This work was supported by NIDDK grants DK098143 and DK101530 from the NIH (JPA), Stanford's Spectrum Child Health Research Institute (CHRI) and SPARK (UL1 TR001085, JPA).

Dieses Protokoll wurde in Übereinstimmung mit der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) von der Stanford University School of Medicine durchgeführt. 300 g - Das beschriebene Protokoll wird von sechs 250 für Inselisolierung skaliert (8 - 9 Wochen alte) männliche Sprague-Dawley-Ratten, die 228 Wells einer 384-Well-Platte für die Inselzellen-Replikationsabschätzung zu erzeugen ausreichend ist. 1. Material Vorbereitung <ol><li> Bereiten Beschichtungsmedien vor Beginn der Inselisolierung durch den konditionierten Medien von 804G Rattenblasenkarzinom - Zellen bei Konfluenz für 3 Tage (20 ml RPMI1640) gehalten Sammeln in einer 15 cm - Gewebekulturschale 28. Sterilfilter und zu speichern (-20 ° C) das konditionierte Medium für die spätere Verwendung. </li><li> Sterilisieren chirurgische Instrumente (eine 12 cm Zahngewebe Zange, ein 11,5 cm feinen Schere, ein 14,5 cm chirurgische Scheren, zwei 16 cm gebogenen Pinzette, ein 12 cm gebogen hemostat, ein 12 cm Skalpell Griff) und ein 30 mesh Gewebe Sieb vor initiating Inselisolierung. </li><li> Vorbereitung pankreatischen Verdauungslösung durch eine 60% ​​zum Auflösen: 40% Mischung von gereinigtem Klasse I: Klasse II Kollagenasen (total Kollagenase - Aktivität von 300.000 - 400.000 Einheiten) in 60 ml 1x Hanks &#39;Balanced Salt Solution (HBSS) , supplementiert mit Calcium und Magnesium. Last 10 ml Pankreasverdauungspuffer in 10 ml Spritzen (sechs) mit einem 1 &quot;22 G Nadel und auf Eis. Anmerkung: 10 ml Aufschlußlösung pro Ratte injiziert. Skalieren entsprechend. </li><li> Bereiten 4,5 ml des Anästhetikums Cocktail in einer belüfteten Haube von 1,3 ml Ketamin Mischen (100 mg / ml), 0,2 ml Xylazin (100 mg / ml) und 3 ml PBS. Bereiten Sie das Anästhetikum Cocktail innerhalb 1 Stunde von Inselisolierung zu initiieren. </li><li> Bereiten Waschpuffer durch Zugabe von 25 ml Serum von neugeborenen Kälbern auf 500 ml HBSS. Legen Waschpuffer auf Eis für die spätere Verwendung. </li><li> Bereiten Sie 1 Flasche Insel Medium , das 500 ml niedriger Glukose Dulbecco modifiziertem Eagle - Medium (DMEM) ist, 50 ml fötales Rinderserum (FBS), 5.000 Einheiten / ml Penicillin und 5000 &amp; mgr; g / ml Streptomycin. </li><li> Bereiten Inselfunktion Medium von Funktionalität / Lebensfähigkeit Lösung (500 ml) mit 2% FBS, 2 mM Glutamin, 5 mM Glucose, 5,000 Einheiten / ml Penicillin und 5000 &amp; mgr; g / ml Streptomycin. Speichern Sie die Inselfunktion Medien (4 ° C) für eine spätere Verwendung. </li><li> Vorbereitung 40 ml Puffer durch Zugabe von 2,5 ml Esel Blockierungsserum und 0,12 ml Triton X-100 bis 37,38 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Store Blockierungspuffer (4 ° C) für eine spätere Verwendung. </li><li> Besorgen Sie sich die benötigten Antikörper vor, das Protokoll zu initiieren. Hinweis: PDX-1 (TRITC) und Ki-67 (FITC) Co-Färbung ist für die primäre β-Zell-Replikation-Screening verwendet. zusammen mit Kern (DAPI), PDX (Cy5) und Ki-67 (FITC) Färbung; Für linienspezifische Replikationsanalyse, Immunfluoreszenzanfärbung für zusätzliche Zellidentität Marker (TRITC Insulin, Glukagon, Vimentin oder Somatostatin) durchführen. Alternative replication Marker, beispielsweise PCNA, können ebenfalls verwendet werden. </li><li> Bereiten Sie eine 228-Well-Behandlungsplan mit jedem in vierfacher Ausfertigung durchgeführt Behandlungszustand. Positiv- Fügen (5-Iodotubercidin [1 uM] oder Dipyridamol [15 &amp; mgr; M]) und Fahrzeugkontrolle (DMSO 1: 666 Verdünnung) Brunnen. </li></ol> 2. Perfusion des Pancreas <ol><li> Anästhesieren Ratten durch intraperitoneale Injektion von verdünntem Anästhetikum Cocktail-Lösung (0,30 ml / 100 g Körpergewicht). Sobald die Ratte vollständig betäubten und reagiert nicht mehr auf schädliche Reize, führen Zervikaldislokation. </li><li> Legen Sie die eingeschläfert Ratte in Rückenlage (kranial-kaudal-Orientierung) auf einem Stapel von Papiertuch und sprühen Sie den Bauchbereich mit 70% Ethanol. </li><li> Öffnen Sie die Bauchhöhle mit einem U-Schnitt (Basis am Schambereich) und einfahren Haut in der rostralen Richtung über der Brust in die Bauchhöhle zu belichten. </li><li> packen Sie vorsichtig das Duodenum mit zwei Paaren von gebogenen Pinzette, suchen Sie den duodenalen Eintrag der gemeinsamen bile Kanal (Sphinkter Oddi) und der Zwölffingerdarm-Öffnung an der Papille mit einer gekrümmten hemostat festzuklemmen. </li><li> Heben Sie den gekrümmten hemostat verwendet, um den gemeinsamen Gallengang Papille zu klemmen und den Gallengang nahe an Leber schnappen Sie sich einen gebogenen Pinzette verwenden. Verwenden Sie stumpfe Präparation mit den gebogenen Pinzette zu isolieren und den Gallengang aus. </li><li> Positionieren Sie die Ratte mit dem Kopf proximal und distal die Füße. </li><li> Kanülieren den gemeinsamen Gallengang (CBD) an oder gerade distal zu der Verbindung der zystischen und gemeinsame -beladene Lebergänge mit einer pankreatischen Verdauungslösung 10 ml Spritze und 10 langsam ml der pankreatischen Verdauungslösung injizieren. Während die Injektion, die CBD mit einem Skalpell Griff unterstützen. Positionieren Sie die Nadel, wenn der Kanal und der Bauchspeicheldrüse aufzublasen scheitern. </li><li> Entfernen Sie die aufgeblasenen Bauchspeicheldrüse die gebogenen Pinzette und einer feinen Schere mit ihm zu trennen von dem absteigenden Dickdarm, Darm, Magen und Milz. Legen Sie die aufgeblasenen Bauchspeicheldrüse auf Eis in einem 50-ml-Röhrchen mit 5 ml <em&gt; Pankreas - Verdauungslösung. Hinweis: Für eine maximale Inselausbeute, sammeln Sie alle Bauchspeicheldrüsen innerhalb von 30 min und Ort nur 1 oder 2 Bauchspeicheldrüsen in je 50 ml Aufschlußrohr. </li></ol> 