Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Fritz-Thyssen-Stiftung (10.11.2.153, RK), die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, KR2119/3-2 und KR2119/8-1, RK), das Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF unterstützt , NGFNplus; 01GS08134, RK) und durch ein Promotionsstipendium von der gemeinnützigen Hertie-Stiftung [zu LFB]. Wir danken Carolin Obermaier und Julia Westermeier für ihre Unterstützung während der Videoaufnahme.

Ein. Haut-Biopsie und Kultivierung von humanen Fibroblasten <ol><li> Die Hautbiopsie muss von einem erfahrenen Arztes eingenommen werden. Der Eingriff erfolgt unter sterilen Bedingungen und erfordert örtlicher Betäubung. Typische Stellen für die Biopsie verwendet werden, sind die innere Seite der oberen Schulter, Arm oder Rücken. </li><li> Sie können 4x4mm oder 6x6mm Durchmesser Probe durch Stanzbiopsie zu ergreifen, um genügend Gewebe für die Kultivierung humaner Fibroblasten erhalten. </li><li> Schneiden Sie die Haut in gleiche kleine Stücke Biopsie unter sterilen Bedingungen, um sie in 2-4 T25-Kolben zu trennen. Jeder Kolben sollte 2-3 Stück der Epidermis. Kulturmedienvorrichtung enthält 15% FCS, 1,1% Natriumpyruvat und 1% Penicillin / Streptomycin in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium. </li><li> Inkubieren der Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2. Die erwartete Laufzeit bis zum ersten Fibroblasten wachsen aus dem epidermalen Probe 1-2 Wochen. Wenn das Wachstum dennoch Probleme auftreten, können Sie Gebrauch machen von Fibroblasten-Wachstumsfaktor factor (5-10 ng / ml FGF2) Verbesserung Wachstums von Zellen. </li><li> Sobald eine Zelle Konfluenz von 50-70% erreicht ist, können die primären humanen Fibroblasten eingefroren. Die Zeit, bis 50-70% Konfluenz erreicht ist, unterscheidet sich unter Zelllinien. Frieren Sie die Fibroblasten in 90% FCS plus 10% Dimethylsulfoxid (DMSO). </li></ol> 2. Vorbereitung des menschlichen Fibroblasten für das Live Cell Imaging Microscopy Im Allgemeinen sollten Versuche mit humanen Fibroblasten mit Durchgängen unter 10 durchgeführt werden, wie Seneszenz-assoziierten Veränderungen können Eigenschaften von Zellen nach mehreren Durchgängen zu ändern. Im Zweifelsfall kann beta-Galactosidase-Assays verwendet, um die Induktion von Alterungsprozessen in den jeweiligen Zellen beurteilen. Im Allgemeinen verwenden Sie keine alten Fibroblasten (siehe oben). Weiterhin mehrere Zelllinien zu vergleichen, mit der gleichen Anzahl von Durchgangs jeder Zelllinie arbeiten. Vergleich verschiedener genetisch homogen Patienten im Vergleich zu gesunden Kontrollen empfohlen. Wie jedoch manchmalPatienten, die spezifische Mutationen selten sein, kann dies bedeuten, dass Hautbiopsien von nur einem Patienten mit einer bestimmten Textstelle, Anzahl und verschiedene Steuerleitungen berücksichtigt werden müssen - hier ist es wichtig, die gleiche Passage Anzahl aller Zeilen enthalten gewährleisten. Wenn eine Zelle Konfluenz von 50-70% erreicht ist, aber kein Experiment geplant, sollte Fibroblasten eingefroren. <ol><li> Am ersten Tag des Experiments, wäscht die beigefügten Fibroblasten einmal mit PBS. Dann lassen sie aus dem Kolben mittels eines unteren Zellablösung Lösung von proteolytischen Enzymen DNase (dh ACCUMAX). </li><li> Zählen Sie Ihre Zellen und Samen 50.000-70.000 Zellen in jeder Vertiefung einer 4-Kammer-Deckglas (1,8 cm 2 Kulturfläche pro Well). Dementsprechend wird für den 8-Kammer coverglas, ist die Hälfte der Zellzahl oder ein wenig weniger geeignet (0,8 cm 2 Kulturfläche pro Well). Es ist wichtig, Saatgut sondern eine kleine Anzahl von Zellen, um reale einzellige Analyse durchzuführen. Keine spezielle Beschichtung für den Kammern is benötigt. </li><li> Nach 24-48 Stunden kann das Live Cell Imaging Experiment durchgeführt werden. Stellen Sie sicher, dass das Live Cell Imaging Mikroskop mit einem Inkubator, der Temperatur und CO 2 Ebenen steuert ausgestattet. Während der Bildaufnahme, eine Atmosphäre von 37 ° C und 5% CO 2 sollte beibehalten werden. </li><li> Jeder Live Cell Imaging Messung sollte in mindestens drei unabhängigen Experimenten durchgeführt werden. Insgesamt sollte ein Minimum von 50 Zellen pro Zelllinie abgebildet werden. Die Live Cell Imaging Experimente sowie die Off-line-Analysen müssen unter verblindeten Bedingungen unvoreingenommene Datenerfassung garantiert durchgeführt werden. </li></ol> 3. Messung der mitochondrialen Funktion in lebenden menschlichen Fibroblasten Für herkömmliche Messung der mitochondrialen Funktion über Mitochondrienmembranpotential (MMP)-abhängigen Farbstoffe, fluoreszierend ist Zellsortierung (FACS) die primäre Methode. Im Fall der humanen Fibroblasten, zelluläre autofluorescence wird häufig beobachtet und können falsch positive Ergebnisse durch Interferenz mit dem eigentlichen Testsystem Signal verursachen. Autofluoreszenz der Regel stärker ausgeprägt mit höheren Zahlen von Passagen von Fibroblasten. Daher bevorzugen wir die Funktion der Mitochondrien der menschlichen Fibroblasten durch live cell imaging microscopy beurteilen. <ol><li> 24-48 Stunden nach der Aussaat, inkubiere die Fibroblasten in 50 nM des MMP-abhängigen Farbstoff tetramethylrodamine ethylester (TMRE) in RPMI Medium. Diese RPMI Medium sollte fehlt Phenolrot, da dies negative Auswirkungen auf die Bildqualität. 1,6 uM Hoechst-Färbung sollte hinzugefügt werden, um Kerne zu visualisieren. </li><li> Inkubieren vorbereiteten Zellen in Färbelösung vom Licht für 15 min geschützt bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Ersetzen Sie die Färbelösung mit RPMI-Medium (ohne Phenolrot). Gehen Sie ohne Waschschritt und sofort Bildzellen. Verwenden 63x Vergrößerung und konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie-Technik (alternativ Fluoreszenzmikroskopie mitApotome Technik) zu definieren, einzelne Schichten von Zellen. Anwenden 37 ° C und 5% CO 2 bis Zellen während Abbildungsverfahren. </li><li> Bei der Abbildung die Fibroblasten, maximale Aufmerksamkeit auf die Anwendung Belichtungszeit von Fluoreszenzlicht TMRE Färbung ausbleichen schnell. Definieren Sie Ihre passende Belichtung Zeit zwischen 200 und 300 ms und nicht mehr als dieses Intervall. Die Bildaufnahme unter standardisierten Einstellungen ist sehr wichtig, da man nicht in der Lage sein würde, um Vergleiche anhand Intensität machen, wenn die Einstellungen verschiedener zwischen Zelllinien sind. </li><li> Als definierten Radius um die abgebildeten Zellen wird nach der Belichtung gebleicht, halten Sie die nächsten Gesichtsfeld ausreichend weit von der photogebleichten Abschnitt. </li><li> Off-line-Analysen erfolgen mit ImageJ Software (Wayne Rasband; National