Die Autoren möchten die Finanzierung von NIH 3R01AI080289-02S1, und ein Harvard University Center for AIDS Research Scholar Fellowship unter NIH / NIAID 2P30AI060354-07 bestätigen.

1. Kultur Phagozytenzellen <ol><li> Kultur THP-1 Zellen 10 in RPMI 1640 mit 10% fötalem Rinderserum als stationäre Suspension in T-Kolben ergänzt. Die Zelldichte sollte unter 0.5x10 6 / mL gehalten werden, um ein einheitliches Niveau des FcyR Ausdruck und Assay-Leistung aufrecht zu erhalten. </li></ol> 2. Bereiten biotinylierten Antigen <ol><li> Berechnen Sie den Betrag von Sulfo-NHS-LC Biotin Reagenzienkit notwendig, um das Ziel-Antigen von Interesse nach den Anweisungen des Herstellers Biotinylierung. </li><li> Lösen Sie die Biotinylierungsreagenz in Wasser und sofort die berechnete Menge an Antigen in einem Puffer, der keine primären Amine. Lassen Sie die Reaktion für 1 Stunde bei Raumtemperatur ablaufen, Mischen gelegentlich. </li><li> Entfernen Sie das überschüssige, nicht konjugierte Biotin durch Puffer Austausch in einer Amicon Zentrifugalkraft Konzentration Einheit eines geeigneten Molekulargewichtsschnitt die targe behaltent-Antigen. Probe in die obere Kammer des Konzentrationslagers Einheit und fügen PBS auf das Gesamtvolumen von bis zu 15 mL füllen Einklang zu bringen. Zentrifuge bei 4000 xg, um die Lautstärke zu senken, um etwa 1,5 mls. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal löscht 99% der freien Biotin, um eine maximale Beschichtung von Antigen, um Perlen zu sichern. </li></ol> 3. Bereiten Antigen Gesättigte Beads <ol><li> Wash 100 ul 1 mm fluoreszierende Neutravidin Perlen zweimal in 1 ml 0,1% PBS-BSA nach dem Schleudern in einer Mikrozentrifuge bei hoher Geschwindigkeit. Resuspendieren gewaschenen Beads in 100 ul PBS-BSA und Aliquot in 10 Röhren. </li><li> Um zu bestimmen, Antigen-Beschichtung Bedingungen, die die Perlen zu sättigen, kombinieren 10 ul der gewaschenen Bead-Suspension mit variierenden Konzentrationen von biotinylierten Antigen in zweifacher Schritte. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf einem Rotator. </li></ol> HINWEIS: Die Sättigung der Perlen muss experimentell ermittelt werden. Dies kann erreicht werden,durch die Identifizierung Bead-Beschichtung Bedingungen, die eine maximale Ausbeute bei Phagozytose Perlen anschließend mit einer Kontrollgruppe monoklonaler Antikörper opsonierten sind. <ol start="3"><li> Entfernen ungebundenen Antigen durch Waschen mit 1 ml PBS-BSA und Zentrifuge mit hoher Geschwindigkeit, bis Kügelchen pelletiert werden. Entfernen Sie PBS-BSA und wiederholen. </li><li> Resuspendieren Antigen-beschichteten Kügelchen in einem Endvolumen von 1 ml in PBS-BSA. Beads können gespeichert werden bis zu einer Woche bei 4 ° C vor dem Gebrauch. </li></ol> 4. Bereiten Antikörper Proben <ol><li> Klinische Antikörper Proben aus dem Plasma mit einer Melone Gel IgG Reinigungskit nach Herstellerangaben gereinigt werden. Gereinigtes IgG bei 4 ° C bis zur Verwendung gelagert werden. </li></ol> HINWEIS: Das richtige Vorsichtsmaßnahmen hinsichtlich der Umgang mit menschlichen Proben müssen immer getroffen. <ol start="2"><li> Bestimmen Sie die Konzentration der gereinigten Antikörper durch Absorption bei A280 und verdünnte Proben auf 1 mg / ml in PBS. </li><li> Bereiten Sie postulierenive und negative monoklonalen Kontroll-Antikörper durch Verdünnen auf 1 mg / ml in PBS. </li></ol> 5. Plating das Experiment <ol><li> Resuspendieren gewaschen, Antigen gesättigt Beadlösung oben durch Vortexen vorbereitet und Transfer 10 ul in jede Vertiefung einer Rundboden-96-Well-Platte. Es muss darauf geachtet, ständig rühren die Bead-Suspension zu gleichen Teilen aus fluoreszierende Kügelchen zu gewährleisten sind in jede Vertiefung gegeben. </li><li> Add unterschiedlichen Konzentrationen der Antikörper von Interesse in jede Vertiefung, die Schaffung eines Dosis-Wirkungs-Kurve für jeden Antikörper. Optimale Konzentrationen zwischen den Proben in Abhängigkeit von der Titer der Antikörper vorhanden unterscheiden, aber eine Reihe von 0,01 bis 100 pg / ml Endkonzentration wird eine gute Abdeckung bieten und die Identifikation der interessierenden Konzentrationsbereich. Stellen Sie sicher, Antikörper werden in Mengen nicht größer als 20 ul aufgenommen. </li><li> Inkubieren Perlen und Antikörper-Proben für 2 Stunden bei 37 ° C, damit der Antikörper an die Beads opsonisieren. &lt;/ Li&gt; <li> Eine Suspension von THP-1 Zellen bei 2,5 x 10 5 Zellen / ml, und 200 ul dieser Suspension in jede Vertiefung, für eine Gesamtmenge von 5 x 10 4 THP-1 Zellen in jedem Well. </li><li> Inkubieren über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2, in einer stationären Inkubator, so dass Zellen und Perlen Pellets durch Schwerkraft. </li></ol> HINWEIS: Signal-Rausch kann durch die Bestimmung der optimalen Sicke verbessert werden: Antikörper: THP-1 Zellen Verhältnisse für ein bestimmtes Antigen und Antikörper Quelle. 