systembiologie Überblick über Erkrankungen des Gehirns zu konstruieren, und erleichtert so therapeutischen Entwicklung.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> AI.CELLHOST </td><td> HAMILTON </td><td> <a href="http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/">http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/</a> </td></tr><tr><td> OPTI-MEM </td><td> INVITROGEN </td><td> 31985-054 </td></tr><tr><td> Retinsäure </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> R2625 </td></tr><tr><td> OmniTray PLATES </td><td> NUNC </td><td> 465219 </td></tr><tr><td> 96 WELL Kulturplatten </td><td> GRENIER </td><td> 655086 </td></tr><tr><td> DJ1 N20 ANTIKÖRPER </td><td> SANTA CRUZ </td><td> SC27004 </td></tr><tr><td> BETA-III Tubulin-Antikörper </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> T3952 </td></tr><tr><td> MitoTracker CMXROS </td><td> INVITROGEN </td><td> M-7512 </td></tr><tr><td> Hoechst-33342 </td><td> INVITROGEN </td><td> H1399 </td></tr><tr><td> WASSERSTOFFPEROXID </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> 216763-100ML </td></tr><tr><td> TRYPSIN </td><td> INVITROGEN </td><td> 25050014 </td></tr><tr><td> Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung </td><td> INVITROGEN </td><td> 14190086 </td></tr><tr><td> Promega Wizard MagneSil TFX </td><td> PROMEGA </td><td> A2380 </td></tr><tr><td> ShRNA CLONES </td><td> OPEN BIOSYSTEMS </td><td> <a href="http://www.openbiosystems.com/RNAi/shRNALibraries/TRCLibraryDetails/">http://www.openbiosystems</a>.com / RNAi / shRNALibraries / TRCLibraryDetails / </td></tr><tr><td> Cellomics Bioanwendungen </td><td> THERMO-FISHER </td><td> <a href="http://www.thermo.com/hcs">http://www.thermo.com/hcs</a> </td></tr></tbody></table>