Institutes of Health, USA). </li><li> Wählen Sie Ihre Zelle von Interesse mit einem Auswahl-Werkzeug. </li><li> Wandelt Bilder in 8-Bit (Image &lt;Type &lt;8-Bit). </li><li> Reduzieren unspezifische Lärm by mit dem &quot;Flecken Entfernen&quot;-Funktion (Process &lt;Noise &lt;Fleckfilter). </li><li> Wählen Sie die &quot;Lookup Tables - Fire&quot; Zustand (Image &lt;Lookup Tables &lt;Fire). </li><li> Schalten Sie in der Schwelle Funktion dem &quot;Over / Under&quot;-Funktion und stellen Schwelle (Image &lt;Regeln &lt;Threshold). </li><li> Wählen Sie den &quot;analysieren Teilchen&quot;-Option, die Ihnen die mittleren Grauwert für jeden mitochondrialen Partikel nachweisbar (Analyze &lt;Analysieren Particles). Speichern Sie die gegebenen Ergebnis-Liste als Excel-Tabelle. </li><li> Offene Ergebnis-Datei in Excel-Programm und der Mittelwert der mittleren Grauwert der mitochondrialen Strukturen (angezeigt als &quot;Mittel&quot; in der gegebenen excel Ergebnisliste). </li><li> Eine Fläche Grundstück zu erstellen, wählen Sie das Plugin &quot;Interaktive 3D-Oberflächen Plot&quot; in &quot;3D&quot; plugin Abschnitt. Hier können Sie weiter anpassen das Grundstück mit verschiedenen Display-Optionen. Ändern der &quot;Original Colors&quot; auf &quot;Spectrum LUT&quot; gibt die Intensität Maßstab für die entsprechende Handlung. </li><li> Alternativzur Verwendung TMRE zum Analysieren des mitochondrialen Funktion des menschlichen Fibroblasten via lebender Zellen, einer Kombination aus dem MMP-unabhängigen Farbstoff Mitotracker Grün FM und der MMP-abhängigen Farbstoff Mitotracker CM-H 2 Xros verwendet werden können. Nochmals zum humanen Fibroblasten leben Zelle Mikroskopie bevorzugt wird, aber im Allgemeinen diese Alternative ist auch verwendet worden unter Verwendung von FACS-Analyse in anderen Art von Zellen 12. Bei der Verwendung dieser alternativen Ansatz zur mitochondrialen Funktion in menschlichen Fibroblasten, Schritt 3-7 des Protokolls Abschnitt 5 zu messen &quot;Measurement of mitochondrio-lysosomalen Kolokalisation in lebenden menschlichen Fibroblasten&quot; angewendet werden soll. Damit wird die Überlagerung von Signalen, sowohl von Mitochondrien positiv für Mitotracker Grün FM und Mitotracker CM-H 2 Xros berechnet und gibt die Menge an funktionellem Mitochondrien als Verhältnis zu allen Mitochondrien vorliegt. </li></ol> 4. Messung der mitochondrialen Morphologie in lebenden menschlichen Fibroblasten <ol><li> 24-48h nach dem Aussäen inkubieren Zellen in 200 nM Mitotracker Grün FM in RPMI-Medium (ohne Phenolrot) vor Licht für 15 min geschützt bei 37 ° C und 5% CO 2. 1,6 uM Hoechst-Färbung sollte verwendet werden, um Kerne hervorzuheben. Mitotracker Grün FM ist ein MMP-unabhängige Farbstoff, der Flecken alle mitochondrialen Strukturen präsentieren. </li><li> Vorsichtig waschen die Zellen einmal mit PBS. </li><li> Fügen Sie frisches RPMI-Medium (ohne Phenolrot), um Zellen und sofort Bildzellen. Verwenden 63x Vergrößerung und konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie-Technik (alternativ Fluoreszenzmikroskopie mit ApoTome Technik), um einzelne Schichten von Zellen zu definieren. </li><li> Offline-Analysen werden unter Verwendung von Software ImageJ entnommen. </li><li> Wählen Sie Ihre Zelle von Interesse mit einem Auswahl-Werkzeug. </li><li> Wandelt Bilder in 8-Bit (Image &lt;Type &lt;8-Bit). </li><li> Reduzieren unspezifische Geräusche mit dem &quot;Säubern&quot;-Funktion (Process &lt;Noise &lt;Fleckfilter). </li><li> Verwenden Sie die Faltung Filter Mitochondrien markierendrial Strukturen (Prozess &lt;Filter &lt;Convolve). </li><li> Der Schwellenwert eingestellt werden, so dass das Signal-zu-Rausch-Verhältnis geeignet ist (Bild &lt;Stellen &lt;Schwelle). </li><li> Durch die Verwendung der &quot;analysieren Teilchen&quot;-Option wird die automatische Identifizierung von mitochondrialen Strukturen basierend auf einer gewählten Pixelgröße eingeleitet (Analysieren &lt;Analysieren Partikel). Mehrere mitochondrialen Parameter werden anschließend wie Fläche, Umfang, kleine und große Achsen oder Zirkularität berechnet. Diese Messungen können individuell eingestellt werden (Analyze &lt;Set Messungen). Speichern Sie die gegebenen Ergebnis-Liste als Excel-Tabelle. </li><li> Öffnen Ergebnis-Datei in Excel-Programm. Bei Verwendung von solchen Parametern können Analysen Mitochondrienmorphologie durchgeführt werden. Dies umfasst die Bestimmung des Formfaktors die den Grad der Verzweigung eines mitochondrialen Netzwerk [Formel: (Umfang 2) / (4 * PI () *-Bereich)] sowie das Längenverhältnis, die die Länge der Mitochondrien (Formel: major Achsen / Nebenachse). </li></ol> 5. Messung der Mitochondrio-lysosomalen Kolokalisation in lebenden menschlichen Fibroblasten <ol><li> 24-48 h nach dem Aussäen inkubieren Zellen in 200 nM Mitotracker Grün FM und 100 nM Lyostracker Red DND-99 in RPMI-Medium (ohne Phenolrot) vor Licht für 15 min geschützt bei 37 ° C und 5% CO 2. 1,6 uM Hoechst-Färbung wird verwendet, um Kerne zu markieren. </li><li> Ersetzen Sie das Medium durch frisches RMPI Medium (ohne Phenolrot) mit 100 nM Lyostracker Red DND-99. Dieser Farbstoff hat, um während der gesamten Bildgebungssitzung vorliegt. Waschen Sie die Zellen nach Inkubationszeit. Unmittelbar Bild der Zellen. Verwenden 63x Vergrößerung und konfokale Technik (alternativ ApoTome Technik), um einzelne Schichten von Zellen zu definieren. </li><li> Offline-Analysen werden unter Verwendung von Software ImageJ entnommen. </li><li> Öffnen Sie die beiden jeweiligen Bilder, die Sie gerne in Bezug auf Kolokalisation Status analysieren würde. </li><li> Wandelt Bilder in 8-Bit (Image &lt;Type &lt;8-Bit). </li&gt; <li> Reduzieren unspezifische Geräusche mit dem &quot;Säubern&quot;-Funktion in beiden Bildern (Process &lt;Noise &lt;Fleckfilter). </li><li> Wählen Sie das Plugin &quot;Jacop&quot; als Kolokalisation Analyse-Tool, das Ihnen für die jeweiligen Kanäle und berechnet die Pearson-Koeffizient, überlappen Koeffizienten und Manders &#39;Koeffizient (Plugins &lt;Jacop). </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Die Funktion der Mitochondrien in lebenden menschlichen Fibroblasten können via live cell imaging-Technik ausgewertet werden. Für funktionelle Assays korreliert die TMRE Fluoreszenzsignal mit der mitochondrialen Membranpotentials (MMP). Unter normalen Bedingungen MMP ist der TMRE Fluoreszenz signifikant höher (Abbildung 1A, obere Reihe) als auch unter pathologischen Bedingungen, durch einen reduzierten MMP (1A, untere Reihe) aufweist. Diese Fluoreszenzintensität wird durch Berechnen des Durchschnitts der mittleren Grauwert jedes Mitochondrienstruktur gemessen ( <strong&gt; Abbildung 