6. Durchflusszytometrische Analyse <ol><li> Nehmen Sie 100 ul des Überstands aus jeder Vertiefung darauf achten, daß das Zellpellet zu stören. Überstand kann dann gespeichert, wenn Zytokinsekretion Bestimmungen oder anderen Analysen erwünscht sind. </li><li> Zur Fixierung wird mit 100 ul 4% Paraformaldehyd in jede Vertiefung und Pipette resuspendieren und mischen Zellen. </li><li> Hoher Durchsatz durchflusszytometrische Analyse kann unter Verwendung eines BD LSR II mit einem HTS-Reader ausgestattet werden.</li><li> Program-Software zu mischen jedes Well dreimal (100 ul Mix Volumen) und analysieren 30 mu l oder mindestens 2000 Zellen Veranstaltungen jeder Probe. </li><li> Die gesammelten Daten können in FlowJo oder gleichwertige Software analysiert werden. Nützliche Metriken sind die Prozent der Perle + oder fluoreszierende Zellen, die ein Maß für die Anzahl der Phagozytenzellen Gegenwart bietet, ebenso wie die Fluoreszenz-Intensität des Phagozytenzellen, die ein Maß für die Anzahl der phagozytiert Perlen bietet. Multipliziert man diese Werte erzeugt eine integrierte bedeuten Fluoreszenzintensität oder iMFI. </li><li> Die durchschnittliche Zahl der Kugeln von jeder Fresszellen phagozytiert können, indem die iMFI durch die mittlere Fluoreszenz von 1 Perle berechnet werden. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Es sollten klare Differenzierung von Antikörper-Proben aus betroffenen und nicht betroffenen Probanden werden. Abbildung 1A zeigt die FACS-Histogramme eines Antikörpers Probe von einem HIV negativInitiative (schwarze Kurve) und eine HIV-positive (graue Kurve) unterliegen, und zeigt die erhöhte Phagozytose durch die Anwesenheit von Antigen-spezifischen Antikörpern angetrieben. Optimale Sensitivität des Tests ist abhängig von der Sättigung der Beads mit biotinylierten Antigen. Abbildung 1B zeigt die Phagozytose beobachtet, wenn Kugeln mit unterschiedlichen Mengen an Antigen beschichtet mit 3 Kontrolle monoklonalen Antikörpern (einschließlich einer unverbindlichen Antikörper, Dreiecke) opsonierten wurden, und stellt 2μg Antigen / ul Perlen als Sättigungskonzentration für dieses Antigen. Eine Dosis-Wirkungs-Kurve ist in Abbildung 2 dargestellt und zeigt die Differenz Kapazität von Subjekt Antikörper Proben Phagozytose über einen Antikörper Konzentrationsbereich von 0,05-5 g / ml induzieren. Diese Differenz Phagozytose kann entweder durch Unterschiede in der Titer oder Fc-Domäne Eigenschaften wie IgG-Subklassen und Glykosylierung Zustand getrieben werden. Als THP-1 Zellen sind iMaged durch Fluoreszenz-Mikroskopie, gibt es eindeutige Beweise für bead Phagozytose. Abbildung 3 zeigt zwei 63x Standbilder von THP-1 Zellen nach Inkubation mit dem Antikörper opsonierten (grün) und nicht-opsonierten (red) Kugeln, was die fehlende Phagozytose in Abwesenheit des Antikörpers. Wenn Zeitraffer-Mikroskopie durchgeführt wird, ist der Antikörper-spezifische Phagozytose von fluoreszierenden Kügelchen noch auffälliger (Movie 1, 20-facher Vergrößerung). Frühere Arbeiten haben Internalisierung der Perlen mit den Zellen verbunden bestätigt, und Experimente mit primären Monozyten haben gut mit phagocytic Scores (iMFI Werte) in diesem hohen Durchsatz-Test (Daten nicht gezeigt) vereinbart. <img src="/files/ftp_upload/3588/3588fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Assay Quality Control. 1A, Durchflusszytometrie Histogramme der Phagozytose für einen Antikörper Stichprobe aus einer HIV-negativ Thema (schwarze Kurve) und eine HIV-positive Subjekt (graue Kurve).1B: Experimentelle Bestimmung der optimalen Wulstbeschichtung Bedingungen für eine Probe-Antigen. Antigen-spezifische monoklonale Antikörper (Kreis, Quadrat) zu demonstrieren maximal Phagozytose von Kügelchen, die mit&gt; 2 pg Antigen / ul von Perlen beschichtet, während ein Kontroll-Antikörper (Dreieck) zeigt keine Phagozytoseaktivität. <img src="/files/ftp_upload/3588/3588fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Phagozytose Dosis-Wirkungs-Kurve. Klinische Antikörper Proben von HIV-positiven (behandelt, unbehandelt, und Ausstellen Kontrolle der Virusreplikation in Abwesenheit von anti-retroviralen Therapie) und HIV-negativen Probanden Laufwerk Phagozytose von gp120 (HIV-Envelope) Kügelchen unterschiedlich. <img src="/files/ftp_upload/3588/3588fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Effiziente Internalisierung. Mikroskopie bestätigt die Internalisierung der Antikörper-opsonierten Perlen (grün), während die Nicht-opsonierten Perlen in sol bleibenution (63x Vergrößerung). Movie 1. Zeitraffer-Mikroskopie von Antikörper-driven Phagozytose wurde im Laufe von 14 Stunden durchgeführt und erlaubt die Visualisierung der Phagozytoseaktivität der THP-1 Zellen in der High-Throughput-Assay verwendet. Grün fluoreszierende Kügelchen sind Antikörper opsonierten bieten rot fluoreszierende Kügelchen eine negative Kontrolle. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3588/3588movie1.mov">Klicken Sie hier, um den Film zu sehen.</a>