3. Die Dissoziation des Pancreas <ol><li> Sobald alle Bauchspeicheldrüsen gesammelt, legen Sie die Verdauung Rohre in einem 37 ° C Wasserbad für 15 min. Vorsichtig schwenken alle 3 Minuten die Röhrchen. </li><li> Nach 15 min kräftig schütteln (vertikal) die Rohre 10 - mal und 10 ml kaltem Waschpuffer hinzufügen. Kräftig schütteln die Rohre zusätzlich 5 mal auf Eis stellen. </li><li> Füllen Sie die Verdauung Rohre bis 50 ml mit kaltem Waschpuffer und Mischung von Röhren 5 - mal umgekehrt wird . </li><li> Zentrifugiere die Röhrchen bei 97 × g bei 4 ° C für 1 min und giesst den Überstand. Achten Sie darauf, nicht die pelle Gewebe zu entfernen. </li><li> 25 ml Waschpuffer und erneut zu suspendieren , das Gewebe durch sanftes Vortexen. Wiederholen Sie die Schritte 3.4 und 3.5 noch zweimal. </li><li> Legen Sie ein 30 mesh Gewebe Sieb über eine sterile 250-ml-Becher und gießen Sie die Gewebesuspension auf das Sieb. Spülen Sie das Aufschlußrohr mit zusätzlichen 20 ml Waschpuffer und gieße auf das Netz. Die unverdaute Pankreas und Fettgewebe sind bei diesem Schritt entfernt. </li><li> Gießen Sie das gefilterte Material in zwei frische 50-ml-Röhrchen und das Gewebepellet durch bei 4 ° C bei 97 × g für 1 min drehen. Decant Überstand und Invert-Röhren überschüssige Puffer zu entleeren. </li></ol> 4. Reinigung von Inselchen <ol><li> 20 ml kaltem Polysaccharose / Natriumdiatrizoat-Lösung (1,119 g / ml Dichte) an die pelletierten Pankreasgewebe. Homogen erneut zu suspendieren, den Inhalt jedes Röhrchen durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren fünfmal. </li><li> Overlay vorsichtig die Polysucrose / Natriumdiatrizoat Lösung mit 10 ml HBSS. Pflegen Sie eine scharfe Flüssigkeit-Grenzfläche durch langsam die HBSS entlang der Rohrwand hinzufügen. </li><li> Zentrifugieren der verdauten Bauchspeicheldrüsen bei 560 × g für 15 min (4 ° C) mit langsamer Beschleunigung und ohne Bremse. </li><li> Collect die Inselschicht von der Oberfläche einer 10 ml Pipette und Platz Inselchen in frischen 50-ml-Röhrchen mit. Pool nicht Inselchen in diesem Stadium. </li><li> Werden 40 ml Waschpuffer in jede 50 - ml - Röhrchen und Schleuder für 1 min bei 140 × g bei 4 ° C. </li><li> Gießen Sie den Überstand ab und erneut zu suspendieren gepoolt Inseln in 50 ml Waschpuffer durch die Rohre mehrmals umgekehrt wird . Zentrifugiere die Röhrchen für 1 min bei 97 × g bei 4 ° C Inselchen in einem Pellet zu sammeln. </li><li> Gießen Sie den Waschpuffer und wiederholen Sie die Wäsche ab. Bringen Inseln in die Gewebekultur Haube und den Überstand aspirieren. </li><li> Re-suspend jedes Rohr von Inseln in 6 ml Insel Medium. </li><li> Übertragen Sie die Inseln von je 50 ml Tube in eine Vertiefung Sechs-Well-Gewebekulturschale. Schwenken Sie die 6-well Schale Inseln in der Mitte des Brunnens zu sammeln und Inselchen Qualität und Reinheit unter dem Mikroskop beobachten. </li><li> Manuell sammeln Inselchen einer 1 ml Pipette und übertragen die aufgenommenen Inseln in die benachbarte Verwendungenthält, gut 6 ml Insel Medien. Wiederholen Sie Inselchen Verwirbelung und Kommissionierung bis&gt; 90% Reinheit erreicht. </li><li> Übertragen Sie die gereinigten Inseln zu einer 10 cm Gewebekulturschale mit 20 ml Insel Medium. </li><li> Ort Inselchen in einem Gewebekultur - Inkubator (37 ° C, 5% CO 2) über Nacht (1A). </li><li> In Vorbereitung der Inselzellen Plattieren, Beschichten der Vertiefungen einer Platte mit 384 Vertiefungen mit 40 ul 804G konditionierten Medium pro Well. über Nacht in einem Gewebekultur-Inkubator inkubieren. </li></ol> 5. Dispersion und Beschichtung von Inselzellen <ol><li> Am folgenden Tag, nehmen Sie sanft kleine Inseln aus dem 10-cm-Schale mit einem Zellschaber und übertragen Sie die Inseln in einen 50-ml-Tube. </li><li> Pellet die Inseln durch Zentrifugation für 1 min bei 22 · g bei Raumtemperatur. Den Überstand aspirieren. </li><li> Waschen Sie die Inselchen mit 20 ml warmem PBS und wie oben dekantiert. </li><li> Re-suspend Inseln in 0,25% Trypsin (150 &amp; mgr; l pro Ratte Bauchspeicheldrüse) Und für 10 min bei 37 ° C inkubieren. Pipette Inselchen nach oben und unten 10-mal mit 1 ml Pipette nach 5 und 10 Minuten Inkubation. </li><li> Nach 10 min wurde eine 20 ul Probe der trypsiniert Inseln unter dem Mikroskop ausgewertet vollständige Verdauung zu gewährleisten und die Inselzellen mit einem Hämocytometer gezählt. Wenn unverdaute Inseln bleiben, weiterhin Inkubation für eine weitere 3-5 min und Pipette auf und ab 10 weitere Male. Bei Bedarf wiederholen. Hinweis: Die typische Ausbeute von ~ 125.000 - 150.000 Insel-Zellen pro Ratte. </li><li> Entfernen 804G konditionierten Medien beschichteten 384-Well-Platte aus dem Inkubator und entfernen Medien eine 12-Well-Verteiler Absauger verwenden. </li><li> Suspend - Inselzellen in einer Dichte von 45.000 Zellen pro ml in Islet Funktionsmedium und der Platte 70 &amp; mgr; l (3.150 Zellen) pro Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette (1B). Hinweis: Da in den äußeren Wells β-Zellen sind in der Regel 4 in Richtung des Umfangs der Platte Verwendung Reihen C bis N und Spalten zu migrierenbis 21 228 Vertiefungen mit den Inselzellen von 6 Ratten isoliert auf den Teller. </li><li> Die Platte wird in der Gewebekultur-Inkubator für 48 Stunden Zelladhäsion zu ermöglichen. </li></ol> 6. Islet-Zellkultur-Behandlung, Fixierung und Färbung <ol><li> Bereiten 200 ul Vehikel und Verbindungen (Behandlungsbedingungen werden in vierfacher Ausfertigung durchgeführt) bei einer 2x - Konzentration in Islet Funktionsmedium. Anordnen Verbindungen in einer sterilen 96-Well-Platte mit mehreren Vertiefungen Pipettieren zu erleichtern. </li><li> Sorgfältig Inselchen Medium mit einer 12-Well-Verteiler Absauger entfernen und mit Inselfunktion Medium (35 &amp; mgr; l / Well) unter Verwendung eines 12-Well-Pipette