1B). Die Fluoreszenzintensität über ImageJ Software gemessen werden. Hier wird die Verwendung der Option &quot;interaktive Oberfläche plot&quot; ermöglicht die Darstellung verschiedener Intensitäten (Abbildung 1A, rechte Seite). Neben der Beurteilung des mitochondrialen Funktion in humanen Fibroblasten, können lebender Zellen Mikroskopie verwendet werden, um verschiedene Parameter des Mitochondrienmorphologie definieren. Durch die Verwendung des Farbstoffs Mitotracker Grün FM Mitochondrienstrukturen visualisiert unabhängig von ihrer jeweiligen MMP (Abbildung 2). Dies ist wichtig, um die Einbeziehung aller mitochondrialen Strukturen Gegenwart in der Analysen zu gewährleisten. Mit ImageJ Software wird die Morphologie auf der Grundlage von binären Zahlen analysiert, da nur hier Mitochondrienmorphologie Parametern beurteilt werden kann (Abbildung 2, &quot;binary&quot;) werden. Beispiele für Mitochondrienmorphologie Analysen in Bezug auf Form-Faktor sowie Seitenverhältnis wurden kürzlich 6, 1 veröffentlicht3. Ein weiteres wichtiges Merkmal, das in lebendem menschlichen Fibroblasten gemessen werden kann, ist die Verschlechterung der Mitochondrien-Strukturen. Der erste Schritt in dieser Entwicklung kann durch mitochondrio-lysosomalen Kolokalisation im Live Cell Imaging Mikroskopie beurteilt werden. Bestimmten pathologischen Bedingungen zu einem erhöhten Colokalisation Mitochondrien mit Lysosomen (Abbildung 3A). Wiederum wird Mitotracker Grün FM zur mitochondrialen Strukturen unabhängig von ihrer jeweiligen MMP färben. Darüber hinaus Färbung mit LysoTracker Red DND-99 ermöglicht die Visualisierung lysosomalen Strukturen. Es ist kritisch, dass die LysoTracker Red Farbstoff vorhanden ist während des bildgebenden Verfahrens, wie Waschschritte reduzieren das Signal, das zu niedrig ist für die Visualisierung. Kolokalisation erhält klare gelbe Fluoreszenz-Signale aufgrund der Überlappung der grünen (Mitotracker Grün FM) und Rot (LysoTracker Red DND-99) Färbung (weiße Pfeile, Fig. 3A) dargestellt werden, und durch Berechnung des Pearson coe bestimmtizient (Abbildung 3B). Im Allgemeinen wird für Off-Line-Analysen mit ImageJ Software, ist es hilfreich, eine Zelle pro Bild sichtbar zu machen, so daß die Definition einer bestimmten Region von Interesse (ROI) vermieden werden kann. <img alt="Abbildung 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4228/4228fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4228/4228fig1.jpg" /> Abbildung 1. Messung der Fluoreszenz TMRE Signal, das den mitochondrialen Membranpotentials (MMP) in lebenden menschlichen Fibroblasten durch Lebendzelldichte Bildgebungstechnik. (A) ein fluoreszierendes TMRE MMP-abhängigen Farbstoff, dessen Fluoreszenz-Intensität korreliert mit der MMP. Hoechst-Farbstoff wurde verwendet, um Kerne (blau) zu färben. Unter normalen Bedingungen MMP (obere Reihe), ist die TMRE Fluoreszenz signifikant höher als unter pathologischen Bedingungen durch eine reduzierte MMP (untere Reihe) aufweist. Fluoreszenzintensität wird zusätzlich angezeigtdie Intensität Oberfläche Grundstück. Maßstab zeigt 10 um. (B) Statistische Analysen der beispielhaften Fibroblasten in (A) gezeigt. Unter pathologischen Bedingungen wird eine verringerte TMRE Fluoreszenz der Mitochondrien im Vergleich zum normalen MMP Zustand gemessen. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4228/4228fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4228/4228fig2.jpg" /> Abbildung 2. Messung der mitochondrialen Morphologie in lebenden menschlichen Fibroblasten durch Live Cell Imaging-Technik. Mitotracker Grün FM (grün) verwendet wird, um mitochondriale Strukturen sichtbar zu machen, dafür ist es unabhängig von der MMP. Hoechst-Farbstoff wurde verwendet, um Kerne (blau) zu färben. Mit ImageJ Software kann die Morphologie der binären Zahlen analysiert werden. Maßstab zeigt 10 um. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4228/4228fig2large.jpg" target="_blank">Klicken</a><html> hier, um eine größere Ansicht Figur. <img alt="Abbildung 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4228/4228fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4228/4228fig3.jpg" /> Abbildung 3. Messung der Kolokalisation von Mitochondrien mit Lysosomen in lebenden menschlichen Fibroblasten durch Live Cell Imaging-Technik. (A) Mitotracker Grün FM (grün) verwendet wird, um Mitochondrienstrukturen färben, Lyostracker Red DND-99 (rot) visualisiert lysosomalen Strukturen. Hoechst-Farbstoff wurde verwendet, um Kerne (blau) zu färben. Erfolgreiche Kolokalisation unter pathologischen Bedingungen wird durch eine gelbe Signal aufgrund der LysoTracker Rot und Mitotracker Grün-Färbung (weiße Pfeile) überschneiden angezeigt. Maßstab zeigt 10 um. (B) Statistische Analysen der beispielhaften Fibroblasten in (A) gezeigt. Ein höheres Maß an mitochondrio-lysosomalen Kolokalisation führt zu einer erhöhten Pearson Koeffizientenwert./ 4228/4228fig3large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Patient Hautfibroblasten als ex vivo Modelle stellen ein wichtiges Instrument zur krankheits-assoziierte genetische Defekte zu charakterisieren. Darüber hinaus sind Haut-abgeleiteten Fibroblasten leicht zugänglich und kann bei Kultivierung erweitert werden. Daher sind primäre Zellen von Patienten tragenden PD-assoziierten genetischen Mutationen erhaltenen gegenüber der Verwendung von Tumorzelllinien bevorzugt, da sie nicht nur das endogene krankheitsverursachende Gen, sondern das gesamte genetische Hintergr...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namen Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nr. </td></tr><tr><td> Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 52400-025 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 Medium, kein Phenolrot </td><td> Invitrogen </td><td> 11835-063 </td></tr><tr><td> Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-094 </td></tr><tr><td> Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) </td><td> PeproTech </td><td> 100-18B </td></tr><tr><td> ACCUMAX (Ablösung Lösung) </td><td> PAA </td><td> L11-008 </td></tr><tr><td> Lab-TekTMII chambered Deckgläsern </td><td> Nalge Nunc International </td><td> 115382 </td></tr><tr><td> Tetramethylrodamine ethylester (TMRE) </td><td> Invitrogen </td><td> T-669 </td></tr><tr><td> Mitotracker Grün FM </td><td> Invitrogen </td><td> M-7514 </td></tr><tr><td> Mitotracker CM-H2XRos </td><td> Invitrogen </td><td> M-7513 </td></tr><tr><td> Lyostracker Red DND-99 </td><td> Invitrogen </td><td> L-7528 </td></tr><tr><td> Hoechst 33342 </td><td> Invitrogen </td><td> H-3570 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Spezifisch Reagenzien und Ausrüstung.