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Der Test hier beschriebenen ermöglicht Hochdurchsatz-Analyse der Phagozytoseaktivität von klinischen Proben Antikörper durch die Verwendung einer monozytären Zelllinie lange genutzt werden, um phagocytic Prozesse 10 und Platte für automatisierte Durchflusszytometrie zu studieren. Dieser Assay ist vorteilhaft gegenüber anderen in seiner Fähigkeit, präzise zu charakterisieren Antigen-spezifischen Antikörper Teilmengen, so dass nicht nur für die Untersuchung von Unterschieden in Phagozytose durch krankheits-spezifischen Antikörpern aus verschiedenen Fächern angetrieben, sondern auch Studie mehrerer Antigenspezifitäten innerhalb der gleichen Thema. Da Antikörper Rekrutierung von angeborenen Effektor-Zellen, einschließlich Monozyten und anderen Antigen-präsentierenden Zellen einen starken Einfluss Krankheitsverlauf 11-13, und ist biologisch variabel je Antikörper Geometrie, IgG-Subklassen und Glycosylierung an Asparagine297 der Fc-Domäne 14-16, bietet diese Methode für Auswertung einer kritischen Antikörper Wirkmechanismus. Darüber hinaus, weil Antikörper-vermittelteEINZELNEN SEKTOREN Phagozytose durch bestimmte Erreger ist im Verlauf der Infektion 7,17,18 ausgenutzt, hält diesen Test Versprechen bei der Bewertung des Prozesses der Antikörper-abhängigen Verstärkung, und unterstreicht die duale Natur der Phagozytose als potenziell schützende, sowie potenziell schädliche Antikörper-Aktivität. Der beschriebene Assay genutzt werden, um Antikörper, die aus klinischen Proben von Patientengruppen zu analysieren, sondern auch der Impflinge und kann angepasst zu nutzen Serum als gereinigtes IgG werden. Darüber hinaus können Zytokinsekretion in Reaktion auf die Phagozytose aus dem Kulturüberstand analysiert werden, und der Einfluss der spezifischen FcR kann durch die Verwendung FcR-blockierende Antikörper, so dass nicht nur Unterschiede in phagocytic Potenz zu bestimmen bestimmt werden, sondern nachgeschalteten Signalwege, mit Einblick in-Mechanismus, können und helfen zu lösen und zu verfeinern Verständnis dieses Immunsystems.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> EZ-Link Micro Sulfo-NHS-LC-Biotinylierung Kit </td><td> Thermo Scientfic </td><td> 21935 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon Ultra-15 Zentrifugalfilter Einheit mit Ultracel-50-Membran </td><td> Millipore </td><td> UFC905024 </td><td> Filter-Einheit Größe kann je nach Antigen Größe variieren </td></tr><tr><td> FluoSpheres NeutrAvidin markierten Mikrosphären, 1,0 um, gelb-grün fluoreszierend (505/515) </td><td> Invitrogen </td><td> F-8776 </td><td> Hersteller produzieren dieses Produkt in verschiedenen Farben </td></tr><tr><td> Melon Gel IgG Purification Kit </td><td> Thermo </td><td> 45212 </td><td> Es sollte darauf geachtet um die Reinheit der Ab-Proben durch SDS-PAGE überprüft werden. </td></tr></tbody></table>