ersetzen. Entfernen und Ersetzen Medien von einer Zeile zu einer Zeit , Risiko zu begrenzen , Trocknen (1C). </li><li> Initiieren Behandlung von 35 ul / Vertiefung der 2x Verbindungslösungen zu übertragen. Rückplatte in den Inkubator für die 48 Stunden Behandlungsdauer. </li><li> Nach 48 Stunden der Behandlung, dekantiert die Behandlungsmedien durch Umdrehen der Platte. &lt;/ Li&gt; <li> Waschen Sie sich leicht die Inselzellen mit 50 &amp; mgr; l pro Vertiefung 1x PBS (1 min). Fügen Sie den PBS einen Mehrkanal-Pipette. </li><li> Dekantiert die PBS und die Zellen beheben, indem 50 ul Zugabe pro Vertiefung von kaltem 4% Paraformaldehyd (PFA), verdünnt in 1x PBS. Inkubiere Zellen für 15 min bei 4 ° C. </li><li> Waschen Sie die Zellen dreimal (jeweils 5 min) durch die Platte Invertieren des PFA zu entfernen, und die Zugabe vorsichtig 60 ul PBS pro Vertiefung wie oben. </li><li> Vorbereitung 15 ml Antigen-Retrieval-Lösung durch Mischen von 14,25 ml Formamid und 0,75 ml 0,15 M Natriumcitrat (pH 6). Sprechen Sie die Antigen-Retrieval-Lösung unmittelbar vor der Verwendung. </li><li> Entfernen PBS aus den Vertiefungen durch Umdrehen der Platte und fügen Sie zu jeder Vertiefung 60 ul Antigen-Retrieval-Lösung. Anschließend wird die Platte in 70 ° C warmen Wasserbad für 45 min. Platzieren einem Heizblock auf der Oberseite der Platte während dieser Inkubation Verziehen der Multiwell-Platte zu verhindern. Hinweis: Das Wasser sollte bis zur Hälfte der Platte Rock sein; Die Platte sollte nicht in Wasser getaucht werden. </li><li&gt; Die Platte aus Wasserbad und lassen Sie es 20 Minuten lang bei Raumtemperatur abkühlen lassen. Stellen Sie sicher, dass die Platte durch visuelle Inspektion nicht verzogen wird. </li><li> Waschen Sie die Zellen mit 60 &amp; mgr; l pro Vertiefung 1x PBS dreimal (jeweils 5 min). Hinzufügen PBS mit einer Mehrkanalpipette und dekantieren PBS durch Umdrehen der Platte. </li><li> Verwenden einer Mehrkanal-Pipette 40 ul pro Vertiefung Blockierungspuffer hinzufügen und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie den Blockierungspuffer durch Umdrehen der Platte und dekantiert. </li><li> Werden 40 &amp; mgr; l Maus-anti-human Ki-67 (1: 200) und Ziege-anti-human PDX-1 (1: 100) in Blockierungspuffer auch mit jedem verdünnten Antikörper und Inkubation über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Am nächsten Tag, dekantiert die Antikörperlösung und wasche die Zellen mit 1x PBS dreimal (jeweils 5 min), wie oben beschrieben. Umfüllen PBS. </li><li> In 40 ul pro Vertiefung verdünnt (1: 200) biotinyliertes Esel-anti-Maus-IgG und Rhodamin-konjugierten Esel-Anti-Ziegen-IgG in Blocking-Puffer. Inkubieren für 1 Stundebei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Zellen mit 1x PBS dreimal, jeweils 5 Minuten. Werden 40 &amp; mgr; l verdünnt (1: 400 in Blockierungspuffer) fluorescein-konjugiertem Streptavidin zu jeder Mulde. Inkubiere 30 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Zellen mit 1x PBS dreimal, jeweils 5 Minuten. In 40 ul pro Vertiefung DAPI (300 nM in Blocking-Puffer) und Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur. </li><li> Wash-Zellen mit 1x PBS zweimal und lassen Zellen in 40 ul 1x PBS. Die Platte ist nun bereit, analysiert zu werden. </li></ol> 7. β-Zellreplikation Analyse Hinweis: Ein Testprotokoll für das High Content Screening-Mikroskop hergestellt werden muss verwendet, um β-Zell-Replikation zu messen. In seiner einfachsten Zusammensetzung Dieses Protokoll ist ein Zwei-Farben - Assay in dem ein Identitätsmarker verwendet wird β-Zellen (PDX-1 + -Zellen) und einen Replikationsmarker (Ki-67) zu definieren Zellteilung Ereignisse zu definieren. <ol><li> Identifizieren Sie Objekte (β-Zellen), basierend auf dem average Fluoreszenzintensität von PDX-1 - Färbung (549 - nm - Filter) innerhalb eines angenäherten Kreises (Länge: Breite &lt;1,6) innerhalb des erwarteten Pixelbereich einer β-Zellkerns (2A). </li><li> Als nächstes etablieren Einstellungen Replikationsereignisse (Ki-67-Positivität) , basierend auf der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität (485 nm Filter) innerhalb des PDX-1 + Fläche (2B) zu identifizieren. Hinweis: Die Belichtungszeiten muss festgelegt werden, um Pixelintensität Vergleiche zwischen den Bildern ermöglichen. Assay-Protokoll-Parameter werden so eingestellt, dass Anrufe Maschine konstant unspezifische Färbung, Schutt und Zellaggregate auszuschließen, die sich nachteilig auf die Datenqualität beeinträchtigen könnten. </li><li> Analysieren Sie ein Minimum von 500 β-Zellen pro Well Genauigkeit und Grenz Variabilität zu maximieren. Anmerkung: Die basale β-Zell-Replikation in Kulturen Index rat islet erwartet wird, 0,5 bis - 3%. Typischerweise beträgt 40 Bilder pro Vertiefung mehr als ausreichend 500 β-Zellen zu identifizieren. </li><li> Vor der Analyse dergesamte Platte, Analyse ausgewählt Negativ- (DMSO-behandelten) und Positivkontrolle (5-iodotubercidin [1 uM] oder Dipyridamol [15 uM]) -behandelten Vertiefungen die Gültigkeit des Testprotokolls zu bewerten. Wenn der Test richtig hergestellt ist, induzieren positive Kontrollverbindungen mindestens eine zweifache Erhöhung des Prozentsatzes β-Zellen zu replizieren. </li><li> Lesen Sie die gesamte Platte, sobald das Testprotokoll bestätigt wird. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Experimentelle Methoden für die molekularen Mechanismen zu studieren, die β-Zellwachstum und Regeneration zu steuern sind wichtige Werkzeuge für die Diabetes-Forscher. Hierbei wird eine Ratte-Insel-basierte Screening-Plattform für kleine Molekül Stimulatoren der β-Zell-Replikation identifizieren und zu charakterisieren, wird präsentiert. Während die meisten Aspekte dieses Protokolls leicht von erfahrenen Forschern durchgeführt werden, erfordern ein paar Schritte besondere Technik. E...