the use of primary human fibroblasts for monitoring mitochondrial phenotypes in the field of parkinson's disease

Parkinson-Krankheit (PD) ist die zweithäufigste Bewegungsstörung und betrifft 1% der Menschen im Alter von über 60 1. Da Altern ist der wichtigste Risikofaktor, wird Fälle von PD in den nächsten Jahrzehnten 2 zu erhöhen. Weiter zu pathologischen Proteinfaltung und eingeschränkter Protein Abbauwege wurden Veränderungen der mitochondrialen Funktion und Morphologie als weitere Markenzeichen der Neurodegeneration bei PD 3-11 hingewiesen. Nach Jahren der Forschung in murinen und humanen Krebszellen in vitro Modellen zur molekularen Mechanismen der Parkinson sezieren, hat die Verwendung von menschlichen Fibroblasten von Patienten und entsprechende Kontrollen als Ex-vivo-Modelle zu einem wertvollen Recherche-Tool, wenn potenzielle Einschränkungen berücksichtigt werden. Anders als unsterblich, sondern künstliche Zelle Modelle primären Fibroblasten von Patienten tragen krankheits-assoziierte Mutationen scheinbar reflektieren wichtige pathologische Merkmale of die humane Erkrankung. Hier beschreiben das Verfahren der Einnahme Hautbiopsien, Kultivierung humaner Fibroblasten und mit detaillierten Protokollen für wesentliche mikroskopischen Techniken zu mitochondrialen Phänotypen zu definieren. Diese wurden verwendet, um verschiedene Funktionen mit PD verbunden, die relevant für die Funktion der Mitochondrien und Dynamik untersuchen. Ex vivo kann Mitochondrien über den lysosomalen Weg im Hinblick auf ihre Funktion, Morphologie, Kolokalisation mit Lysosomen (die Organellen abbauenden dysfunktionellen Mitochondrien) und Degradation analysierenden . Diese Phänotypen höchst relevant sind für die Identifizierung von frühen Zeichen der PD und können klinische motorischen Symptome in menschlichen Krankheiten Genträgern vorausgehen. Somit können die hier dargestellten Assays als wertvolle Werkzeuge verwendet werden, um pathologische Merkmale von Neurodegeneration identifizieren und dazu beitragen, neue therapeutische Strategien PD definieren.