determining the phagocytic activity of clinical antibody samples

Antikörper-driven Phagozytose über das Engagement von Fc-Rezeptoren auf professionelle Phagozyten induziert und kann sowohl Freiraum als auch Pathologie der Krankheit beitragen. Während die Eigenschaften der variablen Domänen von Antikörpern lange gegolten haben entscheidend für in vivo-Funktion hat die Fähigkeit von Antikörpern, angeborene Immunsystem-Zellen über ihre Fc-Domänen rekrutieren zunehmend geschätzt als ein wichtiger Faktor in ihrer Wirksamkeit, sowohl in der Einstellung des rekombinanten Therapie mit monoklonalen Antikörpern, sowie im Zuge der natürlichen Infektion oder Impfung 1-3. Wichtig ist, dass trotz seiner Nomenklatur als eine konstante Domäne, wird die Antikörper-Fc-Domäne nicht konstante Funktion, und ist stark moduliert durch IgG-Subklassen (IgG1-4) und Glycosylierung an Asparagin 297 4-6. So, diese Methode zu studieren funktionelle Unterschiede von Antigen-spezifischen Antikörpern in klinischen Proben wird Korrelation der phagocytic Topf erleichternential von Antikörpern gegen Krankheitszustand, Infektanfälligkeit, Progression oder klinische Ergebnis. Darüber hinaus ist dieser Effektor-Funktion besonders wichtig im Hinblick auf den dokumentierten Fähigkeit von Antikörpern gegen Infektionen durch Erreger Zugang in die Wirtszellen via Fc-Rezeptor-driven Phagozytose 7 zu erhöhen. Darüber hinaus gibt es einige Hinweise, dass Phagozytose von Immunkomplexen können die Th1/Th2 Polarisierung der Immunantwort 8 Auswirkungen. Hier beschreiben wir einen Test entwickelt, um Unterschiede in der Antikörper-induzierte Phagozytose, die durch unterschiedliche IgG Unterklasse Glykanstruktur bei Asn297 sowie die Fähigkeit, Immunkomplexe von Antigen-spezifischen Antikörpern in einem High-Throughput-fashion Form verursacht werden können, erkennen . Zu diesem Zweck sind 1 um fluoreszierende Kügelchen mit Antigen beschichtet und dann mit klinischen Proben Antikörper inkubiert, erzeugen fluoreszierendes Antigen-spezifische Immunkomplexe. Diese Antikörperndy-opsonierten Kügelchen werden dann mit einer Monozyten-Zelllinie, die mehrere FcγRs, darunter sowohl hemmende und aktivierende inkubiert. Assay-Ausgang kann auch Phagozytoseaktivität, Zytokinsekretion und Muster der FcγRs Nutzung, und in einer standardisierten Art und Weise bestimmt, so dass dies ein sehr nützliches System für das Parsen von Differenzen in dieser Antikörper-abhängigen Effektor-Funktion in beide Infektion und Impfung vermittelte Schutz 9.