Diabetes umfasst eine Sammlung von Störungen des gemeinsamen Endpunktes gestörter Glukose-Homöostase zu teilen. Obwohl die pathogenen Mechanismen von Diabetes - Subtypen unterschieden sind, sie die Folge einer verminderten β-Zellmasse teilen, dh Verlust von Insulin Produktionskapazität 1,2. Derzeit verlassen Diabetes Behandlungsstrategien auf die chronische Verabreichung von exogenen Insulin, pharmakologische Stimulation der Insulinproduktion oder Verbesserung der Insulinempfindlichkeit und in seltenen Fällen die Transplantation von Pankreas - Inseln oder ganze Bauchspeicheldrüse 3,4. Leider ist der Erfolg dieser Strategien ist von kurzer Dauer und / oder nicht in ausreichendem Maße die Funktion der endogenen Insulinproduktion rekapitulieren. Trotz der Nützlichkeit, ein Verfahren zur Entwicklung von β-Zell-Regeneration zu stimulieren, kein solcher Ansatz vorhanden ist. Folglich ist ein wichtiges Ziel der Diabetesforschung , Methoden zu entwickeln neue β-Zellen zu erzeugen , oder endogene β-Zellmasse 5 zu erweitern </sup&gt;. Obwohl β-Zellregeneration aus erneuerbaren Quellen wie embryonale Stammzellen voranschreitet , Sicherheit und Effizienz betrifft , um die Verfolgung alternativer Strategien, einschließlich der Erweiterung der reifen β-Zellen, eine Priorität 6,7. Wichtig ist , ist die vorherrschende Quelle von neuen β-Zellen in vivo vorbestehenden β-Zellen und nicht spezialisierte Vorläuferzellen 8,9. Obwohl β-Zellen begrenzte Replikationskapazität, eine geringe Zunahme der β-Zellmasse zu haben scheinen (~ 30%) ausreichend sein Glucosehomöostase in viele Diabetiker wiederherzustellen. Darüber hinaus ist in situ pharmakologische Stimulation der β-Zellmasse eine potentiell kostengünstige und skalierbare Behandlungsstrategie. Hierin ist ein High-Content-Screening-Verfahren zur Identifizierung und Charakterisierung von kleinen Molekülen, die β-Zellwachstum stimulieren dargestellt. Eine Vielzahl von in vitro experimentellen Methoden verwendet werden können Genprodukte und / oder Moleküle zu identifizieren , That fördern primäre β-Zell-Replikation. Frühe Bemühungen für β-Zell - Replikation Induktionsmessung verwendet fötalen Nagetier Bauchspeicheldrüsen Kultur oder intakte isolierte Inselkulturen zu messen [3 H] Thymidin - Einbau, BrdU - Einbau oder mitotischen Körper innerhalb der Aldehyd-Thionin oder Insulin gefärbten Population als Reaktion auf bestimmte Behandlungsbedingungen 10, 11. Diese in - vitro - Ansätze und nahe Varianten davon haben einige Einschränkungen. Prominent Mängel umfassen (1) die Verwendung von fetalen Zellen , die, im Gegensatz zu reifen β-Zellen, eine hohe basale 12 in einer bestimmten Weise reguliert β-Zellreplikationsrate und das Wachstum anzuzeigen; (2) die subjektive Natur der Experimentator abhängigen Jurierung von β-Zellen-Replikationsereignisse; (3) die arbeits- und zeitintensiv Natur der Experimentator abhängige Zählung von β-Zellen-Replikationsereignisse verzögert experimentellen Durchsatz; (4) die Nutzung der Kern Einbau / Fleck / Aussehen Replikation zu identifizieren, selbstts und eine nicht-überlappenden zytoplasmatischen stain β-Zellen zu identifizieren, führt zu Fehlattribution von proximalen nicht-β-Zell-Replikationsereignisse-Zellen ß. In jüngerer Zeit reifen haben primäre β-Zellen , die die Auswirkungen von Transgen Überexpression sowie Genprodukts oder Verbindung Behandlung auf β-Zell - Replikation 13-16 zu bewerten verwendet worden. Allerdings haben diese Studien auch auf subjektive Zählen von Replikationsereignisse verlassen, zytoplasmatische staining- oder nicht-spezifischen Methoden für die β-Zellen - Identifikation und / oder arbeitsintensive Schritte , die den Durchsatz begrenzen, beispielsweise einzelne Einschub gut Plattieren von Zellen oder intakten islet Paraffineinbettung und Verarbeitung 17. Bemerkenswert ist , ein bildbasiertes menschliche β-Zellreplikation Screening Methode, ähnlich der hier vorgestellten, wurde 18 veröffentlicht wurde ; jedoch hat erfolgreiche Verwendung dieses Assays nicht nachgewiesen werden, und die Verwendung von menschlichen Inseln zur Vorabsiebung nicht breit sein FEAwortlich. Eine alternative Strategie zur Identifizierung von Replikationsfördernde Substanzen das Wachstum Induktion von β-Zelllinien zu bewerten. Erste Versuche umgewandelt β-Zell-Linien verwendet wie MIN6 Zellen oder INS 832/13-Zellen 14,19-21. Allerdings zeigen diese Zelllinien ungebremst Wachstum und wenig Ähnlichkeit mit gut differenzierten β-Zellen 22. Folglich wachstumsInduktionsLeistung ist minimal, unklarer Relevanz und manchmal schwer zu rekapitulieren. Eine verbesserte Strategie für die zellbasierte Screening - Linie nutzt Zellen &quot;reversibel umgewandelt&quot; , das Wachstum in Abwesenheit von Tetracyclin (Doxycyclin) -abhängigen SV40 T - Antigen - Expression 23,24 verhaftet sind. Es ist jedoch unklar, ob diese Zellen zu einer &quot;normalen&quot; β-Zell-ähnlichen Zustand auf Doxycyclin Entfernung zurück. Leider hat die Verwendung dieser Zellen verallgemeinert wachstumsfördernden Verbindungen ergab, dass offenbar nicht unmittelbaren Nutzen haben24. Insgesamt ist die Verwendung von Zell-Linien Wachstumsregulation eines Zelltyp - Anzeige von minimal spontane Replikationsaktivität zu studieren , können begrenzte Anwendbarkeit aufweisen. Die β-Zellreplikation präsentiert Screening - Plattform hierin verwendet reifen primären Ratten - β-Zellen in vivo Wachstumsregulierung in dem Maße möglich, Inselzellkulturen von gemischten Zelltyp - Zusammensetzung zu erhalten Identifizierung von Lineage-restricted wachstumsfördernden Aktivitäten zu ermöglichen, multi -well Formatierung Durchsatz und automatisierte Analyse zu maximieren Bias zu beseitigen und den Durchsatz zu erleichtern. Der erfolgreiche Einsatz dieser Plattform hat Identifizierung mehrerer Verbindungen aktiviert , die β-Zell - Replikation 25,26 fördern. Zusätzlich wurde der Test für die Struktur-Wirkungs-Beziehung Studien und chemischen epistasis Experimenten verwendet worden mechanistische Einblicke in die molekulare Regulation von β-Zell-Replikation zu ermöglichen. Die vorgestellte Plattform wurde erfolgreich angepasst for lentiviralen RNAi-basierte Untersuchung von β-Zell - Replikation Pfade 25. Einschränkungen des Tests umfassen Skalierbarkeit (Verwendung von Primärzellen) beschränkt, die Verwendung von Nagetier anstatt menschlichen Inselzellen (obwohl der Test auf menschlichen Insel Studien angepasst werden kann), Aufwendungen im Zusammenhang mit Antikörper-basierte Bildgebung und primäre Insel Nutzung, die Nutzung von dispergierten Inseln (gestört islet Architektur) automatisierten Bildaufnahme und die Abhängigkeit