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The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson&#039;s Disease

Fibroblasten von Patienten mit Mutationen in der Parkinson-Krankheit verursachenden Gene stellen ein leicht zugängliches<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modell krankheits-assoziierte Phänotypen studieren. Live Cell Imaging bietet die Möglichkeit, morphologische und funktionelle Parameter in lebenden Zellen zu studieren. Hier beschreiben wir die Herstellung von humanen Fibroblasten und anschließende Überwachung der mitochondrialen Phänotypen.

Die Verwendung von primären humanen Fibroblasten zur Überwachung Mitochondriale Phänotypen auf dem Gebiet der Parkinson-Krankheit

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

16.7K Aufrufe.  DZNE. Fibroblasten von Patienten mit Mutationen in der Parkinson-Krankheit verursachenden Gene stellen ein leicht zugängliches Ex vivo Modell krankheits-assoziierte Phänotypen studieren. Live Cell Imaging bietet die Möglichkeit, morphologische und funktionelle Parameter in lebenden Zellen zu studieren. Hier beschreiben wir die Herstellung von humanen Fibroblasten und anschließende Überwachung der mitochondrialen Phänotypen.

Serie: The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

Experimentelle Erzeugung von Karzinom-assoziierte Fibroblasten (CAF) von menschlichen Brustkrebszellen Fibroblasten

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Forschung

Medizin

Development of a Unilaterally-lesioned 6-OHDA Mouse Model of Parkinson's Disease

The unilaterally lesioned 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned rat model of Parkinson's disease (PD) has proved to be invaluable in advancing our understanding of the mechanisms underlying parkinsonian symptoms, since it recapitulates the changes in basal ganglia circuitry and pharmacology observed in parkinsonian patients1-4. However, the precise cellular and molecular changes occurring at cortico-striatal synapses of the output pathways within the striatum, which is the major input region of the basal ganglia remain elusive, and this is believed to be site where pathological abnormalities underlying parkinsonian symptoms arise3,5.
In PD, understanding the mechanisms underlying changes in basal ganglia circuitry following degeneration of the nigro-striatal pathway has been greatly advanced by the development of bacterial artificial chromosome (BAC) mice over-expressing green fluorescent proteins driven by promoters specific for the two striatal output pathways (direct pathway: eGFP-D1; indirect pathway: eGFP-D2 and eGFP-A2a)8, allowing them to be studied in isolation. For example, recent studies have suggested that there are pathological changes in synaptic plasticity in parkinsonian mice9,10. However, these studies utilised juvenile mice and acute models of parkinsonism. It is unclear whether the changes described in adult rats with stable 6-OHDA lesions also occur in these models. Other groups have attempted to generate a stable unilaterally-lesioned 6-OHDA adult mouse model of PD by lesioning the medial forebrain bundle (MFB), unfortunately, the mortality rate in this study was extremely high, with only 14% surviving the surgery for 21 days or longer11. More recent studies have generated intra-nigral lesions with both a low mortality rate &gt;80% loss of dopaminergic neurons, however expression of L-DOPA induced dyskinesia11,12,13,14 was variable in these studies. Another well established mouse model of PD is the MPTP-lesioned mouse15. Whilst this model has proven useful in the assessment of potential neuroprotective agents16, it is less suitable for understanding mechanisms underlying symptoms of PD, as this model often fails to induce motor deficits, and shows a wide variability in the extent of lesion17, 18.
Here we have developed a stable unilateral 6-OHDA-lesioned mouse model of PD by direct administration of 6-OHDA into the MFB, which consistently causes &gt;95% loss of striatal dopamine (as measured by HPLC), as well as producing the behavioural imbalances observed in the well characterised unilateral 6-OHDA-lesioned rat model of PD. This newly developed mouse model of PD will prove a valuable tool in understanding the mechanisms underlying generation of parkinsonian symptoms.