high content screening in neurodegenerative diseases

Die funktionellen Annotation von Genomen, Aufbau von molekularen Netzwerken und neuartige Drug-Target-Identifizierung, sind wichtige Herausforderungen, die als eine Angelegenheit von großer Dringlichkeit 1-4 angegangen werden müssen. Mehrere komplementäre den Gebieten der &quot;-Ansätze haben Hinweise auf die genetischen Risikofaktoren und pathogene Mechanismen zahlreicher neurodegenerativer Erkrankungen zur Verfügung gestellt, aber die meisten Ergebnisse noch erfordern eine funktionale Validierung 5. Zum Beispiel ist eine aktuelle genomweiten Assoziationsstudie für Parkinson (PD) identifizierten sich viele neue loci als Risikofaktoren für die Erkrankung, aber die zugrunde liegende ursächliche Variante (n) oder pathogenen Mechanismus nicht 6, 7 bekannt. Da jeder zugehörigen Bereich mehrere Gene enthalten können, wäre die funktionelle Bewertung der einzelnen Gene auf Phänotypen mit der Krankheit assoziiert, mit traditionellen zellbiologischen Techniken zu lange dauern. Es gibt auch eine Notwendigkeit, die molekularen Netzwerke zu verstehen, die aufGenmutationen, die Phänotypen sie verursachen. Es wird erwartet, dass Krankheitsphänotypen das Ergebnis der vielfältigen Wechselwirkungen, die gestört haben. Wiederaufbau dieser Netzwerke mit traditionellen molekularen Methoden würden zeitaufwendig sein. Darüber hinaus werden Netzwerk-Vorhersagen aus unabhängigen Studien der einzelnen Komponenten, den Reduktionismus Ansatz, wahrscheinlich unterschätzen die Komplexität des Netzwerks 8. Diese Unterschätzung könnte zum Teil erklären die niedrige Erfolgsquote der Arzneimittelzulassung aufgrund von unerwünschten oder toxischen Nebenwirkungen. Der Erwerb von einem Netzwerk Perspektive der Krankheit verbundenen Wege mit HT / HC zelluläre Screening-Methoden, und Feststellung der wichtigsten Knoten innerhalb dieser Signalwege könnte zur Identifizierung von Zielen, die besser geeignet für eine therapeutische Intervention sind zu führen. High-Throughput-Screening (HTS) ist eine ideale Methode, um diese Probleme 9-12 Adresse. aber die traditionellen Methoden wurden eindimensionale ganzen gut Zell-Assays, die Vereinfachung verwendetstic Anzeigen für komplexe biologische Prozesse. Sie waren nicht in der Lage, gleichzeitig zu quantifizieren viele Phänotypen bei neurodegenerativen Erkrankungen wie axonalen Transport Defizite oder Änderungen in der Morphologie Eigenschaften 13, 14 beobachtet. Dieser Ansatz konnte nicht verwendet werden, um die dynamische Natur der zellulären Prozessen oder pathogene Ereignisse, die in einer Untergruppe von Zellen auftreten zu untersuchen. Zur Quantifizierung solcher Merkmale muss man, um multi-dimensionale Phänotypen bewegen bezeichnet High-Content Screening (HCS) 4, 15-17. HCS ist die zell-basierte Quantifizierung von mehreren Prozessen gleichzeitig, das eine detailliertere Darstellung der zellulären Antwort auf verschiedene Störungen bietet im Vergleich zu HTS. HCS hat viele Vorteile gegenüber HTS 18, 19, aber die Durchführung einer Hochdurchsatz-(HT)-High-Content-(HC)-Bildschirm in neuronalen Modellen ist problematisch wegen der hohen Kosten, ökologische Vielfalt und menschliche Fehler. Um zelluläre Reaktionen auf eine &quot;phenomics &#39;scale erkennenmit HC Bildgebung muss man Variation und Fehler zu reduzieren, bei gleichzeitiger Erhöhung der Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit. Hier beschreiben wir eine Methode, um präzise und zuverlässig durchzuführen shRNA Bildschirme mit automatisierten Zellkultur 20 und HC Imaging in neuronalen Zellen Modellen. Wir beschreiben, wie wir diese Methode verwendet, um Modulatoren für ein bestimmtes Protein, DJ1, die, wenn mutiert Ursachen autosomal rezessiv Parkinsonismus 21 identifizieren. Die Kombination der Vielseitigkeit der HC-Bildgebung mit HT-Methoden ist es möglich, genau zu quantifizieren eine Vielzahl von Phänotypen. Dies könnte dann genutzt werden, um unser Verständnis des Genoms, die Wege in der Krankheitsentstehung beteiligt sind vorab zu identifizieren sowie potentielle therapeutische Targets werden.

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High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

Wir beschreiben eine Methode kombiniert automatisierte Zellkultur mit High-Content-Bildgebung zur Visualisierung und Quantifizierung von mehreren zellulären Prozessen und Strukturen, in einem High-Throughput Weise. Solche Methoden können in der weiteren funktionellen Annotation von Genomen Hilfe sowie zu identifizieren Krankheit Gen-Netzwerke und mögliche Angriffspunkte für Medikamente.

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

17.4K Aufrufe.  VU University Medical Center. Wir beschreiben eine Methode kombiniert automatisierte Zellkultur mit High-Content-Bildgebung zur Visualisierung und Quantifizierung von mehreren zellulären Prozessen und Strukturen, in einem High-Throughput Weise. Solche Methoden können in der weiteren funktionellen Annotation von Genomen Hilfe sowie zu identifizieren Krankheit Gen-Netzwerke und mögliche Angriffspunkte für Medikamente.