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Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Wir präsentieren Ihnen eine High-Throughput-durchflusszytometrischen Assays auf die Phagozytoseaktivität von Antigen-spezifischen Antikörpern aus klinischen Proben zu bestimmen, unter Verwendung fluoreszierender Antigen-beschichteten Beads und einer monozytären Zelllinie mehrere Fc-Rezeptoren zur Bereitstellung von Rezeptor-Nutzung und Phagozytoseaktivität Bestimmungen in einer standardisierten und reproduzierbare Weise für jedes Antigen von Interesse.

Die Bestimmung der Phagozytoseaktivität of Clinical Antikörper Proben

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

23.3K Aufrufe.  Ragon Institute of MGH, MIT, and Harvard. Wir präsentieren Ihnen eine High-Throughput-durchflusszytometrischen Assays auf die Phagozytoseaktivität von Antigen-spezifischen Antikörpern aus klinischen Proben zu bestimmen, unter Verwendung fluoreszierender Antigen-beschichteten Beads und einer monozytären Zelllinie mehrere Fc-Rezeptoren zur Bereitstellung von Rezeptor-Nutzung und Phagozytoseaktivität Bestimmungen in einer standardisierten und reproduzierbare Weise für jedes Antigen von Interesse.

Serie: Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Determining the Reactivity and Titre of Serum using a Haemagglutination Assay

Haemagglutination is a specific form of agglutination and is used when antibodies bind to red blood cells, which act as a particulate antigen. Red blood cells are particularly useful targets as they are readily available and agglutination is observable using the naked eye. This technique is commonly used to determine the titre of an antibody (Ab), for blood grouping and viral quantification. In this video, the steps involved in preparing and performing a haemagglutination assay is demonstrated using antibodies specific to blood group A-antigens added to red blood cells (Revercells). The antiserum is serially diluted in a 96 well U-bottom microtitre tray, to which is added a suspension of Revercells. The samples are mixed and then incubated at 37&deg;C for 60 minutes. After this time, the samples can then be easily scored for  ve, +ve and intermediate (-/+) haemagglutination reactions. This approach allows for the reactivity and titre of a serum sample to be assessed using a rapid and simple technique. The video will cover the theory behind the assay, how the results are read and interpreted, how the titre is determined, how the assay can be modified and any issues associated with the use of this technique.

Haemagglutination is a form of agglutination where antibodies bind to red blood cells. Red blood cells are both readily available and the results are readily observable using the naked eye. This video demonstrates the steps involved in a haemagglutination assay, interpreting the results and determining the titre.

Die Bestimmung der Reaktivität und Titre von Serum mit einem Hämagglutinations Assay

Haemagglutination is a specific form of agglutination and is used when antibodies bind to red blood cells, which act as a particulate antigen. Red blood ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Mit einem Pan-Viral Microarray-Assay (Virochip) zur klinischen Proben, die für virale Erreger Bildschirm