Development of a Unilaterally-lesioned 6-OHDA Mouse Model of Parkinson&#039;s Disease

A protocol for performing unilateral 6-OHDA lesions of the medial forebrain bundle in mice is described. This method has a low mortality rate (13.3 %) with 89% of the surviving animals showing &#62;95% loss of striatal dopamine and 90.63&#177;-4.02 % ipsiversive rotational bias towards the side of the lesion.

Entwicklung eines Einseitig-läsionierten 6-OHDA Mausmodell der Parkinson-Krankheit

The unilaterally lesioned 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned rat model of Parkinson's disease (PD) has proved to be invaluable in advancing our ...

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson's Disease

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 (Fig.1). A 12 &mu;m thin tissue section is covered with a MALDI matrix, which facilitates desorption and ionization of intact peptides and proteins that can be detected with a mass analyzer, typically using a MALDI TOF/TOF mass spectrometer. Generally hundreds of peaks can be assessed in a single rat brain tissue section. In contrast to commonly used imaging techniques, this approach does not require prior knowledge of the molecules of interest and allows for unsupervised and comprehensive analysis of multiple molecular species while maintaining high molecular specificity and sensitivity2. Here we describe a MALDI IMS based approach for elucidating region-specific distribution profiles of neuropeptides in the rat brain of an animal model Parkinson's disease (PD). 
PD is a common neurodegenerative disease with a prevalence of 1% for people over 65 of age3,4. The most common symptomatic treatment is based on dopamine replacement using L-DOPA5. However this is accompanied by severe side effects including involuntary abnormal movements, termed L-DOPA-induced dyskinesias (LID)1,3,6. One of the most prominent molecular change in LID is an upregulation of the opioid precursor prodynorphin mRNA7. The dynorphin peptides modulate neurotransmission in brain areas that are essentially involved in movement control7,8. However, to date the exact opioid peptides that originate from processing of the neuropeptide precursor have not been characterized. Therefore, we utilized MALDI IMS in an animal model of experimental Parkinson's disease and L-DOPA induced dyskinesia. 
MALDI imaging mass spectrometry proved to be particularly advantageous with respect to neuropeptide characterization, since commonly used antibody based approaches targets known peptide sequences and previously observed post-translational modifications. By contrast MALDI IMS can unravel novel peptide processing products and thus reveal new molecular mechanisms of neuropeptide modulation of neuronal transmission. While the absolute amount of neuropeptides cannot be determined by MALDI IMS, the relative abundance of peptide ions can be delineated from the mass spectra, giving insights about changing levels in health and disease. In the examples presented here, the peak intensities of dynorphin B, alpha-neoendorphin and substance P were found to be significantly increased in the dorsolateral, but not the dorsomedial, striatum of animals with severe dyskinesia involving facial, trunk and orolingual muscles (Fig. 5). Furthermore, MALDI IMS revealed a correlation between dyskinesia severity and levels of des-tyrosine alpha-neoendorphin, representing a previously unknown mechanism of functional inactivation of dynorphins in the striatum as the removal of N-terminal tyrosine reduces the dynorphin's opioid-receptor binding capacity9. This is the first study on neuropeptide characterization in LID using MALDI IMS and the results highlight the potential of the technique for application in all fields of biomedical research.

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson&#039;s Disease

Dopamine replacement pharmacotherapy using L-DOPA is the most commonly used symptomatic treatment of Parkinson&#x2019;s disease, but is accompanied by side effects including involuntary abnormal movements, termed dyskinesia 1. Here, a protocol for MALDI imaging mass spectrometry is presented that detects changes in rat brain neuropeptide levels related to dyskinesia.

MALDI-Imaging-Massenspektrometrie von Neuropeptiden bei Parkinsonpatienten

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 ...

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts in this protocol have been successfully used in the derivation of induced pluripotent stem cells to model disease1. Early passages of these fibroblasts can also be used for cell-based functional assays to study specific disease pathways, mechanisms2 and subsequent drug screening approaches. The advantage of the presented protocol over enzymatic procedures are 1) the reproducibility of the technique from small amounts of tissue derived from older patients, e.g. patients affected with Parkinson's disease, 2) the technically simple approach over more challenging methodologies using enzymatic treatments, and 3) the time consideration: this protocol takes 15-20 min and can be performed immediately after biopsy arrival. Enzymatic treatments can take up to 4 hr and have the problems of overdigestion, reduction of cell viability and subsequent attachment of cells when not handled properly. This protocol describes the dissection and preparation of a 4-mm human skin biopsy for derivation of a fibroblast culture and has a very high success rate which is important when dealing with patient-derived tissue samples. In this culture, keratinocytes migrate out of the biopsy tissue within the first week after preparation. Fibroblasts appear 7-10 days after the first outgrowth of keratinocytes. DMEM high glucose media supplemented with 20% FBS favors the growth of fibroblasts over keratinocytes and fibroblasts will overgrow the keratinocytes. After 2 passages keratinocytes have been diluted out resulting in relatively homogenous fibroblast cultures which expresses the fibroblast marker SERPINH1 (HSP-47). Using this approach, 15-20 million fibroblasts can be derived in 4-8 weeks for cell banking. The skin dissection takes about 15-20 min, cells are then monitored once a day under the microscope, and media is changed every 2-3 days after attachment and outgrowth of cells.

The fibroblast explant culture protocol from human skin punch biopsies is a technically robust and simple way to derive skin cells within 4-8 weeks for banking of about 15-20 million cells at a low passage number.