von der Verfügbarkeit eines automatisierten Mikroskop mit Bildaufnahme und Analysefähigkeit zu erleichtern. Obwohl eine leichte In - vivo - Screening - Methodik Genprodukte oder zur Identifizierung von Verbindungen , die β-Zell - Regeneration in situ stimulieren ideal wäre, eine solche Plattform ist noch nicht 27 zur Verfügung. Folglich ist die beschriebene Plattform geeignet für Forscher interessiert sich für die meisten Aspekte der β-Zell-Replikation zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>250 g male Male Sprague Dawly Rat</td><td>Charles River</td><td>Stain # 400</td><td></td></tr><tr><td>12 cm teeth tisuue forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11021-12</td><td></td></tr><tr><td>11.5 cm fine scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>14.5 cm surgical scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-14</td><td></td></tr><tr><td>16 cm curved forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11003-16</td><td></td></tr><tr><td>12 cm curved hepostat</td><td>Fine Science Tools</td><td>13011-12</td><td></td></tr><tr><td>12 cm scalpel handle</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Tissue sieve-30 mesh</td><td>Bellco Glass</td><td>1985-85000</td><td></td></tr><tr><td>Cizyme RI, 375,000 CDA units</td><td>VitaCyte</td><td>005-1030</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt solution (Ca&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt; and Mg&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt;)</td><td>Gibco</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine HCl (200 mg/20 ml)</td><td>JHP Pharmaceuticals</td><td>NDC# 42023-113-10</td><td>to make anesthetic cocktail&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Xylazine (5 g/50 ml)</td><td>LLOYD</td><td>NADA# 139-236</td><td>to make anesthetic cocktail&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Histopaque 1077</td><td>Sigma</td><td>H-1077</td><td>to make histopaque 1100</td></tr><tr><td>Histopaque 1119</td><td>Sigma</td><td>H-1119</td><td>to make histopaque 1100</td></tr><tr><td>Newborn Calf Serum 500 ml</td><td>Hyclone</td><td>SH30118.03</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt solution</td><td>Hyclone</td><td>SH30268.01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium/Low Glucose&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30021.01</td><td></td></tr><tr><td>Functionality/Viability Solution&amp;nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>99-768-CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 media&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30096.01</td><td>to make conditioned medium</td></tr><tr><td>804G rat bladder carcinoma cell-line</td><td>Available upon request</td><td></td><td>to make conditioned medium</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Qualified</td><td>Gibco</td><td>26160</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax-I</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 mg/ml)&amp;nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>1670049</td><td></td></tr><tr><td>Formamide 500 ml</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP227-500</td><td></td></tr><tr><td>Antigen Unmasking Solution 250 ml (pH 6.0)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-3300</td><td>to make 0.15 M Sodium Sitrate solution</td></tr><tr><td>Dextrose, Anhydrous</td><td>EMD Chemicals</td><td>DX0145-1</td><td>to make 1 M glucose solution</td></tr><tr><td>Nomal Donkey Serum (Powder)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-human Ki67 antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>556003</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-human PDX-1 antibody</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF2419</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal Guinea Pig anti-insulin antibody</td><td>Dako</td><td>2016-08</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal Rabbit anti-glucagon antibody</td><td>Dako</td><td>2014-06</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal Rabbit anti-somatostatin antibody</td><td>Dako</td><td>2011-08</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal chicken anti-vimentin antibody</td><td>abcam</td><td>ab24525</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-SP-conjugated, Donkey Anti-Mouse IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-065-150</td><td></td></tr><tr><td>StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugated&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>S32354</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Goat IgG&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-025-147</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-025-148</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-025-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy 5-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-175-148</td><td></td></tr><tr><td>Cy 5-conjugated Donkey Anti-Goat IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-175-147</td><td></td></tr><tr><td>Cy 5-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-175-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy 5-conjugated Donkey Anti-Chicken IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-175-155</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Millipore</td><td>S7113</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Reagent Reservoir 25 ml</td><td>Sorenson BioScience</td><td>39900</td><td></td></tr><tr><td>384 well, black/clear, tissue culture treated plate</td><td>BD Falcon</td><td>353962</td><td></td></tr><tr><td>96 well, black/clear, tissue culture treated plate</td><td>Costar</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Multi-channel pipettor</td><td>Costar</td><td>4880</td><td></td></tr><tr><td>12-channel vaccume aspirator</td><td>Drummond</td><td>3-000-096</td><td></td></tr><tr><td>Cell Scraper</td><td>Falcon</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Water Bath Model 2223&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>High-content screening instrument: ArrayScan VTI</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a high-content in vitro pancreatic islet &#946;-cell replication discovery platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet &#946;-cells remains an attractive strategy. &#946;-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain &#946;-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify &#946;-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a &#946;-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on &#946;-cells and the molecular mechanisms that regulate &#946;-cell growth.