Serie: High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Parkinson's disease (PD) is the second most common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is the most important risk factor, cases of PD will increase during the next decades 2. Next to pathological protein folding and impaired protein degradation pathways, alterations of mitochondrial function and morphology were pointed out as further hallmark of neurodegeneration in PD 3-11.
After years of research in murine and human cancer cells as in vitro models to dissect molecular pathways of Parkinsonism, the use of human fibroblasts from patients and appropriate controls as ex vivo models has become a valuable research tool, if potential caveats are considered. Other than immortalized, rather artificial cell models, primary fibroblasts from patients carrying disease-associated mutations apparently reflect important pathological features of the human disease.
Here we delineate the procedure of taking skin biopsies, culturing human fibroblasts and using detailed protocols for essential microscopic techniques to define mitochondrial phenotypes. These were used to investigate different features associated with PD that are relevant to mitochondrial function and dynamics. Ex vivo, mitochondria can be analyzed in terms of their function, morphology, colocalization with lysosomes (the organelles degrading dysfunctional mitochondria) and degradation via the lysosomal pathway. These phenotypes are highly relevant for the identification of early signs of PD and may precede clinical motor symptoms in human disease-gene carriers. Hence, the assays presented here can be utilized as valuable tools to identify pathological features of neurodegeneration and help to define new therapeutic strategies in PD.

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson&#039;s Disease

Fibroblasts from patients carrying mutations in Parkinson's disease-causing genes represent an easily accessible ex vivo model to study disease-associated phenotypes. Live cell imaging gives the opportunity to study morphological and functional parameters in living cells. Here we describe the preparation of human fibroblasts and subsequent monitoring of mitochondrial phenotypes.

Die Verwendung von primären humanen Fibroblasten zur Überwachung Mitochondriale Phänotypen auf dem Gebiet der Parkinson-Krankheit

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Forschung

Medizin

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

Screening für Melanom Modifiers mit einem Zebrafisch Autochthone Tumormodell

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Diffusion Tensor Magnetic Resonance Imaging in the Analysis of Neurodegenerative Diseases

Diffusion tensor imaging (DTI) techniques provide information on the microstructural processes of the cerebral white matter (WM) in vivo. The present applications are designed to investigate differences of WM involvement patterns in different brain diseases, especially neurodegenerative disorders, by use of different DTI analyses in comparison with matched controls. 	
DTI data analysis is performed in a variate fashion, i.e. voxelwise comparison of regional diffusion direction-based metrics such as fractional anisotropy (FA), together with fiber tracking (FT) accompanied by tractwise fractional anisotropy statistics (TFAS) at the group level in order to identify differences in FA along WM structures, aiming at the definition of regional patterns of WM alterations at the group level. Transformation into a stereotaxic standard space is a prerequisite for group studies and requires thorough data processing to preserve directional inter-dependencies. The present applications show optimized technical approaches for this preservation of quantitative and directional information during spatial normalization in data analyses at the group level. On this basis, FT techniques can be applied to group averaged data in order to quantify metrics information as defined by FT. Additionally, application of DTI methods, i.e. differences in FA-maps after stereotaxic alignment, in a longitudinal analysis at an individual subject basis reveal information about the progression of neurological disorders. Further quality improvement of DTI based results can be obtained during preprocessing by application of a controlled elimination of gradient directions with high noise levels.	
In summary, DTI is used to define a distinct WM pathoanatomy of different brain diseases by the combination of whole brain-based and tract-based DTI analysis.

Diffusion tensor imaging (DTI) basically serves as an MRI-based tool to identify in vivo the microstructure of the brain and pathological processes due to neurological disorders within the cerebral white matter. DTI-based analyses allow for application to brain diseases both at the group level and in single subject data.

Diffusion Tensor Magnetic Resonance Imaging in der Analyse von neurodegenerativen Erkrankungen

Diffusion tensor imaging (DTI) techniques provide information on the microstructural processes of the cerebral white matter (WM) in vivo. The present ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In-vivo-19 F-MRT für die Zellverfolgung

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Detection of Disease-associated &#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &#945;-synuclein

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) in experimental models of synucleopathies. A transgenic mouse line (M83) over-expressing the human A53T &#945;S and spontaneously developing a dramatic clinical phenotype between eight and 22 months of age, characterized by symptoms including weight loss, prostration, and severe motor impairment, was used in this study. For molecular analyses of &#945;SD (disease-associated &#945;S) in these mice, an ELISA was designed to specifically quantify &#945;SD in sick mice. Analysis of the central nervous system in this mouse model showed the presence of &#945;SD mainly in the caudal brain regions and the spinal cord. There were no differences in &#945;SD distribution between different experimental conditions leading to clinical disease, i.e., in uninoculated and normally aging transgenic mice and in mice inoculated with brain extracts from sick mice. The specific detection of &#945;SD immunoreactivity using an antibody against Ser129 phosphorylated &#945;S by ELISA essentially correlated with that obtained by Western blot and immunohistochemistry. Unexpectedly, similar results were observed with several other antibodies against the C-terminal part of &#945;S. The propagation of &#945;SD, suggesting the involvement of a &#8220;prion-like&#8221; mechanism, can thus be easily monitored and quantified in this mouse model using an ELISA approach.