Haut Stanzbiopsie Explantatkultur für die Ableitung des primären humanen Fibroblasten

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform PrPSc 1. PrPC is detergent-soluble and sensitive to proteinase K (PK)-digestion, whereas PrPSc forms detergent-insoluble aggregates and is partially resistant to PK2-6. The conversion of PrPC to PrPSc is known to involve a conformational transition of &alpha;-helical to &beta;-sheet structures of the protein. However, the in vivo pathway is still poorly understood. A tentative endogenous PrPSc, intermediate PrP* or "silent prion", has yet to be identified in the uninfected brain7.
Using a combination of biophysical and biochemical approaches, we identified insoluble PrPC aggregates (designated iPrPC) from uninfected mammalian brains and cultured neuronal cells8, 9. Here, we describe detailed procedures of these methods, including ultracentrifugation in detergent buffer, sucrose step gradient sedimentation, size exclusion chromatography, iPrP enrichment by gene 5 protein (g5p) that specifically bind to structurally altered PrP forms10, and PK-treatment. The combination of these approaches isolates not only insoluble PrPSc and PrPC aggregates but also soluble PrPC oligomers from the normal human brain. Since the protocols described here have been used to isolate both PrPSc from infected brains and iPrPC from uninfected brains, they provide us with an opportunity to compare differences in physicochemical features, neurotoxicity, and infectivity between the two isoforms. Such a study will greatly improve our understanding of the infectious proteinaceous pathogens. The physiology and pathophysiology of iPrPC are unclear at present. Notably, in a newly-identified human prion disease termed variably protease-sensitive prionopathy, we found a new PrPSc that shares the immunoreactive behavior and fragmentation with iPrPC 11, 12. Moreover, we recently demonstrated that iPrPC is the main species that interacts with amyloid-&beta; protein in Alzheimer disease13. In the same study, these methods were used to isolate Abeta aggregates and oligomers in Alzheimer's disease13, suggesting their application to non-prion protein aggregates involved in other neurodegenerative disorders.

A new species of cellular prion protein (PrPC) has recently been identified in uninfected human brains using the methods described here. These methods can be used to isolate various PrP species, while some of them are also useful in isolating other misfolded protein aggregates from human brains.

Isolierung von löslicher und unlöslicher PrP Oligomere in das normale menschliche Gehirn

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform ...

Orthotopic Aortic Transplantation in Mice for the Study of Vascular Disease

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. This is largely true, but there are a number of important principles that can reduce the difficulty of these procedures and enhance reproducibility. Orthotopic aortic transplantation is an excellent procedure in which to learn these principles because it involves only two end-to-end anastomoses, but requires good suturing technique and handling of the vessels for consistent success. This procedure begins with the procurement of a length of abdominal aorta from a donor animal, followed by division of the native aorta in the recipient. The procured aorta is then placed between the divided ends of the recipient aorta and sutured into place using end-to-end anastomoses. To accomplish this objective successfully requires a high degree of concentration, good tools, a steady hand, and an appreciation of how easily the vasculature of a mouse can be damaged, resulting in thrombosis. Learning these important principles is what occupies most of the beginner's time when learning microsurgery in small rodents. Throughout this protocol, we refer to these important points. This model can be used to study vascular disease in a variety of different experimental systems1-8. In the context shown here, it is most often used for the study of post-transplant vascular disease, a common long-term complication of solid organ transplantation in which intimal hyperplasia occurs within the allograft. The primary advantage of the model is that it facilitates quantitative morphometric analyses and the transplanted vessel lies contiguous to the endogenous vessel, which can serve as an additional control9. The technique shown here is most often used for mice weighing 18-25 grams. We have accumulated most of our experience using the C57BL/6J, BALB/cJ, and C3H/HeJ strains.

We describe a technique in which a section of the abdominal aorta from a mouse is transplanted orthotopically to just below the renal arteries in an allogeneic or syngeneic recipient. This technique can be useful in studies in which transplantation of large arteries of uniform size is deemed advantageous.

Orthotopen Aortic Transplantation in Mäuse für das Studium der Vascular Disease

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. ...

Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson's Disease

Lipoxygenase (LOX) activity has been implicated in neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s disease, but its effects in Parkinson&#39;s disease (PD) pathogenesis are less understood. Gene-environment interaction models have utility in unmasking the impact of specific cellular pathways in toxicity that may not be observed using a solely genetic or toxicant disease model alone.&#160;To evaluate if distinct LOX isozymes selectively contribute to PD-related neurodegeneration, transgenic (i.e. 5-LOX and 12/15-LOX deficient) mice can be challenged with a toxin that mimics cell injury and death in the disorder.&#160;Here we describe the use of a neurotoxin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP), which produces a nigrostriatal lesion to elucidate the distinct contributions of LOX isozymes to neurodegeneration related to PD. The use of MPTP in mouse, and nonhuman primate, is well-established to recapitulate the nigrostriatal damage in PD.&#160;The extent of MPTP-induced lesioning is measured by HPLC analysis of dopamine and its metabolites and semi-quantitative Western blot analysis of striatum for tyrosine hydroxylase (TH), the rate-limiting enzyme for the synthesis of dopamine. To assess inflammatory markers, which may demonstrate LOX isozyme-selective sensitivity, glial fibrillary acidic protein (GFAP) and Iba-1 immunohistochemistry are performed on brain sections containing substantia nigra, and GFAP Western blot analysis is performed on striatal homogenates.&#160;This experimental approach can provide novel insights into gene-environment interactions underlying nigrostriatal degeneration and PD.

Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson&#039;s Disease

Lipoxygenase (LOX) isozymes can generate products that may increase or decrease neuroinflammation and neurodegeneration.&#160;A gene-environment interaction study could identify LOX isozyme-specific effects. Using the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) model of nigrostriatal damage in two LOX isozyme-deficient transgenic lines allows for comparison of the contribution of LOX isozymes on dopaminergic integrity and inflammation.