Zu β-Zelle oder α-Zellreplikation, eine Vierfarben-Assay-Protokoll ist erforderlich, zu beurteilen. Zuerst werden Objekte durch DAPI-Färbung (Kanal 1, 386 nm) identifiziert. Als nächstes gezählt β-Zellen (Ereignis 1): Objekte , die und peri-Kern Insulin (Kanal 3, 549 nm) PDX-1 + (2, 650 nm - Kanal) zusammen auszudrücken. Anschließend replizieren β-Zellen (Ereignis 2) gezählt: ß-Zellen (Ereignis 1) coexprimierender Ki-67 (Kanal 4, 485 nm) (Abbildung 3).</stro...

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A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Kritische Herausforderungen für die Diabetesforschung Bereich sind die molekularen Mechanismen zu verstehen, die Insel β-Zellreplikation regulieren und β-Zellregeneration zur Stimulierung der Methoden zu entwickeln. Hierin ist ein High-Content-Screening-Verfahren zur Identifizierung und der β-Zellreplikation fördernden Aktivität von kleinen Molekülen bewerten dargestellt.

Ein hoher Gehalt<em&gt; In Vitro</em&gt; Pancreatic Islet β-Zell-Replikation-Discovery-Plattform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

11.1K Aufrufe.  Stanford University School of Medicine.  Kritische Herausforderungen für die Diabetesforschung Bereich sind die molekularen Mechanismen zu verstehen, die Insel β-Zellreplikation regulieren und β-Zellregeneration zur Stimulierung der Methoden zu entwickeln. Hierin ist ein High-Content-Screening-Verfahren zur Identifizierung und der β-Zellreplikation fördernden Aktivität von kleinen Molekülen bewerten dargestellt. 

Serie: A High-content In Vitro Pancreatic Islet β-cell Replication Discovery Platform

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. However, it is still unknown whether stem and progenitor cells exist in the adult pancreas. Research strategies using cre-lox lineage-tracing in adult mice have yielded results that either support or refute the idea that beta cells can be generated from the ducts, the presumed location where adult pancreatic progenitors may reside. These in vivo cre-lox lineage-tracing methods, however, cannot answer the questions of self-renewal and multi-lineage differentiation-two criteria necessary to define a stem cell. To begin addressing this technical gap, we devised 3-dimensional colony assays for pancreatic progenitors. Soon after our initial publication, other laboratories independently developed a similar, but not identical, method called the organoid assay. Compared to the organoid assay, our method employs methylcellulose, which forms viscous solutions that allow the inclusion of extracellular matrix proteins at low concentrations. The methylcellulose-containing assays permit easier detection and analyses of progenitor cells at the single-cell level, which are critical when progenitors constitute a small sub-population, as is the case for many adult organ stem cells. Together, results from several laboratories demonstrate in vitro self-renewal and multi-lineage differentiation of pancreatic progenitor-like cells from mice. The current protocols describe two methylcellulose-based colony assays to characterize mouse pancreatic progenitors; one contains a commercial preparation of murine extracellular matrix proteins and the other an artificial extracellular matrix protein known as a laminin hydrogel. The techniques shown here are 1) dissociation of the pancreas and sorting of CD133+Sox9/EGFP+ ductal cells from adult mice, 2) single cell manipulation of the sorted cells, 3) single colony analyses using microfluidic qRT-PCR and whole-mount immunostaining, and 4) dissociation of primary colonies into single-cell suspensions and re-plating into secondary colony assays to assess self-renewal or differentiation.

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In vitro colony assays to detect self-renewal and differentiation of progenitor cells isolated from adult murine pancreas are devised. In these assays, pancreatic progenitors give rise to cell colonies in 3-dimensional space in methylcellulose-containing semi-solid medium. Protocols for handling single cells and characterization of individual colonies are described.

In - vitro - Assays für Colony Tri-potente Progenitorzellen Charakterisieren von den Adult Murine Pancreas Isoliert

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Assessing Replication and Beta Cell Function in Adenovirally-transduced Isolated Rodent Islets

Glucose homeostasis is primarily controlled by the endocrine hormones insulin and glucagon, secreted from the pancreatic beta and alpha cells, respectively. Functional beta cell mass is determined by the anatomical beta cell mass as well as the ability of the beta cells to respond to a nutrient load. A loss of functional beta cell mass is central to both major forms of diabetes 1-3. Whereas the declining functional beta cell mass results from an autoimmune attack in type 1 diabetes, in type 2 diabetes, this decrement develops from both an inability of beta cells to secrete insulin appropriately and the destruction of beta cells from a cadre of mechanisms. Thus, efforts to restore functional beta cell mass are paramount to the better treatment of and potential cures for diabetes.
Efforts are underway to identify molecular pathways that can be exploited to stimulate the replication and enhance the function of beta cells. Ideally, therapeutic targets would improve both beta cell growth and function. Perhaps more important though is to identify whether a strategy that stimulates beta cell growth comes at the cost of impairing beta cell function (such as with some oncogenes) and vice versa.
By systematically suppressing or overexpressing the expression of target genes in isolated rat islets, one can identify potential therapeutic targets for increasing functional beta cell mass 4-6. Adenoviral vectors can be employed to efficiently overexpress or knockdown proteins in isolated rat islets 4,7-15. Here, we present a method to manipulate gene expression utilizing adenoviral transduction and assess islet replication and beta cell function in isolated rat islets (Figure 1). This method has been used previously to identify novel targets that modulate beta cell replication or function 5,6,8,9,16,17.