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated to a microbiota dominated by a number of bacterial species, including Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, and others1-3. This condition is associated with a range of negative health outcomes, including HIV acquisition4, and it can be difficult to manage clinically5. Furthermore, diagnosis of BV has relied on the use of Gram stains of vaginal swab smears that are scored on various numerical criteria6,7. While this diagnostic is simple, inexpensive, and well suited to resource-limited settings, it can suffer from problems related to subjective interpretations and it does not give a detailed profile of the composition of the vaginal microbiota8. Recent deep sequencing efforts have revealed a rich, diverse vaginal microbiota with clear differences between samples taken from individuals that are diagnosed with BV compared to those individuals that are considered normal9,10, which has resulted in the identification of a number of potential targets for molecular diagnosis of BV11,12. These studies have provided a wealth of useful information, but deep sequencing is not yet practical as a diagnostic method in a clinical setting. We have recently described a method for rapidly profiling the vaginal microbiota in a multiplex format using oligonucleotide-coupled fluorescent beads with detection on a Luminex platform13. This method, like current Gram stain-based methods, is rapid and simple but adds the additional advantage of exploiting molecular knowledge arising from sequencing studies in probe design. This method therefore provides a way to profile the major microorganisms that are present in a vaginal swab that can be used to diagnose BV with high specificity and sensitivity compared to Gram stain while providing additional information on species presence and abundance in a semi-quantitative and rapid manner. This multiplex method is expandable well beyond the range of current quantitative PCR assays for particular organisms, which is currently limited to 5 or 6 different assays in a single sample14. Importantly, the method is not limited to the detection of bacteria in vaginal swabs and can be easily adapted to rapidly profile nearly any microbial community of interest. For example, we have recently begun to apply this methodology to the development of diagnostic tools for use in wastewater treatment plants.

We describe a multiplex method for the detection of microorganisms within a sample using oligonucleotide-coupled fluorescent beads. Amplicon from all organisms within a sample is hybridized to a panel of probe-coupled beads. A Luminex or Bio-Plex instrument is used to query each bead for bead type and hybridization signal.

Multiplex Nachweis von Bakterien in komplexen Clinical and Environmental Proben mit Oligonukleotid-gekoppelten Fluoreszenz-Mikrosphären

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host cells1. These cells express a specialized receptor, called the T cell receptor (TCR), which can recognize a specific antigenic peptide bound to HLA class I molecules2. Engagement of infected cells or tumor cells through their HLA class I molecule results in production of lytic molecules such as granzymes and perforin resulting in target cell death. While it is useful to determine frequencies of antigen-specific CD8 T cells using assays such as the ELIspot or flow cytometry, it is also helpful to ascertain the strength of CD8 T cell responses using cytotoxicity assays3. The most recognizable assay for assessing cytotoxic function is the Chromium Release Assay (CRA), which is considered a standard assay 4. The CRA has several limitations, including exposure of cells to gamma radiation, lack of reproducibility, and a requirement for large numbers of cells. Over the past decade, there has been interest in adopting new strategies to overcome these limitations. Newer approaches include those that measure caspase 
release 4, BLT esterase activity 5 and surface expression of CD107 6. The impedance-based assay, using the Roche xCelligence system, was examined in the present paper for its potential as an alternative to the CRA. Impedance or opposition to an electric current occurs when adherent tumor cells bind to electrode plates. Tumor cells detach following killing and electrical impedance is reduced which can be measured by the xCelligence system. The ability to adapt the impedance-based approach to assess cell-mediated killing rests on the observation that T cells do not adhere tightly to most surfaces and do not appear to have much impact on impedance thus diminishing any concern of direct interference of the T cells with the measurement. Results show that the impedance-based assay can detect changes in the levels of antigen-specific cytotoxic CD8 T cells with increased sensitivity relative to the standard CRA. Based on these results, impedance-based approaches may be good alternatives to CRAs or other approaches that aim to measure cytotoxic CD8 T cell functionality.

The chromium release assay, a common assay for detecting cytotoxic T cell activity, has several limitations. Using antigen-specific CD8 T cells and the human breast cancer tumor line, SKBR3, in the present article, an impedance-based approach was examined for the capability of detecting cell killing.

Bestimmung der optimalen zytotoxische Aktivität der Menschenrechte Her2neu spezifischen CD8 T-Zellen durch Vergleich der Cr51 Freisetzungsassay dem xCELLigence-System

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T  cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host  cells1. These cells express ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