Gen-Umgebung Interaktionsmodelle zur Entlarvung von Störmechanismen bei Parkinson-Krankheit

Lipoxygenase (LOX) activity has been implicated in neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s disease, but its effects in Parkinson&#39;s disease ...

Controlling Parkinson's Disease With Adaptive Deep Brain Stimulation

Adaptive deep brain stimulation (aDBS) has the potential to improve the treatment of Parkinson&#39;s disease by optimizing stimulation in real time according to fluctuating disease and medication state. In the present realization of adaptive DBS we record and stimulate from the DBS electrodes implanted in the subthalamic nucleus of patients with Parkinson&#39;s disease in the early post-operative period. Local field potentials are analogue filtered between 3 and 47 Hz before being passed to a data acquisition unit where they are digitally filtered again around the patient specific beta peak, rectified and smoothed to give an online reading of the beta amplitude. A threshold for beta amplitude is set heuristically, which, if crossed, passes a trigger signal to the stimulator. The stimulator then ramps up stimulation to a pre-determined clinically effective voltage over 250 msec and continues to stimulate until the beta amplitude again falls down below threshold. Stimulation continues in this manner with brief episodes of ramped DBS during periods of heightened beta power.
Clinical efficacy is assessed after a minimum period of stabilization (5 min) through the unblinded and blinded video assessment of motor function using a selection of scores from the Unified Parkinson&#39;s Rating Scale (UPDRS). Recent work has demonstrated a reduction in power consumption with aDBS as well as an improvement in clinical scores compared to conventional DBS. Chronic aDBS could now be trialed in Parkinsonism.

Controlling Parkinson&#039;s Disease With Adaptive Deep Brain Stimulation

Adaptive deep brain stimulation (aDBS) is effective for Parkinson&#8217;s disease, improving symptoms and reducing power consumption compared to conventional deep brain stimulation (cDBS). In aDBS we track a local field potential biomarker (beta oscillatory amplitude) in real time and use this to control the timing of stimulation.

Controlling Parkinson-Krankheit mit Adaptive Tiefe Hirnstimulation

Adaptive deep brain stimulation (aDBS) has the potential to improve the treatment of Parkinson&#39;s disease by optimizing stimulation in real time ...

Developing Neuroimaging Phenotypes of the Default Mode Network in PTSD: Integrating the Resting State, Working Memory, and Structural Connectivity

Complementary structural and functional neuroimaging techniques used to examine the Default Mode Network (DMN) could potentially improve assessments of psychiatric illness severity and provide added validity to the clinical diagnostic process. Recent neuroimaging research suggests that DMN processes may be disrupted in a number of stress-related psychiatric illnesses, such as posttraumatic stress disorder (PTSD).
Although specific DMN functions remain under investigation, it is generally thought to be involved in introspection and self-processing. In healthy individuals it exhibits greatest activity during periods of rest, with less activity, observed as deactivation, during cognitive tasks, e.g., working memory. This network consists of the medial prefrontal cortex, posterior cingulate cortex/precuneus, lateral parietal cortices and medial temporal regions.
Multiple functional and structural imaging approaches have been developed to study the DMN. These have unprecedented potential to further the understanding of the function and dysfunction of this network. Functional approaches, such as the evaluation of resting state connectivity and task-induced deactivation, have excellent potential to identify targeted neurocognitive and neuroaffective (functional) diagnostic markers and may indicate illness severity and prognosis with increased accuracy or specificity. Structural approaches, such as evaluation of morphometry and connectivity, may provide unique markers of etiology and long-term outcomes. Combined, functional and structural methods provide strong multimodal, complementary and synergistic approaches to develop valid DMN-based imaging phenotypes in stress-related psychiatric conditions. This protocol aims to integrate these methods to investigate DMN structure and function in PTSD, relating findings to illness severity and relevant clinical factors.

This protocol describes the complementary neuroimaging techniques of resting state structural connectivity, task-induced deactivation, and structural connectivity analyses to examine the default network in post-traumatic stress disorder. The use of synergistic methods could potentially lead to improved diagnostics and assessments of severity, outcome, and other relevant clinical factors.

Entwicklung von Neuroimaging Phänotypen des Default Mode Network in PTSD: Integration der Ruhezustand, Arbeitsgedächtnis und Struktur Connectivity

Complementary structural and functional neuroimaging techniques used to examine the Default Mode Network (DMN) could potentially improve assessments of ...

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular mechanisms responsible for the disease, and are very convenient for rapid drug screening and testing of promising therapies. A limiting factor in these studies is often the lack of efficient non-invasive methods for sequentially analyzing the anatomical and functional changes in the kidney. Magnetic resonance imaging (MRI) is the current gold standard imaging technique to follow autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) patients, providing excellent soft tissue contrast and anatomic detail and allowing Total Kidney Volume (TKV) measurements.A major advantage of MRI in rodent models of PKD is the possibility for in vivo imaging allowing for longitudinal studies that use the same animal and therefore reducing the total number of animals required. In this manuscript, we will focus on using Ultra-high field (UHF) MRI to non-invasively acquire in vivo images of rodent models for PKD. The main goal of this work is to introduce the use of MRI as a tool for in vivo phenotypical characterization and drug monitoring in rodent models for PKD.

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

The use of ultra-high field MRI as a non-invasive way to obtain phenotypic information of rodent models for polycystic kidney disease and to monitor interventions is described. Compared with the traditional histological approach, MRI images can be acquired in vivo, allowing for longitudinal follow-up.

Verwendung von Ultrahochfeld-MRT in Kleintier Modelle aus Polyzystische Nierenerkrankung für<em&gt; In Vivo</em&gt; Phänotypisierung und Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...