This protocol allows one to identify factors that modulate functional beta cell mass to find potential therapeutic targets for the treatment of diabetes. The protocol consists of a streamlined method to assess islet replication and beta cell function in isolated rat islets following manipulation of gene expression with adenoviruses.

Die Beurteilung der Replikation und Beta-Zellfunktion in adenoviral-transduzierten Isoliert Nager Islets

Glucose homeostasis is primarily controlled by the endocrine hormones insulin and glucagon, secreted from the pancreatic beta and alpha cells, ...

Medizin

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within pancreatic islets and act in a coordinated fashion to maintain glucose homeostasis. It is becoming increasingly clear that interactions between transmembrane proteins on the surfaces of adjacent beta cells are important determinants of beta-cell function.
Elucidation of the roles of particular transcellular interactions by knockdown, knockout or overexpression studies in cultured beta cells or in vivo necessitates direct perturbation of mRNA and protein expression, potentially affecting beta-cell health and/or function in ways that could confound analyses of the effects of specific interactions. These approaches also alter levels of the intracellular domains of the targeted proteins and may prevent effects due to interactions between proteins within the same cell membrane to be distinguished from the effects of transcellular interactions.
Here a method for determining the effect of specific transcellular interactions on the insulin secreting capacity and responsiveness of beta cells is presented. This method is applicable to beta-cell lines, such as INS-1 cells, and to dissociated primary beta cells. It is based on coculture models developed by neurobiologists, who found that exposure of cultured neurons to specific neuronal proteins expressed on HEK293 (or COS) cell layers identified proteins important for driving synapse formation. Given the parallels between the secretory machinery of neuronal synapses and of beta cells, we reasoned that beta-cell functional maturation might be driven by similar transcellular interactions. We developed a system where beta cells are cultured on a layer of HEK293 cells expressing a protein of interest. In this model, the beta-cell cytoplasm is untouched while extracellular protein-protein interactions are manipulated. Although we focus here primarily on studies of glucose-stimulated insulin secretion, other processes can be analyzed; for example, changes in gene expression as determined by immunoblotting or qPCR.

Transcellular protein interactions are important determinants of pancreatic beta-cell function. Detailed here is a method&#x2014;adapted from a coculture model of synaptogenesis&#x2014;for investigating how specific transmembrane proteins influence insulin secretion. Transfected HEK293 cells express proteins of interest; beta cells do not need to be transfected or otherwise directly perturbed.

Cokultur Analyse der extrazellulären Protein Wechselwirkungen, die Insulinsekretion durch Betazellen des Pankreas

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, including insulin-secreting &#946; cells, are differentiated from common endocrine progenitors during the embryonic stage. Immature endocrine cells expand via cell proliferation and mature during a long postnatal developmental period. However, the mechanisms underlying these processes are not clearly defined. Single-cell RNA-sequencing is a promising approach for the characterization of distinct cell populations and tracing cell lineage differentiation pathways. Here, we describe a method for the single-cell RNA-sequencing of isolated pancreatic &#946; cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases.

We describe a method for the isolation of endocrine cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases followed by single-cell RNA sequencing. This method allows analyses of pancreatic endocrine lineage development, cell heterogeneity and transcriptomic dynamics.

Einzellige Transkriptomischen Analysen der Maus endokrinen Zellen der Bauchspeicheldrüse

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the pancreatic &#946;-cells. In addition, biomaterial particles, hydrogels, and scaffolds also provide a unique opportunity to administer sustained, controllable drug delivery to &#946;-cells in culture and in transplanted tissue models. These technologies allow the study of candidate &#946;-cell proliferation factors using intact islets and a translationally relevant system. Moreover, determining the effectiveness and feasibility of candidate factors for stimulating &#946;-cell proliferation in a culture system is critical before moving forward to in vivo models. Herein, we describe a method to co-culture intact mouse islets with biodegradable compound of interest (COI)-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres for the purpose of assessing the effects of sustained in situ release of mitogenic factors on &#946;-cell proliferation. This technique describes in detail how to generate PLGA microspheres containing a desired cargo using commercially available reagents. While the described technique uses recombinant human Connective tissue growth factor (rhCTGF) as an example, a wide variety of COI could readily be used. Additionally, this method utilizes 96-well plates to minimize the amount of reagents necessary to assess &#946;-cell proliferation. This protocol can be readily adapted to use alternative biomaterials and other endocrine cell characteristics such as cell survival and differentiation status.

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of &#946;-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate &#946;-cell mitogens.

Sustained Verabreichung von β-Zellen-Mitogene zu Intact Maus Inselchen<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Verwendung von biologisch abbaubaren Poly (Milch-co-Glykolsäure) Microspheres

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

Biotechnik

Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells Into Pancreatic Beta-Cell Precursors in a 2D Culture System

Human pluripotent stem cells (hPSCs) are an excellent tool for studying early pancreatic development and investigating the genetic contributors to diabetes. hPSC-derived insulin-secreting cells can be generated for cell therapy and disease modeling,&#160;however,&#160;with limited efficiency and functional properties. hPSC-derived pancreatic progenitors that are precursors to beta cells and other endocrine cells, when co-express the two transcription factors PDX1 and NKX6.1, specify the progenitors to functional, insulin-secreting beta cells both in vitro and in vivo. hPSC-derived pancreatic progenitors are currently used for cell therapy in type 1 diabetes patients as part of clinical trials. However, current procedures do not generate a high proportion of NKX6.1 and pancreatic progenitors, leading to co-generation of non-functional endocrine cells and few glucose-responsive, insulin-secreting cells. This work thus developed an enhanced protocol for generating hPSC-derived pancreatic progenitors that maximize the co-expression of PDX1 and NKX6.1 in a 2D monolayer. The factors such as cell density, availability of fresh matrix, and dissociation of hPSC-derived endodermal cells are modulated that augmented PDX1 and NKX6.1 levels in the generated pancreatic progenitors and minimized commitment to alternate hepatic lineage. The study highlights that manipulating the cell&#39;s physical environment during in vitro differentiation can impact lineage specification and gene expression. Therefore, the current optimized protocol facilitates the scalable generation of PDX1 and NKX6.1 co-expressing progenitors for cell therapy and disease modeling.