Detection of Disease-associated &amp;#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &amp;#945;-synuclein

An ELISA offering a novel quantitative approach is described. It specifically detects disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) in a transgenic mouse model (M83) of synucleinopathy using several antibodies against either the Ser129 phosphorylated &#945;S form or the C-terminal part of the protein.

Nachweis von krankheitsassoziierten α-Synuclein durch verbesserte ELISA im Gehirn von transgenen Mäusen Expression Menschen A53T Mutierte α-Synuclein

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) ...

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet &#946;-cells remains an attractive strategy. &#946;-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain &#946;-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify &#946;-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a &#946;-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on &#946;-cells and the molecular mechanisms that regulate &#946;-cell growth.

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &amp;#946;-cell Replication Discovery Platform

Critical challenges for the diabetes research field are to understand the molecular mechanisms that regulate islet &#946;-cell replication and to develop methods for stimulating &#946;-cell regeneration. Herein a high-content screening method to identify and assess the &#946;-cell replication-promoting activity of small molecules is presented.

Ein hoher Gehalt<em&gt; In Vitro</em&gt; Pancreatic Islet β-Zell-Replikation-Discovery-Plattform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be important in the development of future novel therapies. Often&#160;potential new biomarkers do not make it&#160;into the clinic&#160;due to limitations&#160;in their development and&#160;high costs.&#160;However,&#160;targeted proteomics using Multiple Reaction Monitoring Liquid Chromatography-tandem/Mass Spectrometry (MRM LC-MS/MS), specifically using triple quadrupole mass spectrometers, is one method that can be used to rapidly evaluate and validate biomarkers&#160;for clinical translation into diagnostic laboratories. Traditionally, this platform has been used extensively for measurement of small molecules&#160;in clinical laboratories, but it is the potential to analyze proteins, that makes it an attractive alternative to ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-based methods. We describe here how targeted proteomics can be used to measure multiplexed markers of dementia, including the detection and quantitation of the known risk factor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4).
In order to make the assay suitable for translation, it is designed to be rapid, simple, highly specific and cost effective. To achieve this, every step in the development of the assay must be optimized for the individual proteins and tissues they are analyzed in. This method describes a typical workflow including various tips and tricks to developing a targeted proteomics MRM LC-MS/MS for translation.
The method development is optimized using custom synthesized versions of tryptic quantotypic peptides, which calibrate&#160;the MS for detection and then spiked into CSF to determine correct identification of the endogenous peptide in the chromatographic separation prior to analysis in the MS. To achieve absolute quantitation, stable isotope-labeled internal standard versions of the peptides with short amino acid sequence tags and containing a trypsin cleavage site, are included in the assay.

We describe a high-throughput, multiplex, and targeted proteomic cerebrospinal fluid (CSF) assay developed with potential for clinical translation. The test can quantitate potential markers and risk factors for neurodegeneration, such as the apolipoprotein E variants (E2, E3 and E4), and measure their allelic expression.