Speichel, Speicheldrüse, und Hämolymphe Abholung Ixodes scapularis Zecken

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols to address these questions include colony count assays, gentamicin protection assays, and electron microscopy. Colony count and gentamicin protection assays only assess the viability of the entire bacterial population and are unable to determine individual bacterial viability. Electron microscopy can be used to determine the viability of individual bacteria and provide information regarding their localization in host cells. However, bacteria often display a range of electron densities, making assessment of viability difficult. This article outlines protocols for the use of fluorescent dyes that reveal the viability of individual bacteria inside and associated with host cells. These assays were developed originally to assess survival of Neisseria gonorrhoeae in primary human neutrophils, but should be applicable to any bacterium-host cell interaction. These protocols combine membrane-permeable fluorescent dyes (SYTO9 and 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), which stain all bacteria, with membrane-impermeable fluorescent dyes (propidium iodide and SYTOX Green), which are only accessible to nonviable bacteria. Prior to eukaryotic cell permeabilization, an antibody or fluorescent reagent is added to identify extracellular bacteria. Thus these assays discriminate the viability of bacteria adherent to and inside eukaryotic cells. A protocol is also provided for using the viability dyes in combination with fluorescent antibodies to eukaryotic cell markers, in order to determine the subcellular localization of individual bacteria. The bacterial viability dyes discussed in this article are a sensitive complement and/or alternative to traditional microbiology techniques to evaluate the viability of individual bacteria and provide information regarding where bacteria survive in host cells.

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. This article outlines protocols for the use of fluorescent dyes that reveal the viability of individual bacteria inside and associated with host cells.

Fluoreszenz-Mikroskopie-Methoden zur Bestimmung der Lebensfähigkeit der Bakterien in Verbindung mit Säugerzellen

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

Skalierbare High Throughput Auswahl aus Phagen-Antikörperbibliotheken angezeigt Synthetische

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant viruses may be potentially pathogenic for many species of protists. They belong to the recently described order of Megavirales. The new lineage Faustovirus that has been isolated from sewage samples is distantly related to the mammalian pathogen African swine fever virus. This virus is also specific to its amoebal host, Vermamoeba vermiformis, a protist common in health care water systems. It is crucial to continue isolating new Faustovirus genotypes in order to enlarge its genotype collection and study its pan-genome. We developed new strategies for the isolation of additional strains by improving the use of antibiotic and antifungal combinations in order to avoid bacterial and fungal contaminations of the amoeba co-culture and favoring the virus multiplication. We also implemented a new starvation medium to maintain V. vermiformis in optimal conditions for viruses co-culture. Finally, we used flow cytometry rather than microscopic observation, which is time-consuming, to detect the cytopathogenic effect. We obtained two isolates from sewage samples, proving the efficiency of this method and thus widening the collection of Faustoviruses, to better understand their environment, host specificity and genetic content.

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.

Eine schnelle Strategie für die Isolierung neuer Faustoviruses von Umweltproben unter Verwendung von<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on the hypotonic lysis of erythrocytes and can be applied to human samples as well as to blood of non-human origin. The small initial sample volume of about 50 to 100 &#181;l makes this method applicable to recurrent blood sampling from small laboratory animals. Moreover, leukocyte enrichment is achieved within minutes and with low material efforts regarding chemicals and instrumentation, making this method applicable in multiple laboratory environments.
Standardized purification of leukocytes is combined with a highly selective staining method to evaluate halogenating peroxidase activity of the heme peroxidases, myeloperoxidase (MPO) and eosinophil peroxidase (EPO), i.e., the formation of hypochlorous and hypobromous acid (HOCl and HOBr). While MPO is strongly expressed in neutrophils, the most abundant immune cell type in human blood as well as in monocytes, the related enzyme EPO is exclusively expressed in eosinophils. The halogenating activity of these enzymes is addressed by using the almost HOCl- and HOBr-specific dye aminophenyl fluorescein (APF) and the primary peroxidase substrate hydrogen peroxide. Upon subsequent flow cytometry analysis all peroxidase-positive cells (neutrophils, monocytes, eosinophils) are distinguishable and their halogenating peroxidase activity can be quantified. Since APF staining may be combined with the application of cell surface markers, this protocol can be extended to specifically address leukocyte sub-fractions. The method is applicable to detect HOCl and HOBr production both in human and in rodent leukocytes.
Given the widely and diversely discussed immunological role of these enzymatic products in chronic inflammatory diseases, this protocol may contribute to a better understanding of the immunological relevance of leukocyte-derived heme peroxidases.

This protocol describes the quick enrichment of leukocytes from small blood samples for a subsequent specific determination of the halogenating peroxidase activity within the cells. The method can be applied to human and non-human material and may contribute to the evaluation of new inflammatory markers.

Schnelle und spezifische Bewertung der Halogenierungsagentien Peroxidaseaktivität in Leukozyten angereicherte Blutproben

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

Die Beurteilung Retinal Microglial Phagozytische Funktion<em&gt; In Vivo</em&gt; Mit einem Durchfluss-Zytometrie basierten Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...