The present protocol describes an enhanced method to increase the co-expression of PDX1 and NKX6.1 transcription factors in pancreatic progenitors derived from human pluripotent stem cells (hPSCs) in planar monolayers. This is achieved by replenishing the fresh matrix, manipulating cell density, and dissociating the endodermal cells.

Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen zu Betazellvorläufern der Bauchspeicheldrüse in einem 2D-Kultursystem

Human pluripotent stem cells (hPSCs) are an excellent tool for studying early pancreatic development and investigating the genetic contributors to ...

Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-Producing Islet Clusters

Differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into insulin-secreting beta cells provides material for investigating beta cell function and diabetes treatment. However, challenges remain in obtaining stem cell-derived beta cells that adequately mimic native human beta cells. Building upon previous studies, hPSC-derived islet cells have been generated to create a protocol with improved differentiation outcomes and consistency. The protocol described here utilizes a pancreatic progenitor kit during Stages 1-4, followed by a protocol modified from a paper previously published in 2014 (termed "R-protocol" hereafter) during Stages 5-7. Detailed procedures for using the pancreatic progenitor kit and 400 &#181;m diameter microwell plates to generate pancreatic progenitor clusters, R-protocol for endocrine differentiation in a 96-well static suspension format, and in vitro characterization and functional evaluation of hPSC-derived islets, are included. The complete protocol takes 1 week for initial hPSC expansion followed by ~5 weeks to obtain insulin-producing hPSC islets. Personnel with basic stem cell culture techniques and training in biological assays can reproduce this protocol.

The differentiation of stem cells into islet cells provides an alternative solution to conventional diabetes treatment and disease modeling. We describe a detailed stem cell culture protocol that combines a commercial differentiation kit with a previously validated method to aid in producing insulin-secreting, stem cell-derived islets in a dish.

Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen zu insulinproduzierenden Inselclustern

Differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into insulin-secreting beta cells provides material for investigating beta cell function and ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Eine Methode zur Maus-Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation und intrazellulären cAMP-Bestimmung

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Biologie

Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a mixed cell population in a structured architecture that impacts function, and human islets are widely variable in cell type composition. Current frequently used methods to study cultured islets include molecular studies performed on whole islets, lumping disparate islet cell types together, or microscopy or molecular studies on dispersed islet cells, disrupting islet architecture. For in vivo islet studies, paraffin-embedded pancreas sectioning is a powerful technique to assess cell-specific outcomes in the native pancreatic environment. Studying post-culture islets by paraffin sectioning would offer several advantages: detection of multiple outcomes on the same islets (potentially even the exact-same islets, using serial sections), cell-type-specific measurements, and maintaining native islet cell-cell and cell-substratum interactions both during experimental exposure and for analysis. However, existing techniques for embedding isolated islets post-culture are inefficient, time consuming, prone to loss of material, and generally produce sections with inadequate islet numbers to be useful for quantifying outcomes. Clinical pathology laboratory cell block preparation facilities are inaccessible and impractical for basic research laboratories. We have developed an improved, simplified bench-top method that generates sections with robust yield and distribution of islets. Fixed islets are resuspended in warm histological agarose gel and pipetted into a flat disc on a standard glass slide, such that the islets are distributed in a plane. After standard dehydration and embedding, multiple (10+) 4 - 5 &#181;m sections can be cut from the same islet block. Using this method, histological&#160;and immunofluorescent analyses can be performed on mouse, rat, and human islets. This is an effective, inexpensive, time-saving approach to assess cell-type-specific, intact-architecture outcomes from cultured islets.

Ex vivo pancreatic islet studies are important for diabetes research. Existing techniques to study cultured islets in their native 3-dimensional architecture are time consuming, inefficient, and infrequently used. This work describes a new, simple, and efficient method for generating high-quality paraffin sections of whole cultured islets.

Pancreatic Islet Einbettung für Paraffin Abschnitte

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

Intrazelluläre Signalereignisse und Hormonsekretion in menschlichen Pseudoinseln

Human Pseudoislet System for Synchronous Assessment of Fluorescent Biosensor Dynamics and Hormone Secretory Profiles

The pancreatic islets of Langerhans, which are small 3D collections of specialized endocrine and supporting cells interspersed throughout the pancreas, have a central role in the control of glucose homeostasis through the secretion of insulin by beta cells, which lowers blood glucose, and glucagon by alpha cells, which raises blood glucose. Intracellular signaling pathways, including those mediated by cAMP, are key for regulated alpha and beta cell hormone secretion. The 3D islet structure, while essential for coordinated islet function, presents experimental challenges for mechanistic studies of the intracellular signaling pathways in primary human islet cells. To overcome these challenges and limitations, this protocol describes an integrated live-cell imaging and microfluidic platform using primary human pseudoislets generated from donors without diabetes that resemble native islets in their morphology, composition, and function. These pseudoislets are size-controlled through the dispersion and reaggregation process of primary human islet cells. In the dispersed state, islet cell gene expression can be manipulated; for example, biosensors such as the genetically encoded cAMP biosensor, cADDis, can be introduced. Once formed, pseudoislets expressing a genetically encoded biosensor, in combination with confocal microscopy and a microperifusion platform, allow for the synchronous assessment of fluorescent biosensor dynamics and alpha and beta cell hormone secretory profiles to provide more insight into cellular processes and function.

Autor im Rampenlicht: Untersuchung von Inselanomalien und -funktionen mit einem Pseudoislet-Protokoll 

This protocol describes a method for the synchronous acquisition and co-registration of intracellular signaling events and the secretion of insulin and glucagon by primary human pseudoislets using the adenoviral delivery of a cyclic adenosine monophosphate (cAMP) biosensor, a cAMP difference detector in situ (cADDis), and a microperifusion system.

Humanes Pseudoislet-System zur synchronen Bestimmung der Dynamik fluoreszierender Biosensoren und Hormonsekretionsprofile

The pancreatic islets of Langerhans, which are small 3D collections of specialized endocrine and supporting cells interspersed throughout the pancreas, ...

Ein hoher Gehalt

Zusammenfassung

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