Ein hoher Durchsatz, Multiplexed und Proteom-CSF-Assay Gezielte Quantifizieren Neurodegenerative Biomarkers und Apolipoprotein E Isoformen-Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular plasticity or damage occurring overtime and in relation to neuronal activity or blood flow. In vivo two-photon microscopy allows the study of the structural and functional plasticity of large cellular units in the living brain. In particular, the thinned-skull window preparation allows the visualization of cortical regions of interest (ROI) without inducing significant brain inflammation. Repetitive imaging sessions of cortical ROI are feasible, providing the characterization of disease hallmarks over time during the progression of numerous CNS diseases. This technique accessing the pial structures within 250 &#956;m of the brain relies on the detection of fluorescent probes encoded by genetic cellular markers and/or vital dyes. The latter (e.g., fluorescent dextrans) are used to map the luminal compartment of cerebrovascular structures. Germane to the protocol described herein is the use of an in vivo marker of amyloid deposits, Methoxy-O4, to assess Alzheimer&#39;s disease (AD) progression. We also describe the post-acquisition image processing used to track vascular changes and amyloid depositions. While focusing presently on a model of AD, the described protocol is relevant to other CNS disorders where pathological cerebrovascular changes occur.

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

This manuscript describes a procedure to track the remodeling of the cerebrovasculature during amyloid plaque accumulation in vivo using longitudinal two-photon microscopy. A thinned-skull preparation enables the visualization of fluorescent dyes to assess the progression of cerebrovascular damage in a mouse model of Alzheimer&#39;s disease.

in Längsrichtung<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging des Cerebrovasculature: Bedeutung für ZNS-Erkrankungen

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in atherosclerosis development. However, an important factor in early stages of atheroma plaque formation is cholesterol efflux capacity to HDL (the ability of HDL particles to accept cholesterol from macrophages) in order to avoid foam cell formation. This is a key step in avoiding the accumulation of cholesterol in the endothelium and a part of reverse cholesterol transport (RCT) to eliminate cholesterol through the liver. Cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool that can be used as biomarker for atherosclerosis. Traditionally, [3H]-cholesterol has been used in cholesterol efflux assays. In this study, we aim to develop a safer and faster strategy using fluorescent labelled-cholesterol (NBD-cholesterol) in a cellular assay to trace the cholesterol uptake and efflux process in THP-1-derived macrophages. Finally, we optimize and standardize the NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.

Measurement of in vitro cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool as a biomarker for atherosclerosis. In the present study, we optimize and standardize a fluorescent NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.

Hochdurchsatz-Nitrobenzoxadiazole-Label Cholesterin-Efflux-Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

A High-Throughput Electrochemiluminescence 7-Plex Assay Simultaneously Screening for Type 1 Diabetes and Multiple Autoimmune Diseases

Islet autoantibodies (IAbs) are widely used in type 1 diabetes (T1D) diagnosis and prediction. Four major IAbs to insulin (IAA), glutamate decarboxylase-65 (GADA), insulinoma antigen-2 (IA-2A), and zinc transporter-8 (ZnT8A) are equally important in disease prediction. Presently, up to 40% of patients diagnosed with T1D go on to develop other autoimmune disorders. Unfortunately, current screening methods using a single autoantibody for measurement are laborious and inefficient for large scale screening studies. We recently developed a simple multiplexed electrochemiluminescence (ECL) assay to address these current issues. The assay combines all 7 autoantibody tests into one well. Each well includes three IAbs (IAA, GADA, and IA-2A), autoantibodies to thyroid peroxidase (TPOA) and thyroid globulin (ThGA) to detect autoimmune thyroid disease, autoantibodies to tissue transglutaminase (TGA) for celiac disease, and autoantibodies to interferon alpha (IFN&#945;A) for autoimmune polyglandular syndrome-1 (APS-1); all of which screen for T1D and other relevant autoimmune diseases, simultaneously. The multiplex ECL assay is based on the single ECL assay platform, but instead uses the multiplex plate combining multiple autoantibody assays, up to 10, into a single well. The main difference from the single ECL assay is that each antibody-antigen complex formed in the fluid-phase is restrained onto a specific spot on each well through a linker system on the multiplex plate. The 7-Plex ECL assay, in the present study, is validated against standard radio-binding assays (RBA) and single ECL assays, using a large cohort of newly diagnosed T1D patients and age-matched healthy controls, resulting in excellent assay sensitivity and specificity.

We model a simple multiplexed ECL assay that combines 7 autoantibody assays together. The assay is capable of screening for T1D and multiple other autoimmune diseases, simultaneously, including celiac disease, autoimmune thyroid disease, and autoimmune polyglandular syndrome 1.