Wir danken Alberto Severini und Vanessa Goleski um Hilfe bei der Assay-Entwicklung und kritische Kommentare zu diesem Manuskript. Diese Arbeit wurde von der Public Health Agency of Kanada und der Industrial Research Assistance Program (National Research Council in Kanada) finanziert. Zusätzliche Unterstützung wurde von der University of Saskatchewan Publication Fund erhalten.

Diese Methode wurde in der Forschung in Dumonceaux et al verwendet. J. Clin. . Microbiol 47, 4067-4077, doi: 10.1128/jcm.00112-09 (2009). Eine schematische Darstellung des gesamten Verfahrens ist in Abbildung 1 dargestellt. 1. Bead-Kopplung Dies beschreibt die Methoden zur Kopplung Oligonukleotid-Sonden für Polystyrol Luminex-Beads (siehe Tabelle 2) verwendet werden. Volumes sind etwas für die Evaluierung neuer Fängersonden probeweise angepasst; diese Bände sind in Klammern angegeben. <ol><li> Nehmen Sie 1-Ethyl-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimid HCl (EDC)-Pulver von -20 ° C Exsikkator und warm es auf Raumtemperatur. </li><li> Resuspendieren Mikrokugeln durch sonciation in einem Wasserbad Sonicator für 20 Sekunden, dann Vortexen etwa 20 Sekunden. </li><li> Transfer-400 ul (100 ul) von Mikrosphären in ein Eppendorf-Röhrchen (das entspricht 5x10 6 oder 1,2510 6 Mikrosphären). Luminex empfiehlt die Verwendung von geringer Proteinbindung Mikrozentrifugenröhrchen (zB Eppendorf Protein LoBind Röhrchen, Katalog 0030 108,094), die abgekoppelt Perlen vom Kleben an den Rohren und stören bead Erholung verhindern. Wir haben nicht gefunden, daß dieses Problem mit Standard-Polypropylen Mikrozentrifugenröhrchen, die wir verwenden in der Regel (zB VWR Katalog-Nummer 87003-298) werden. </li><li> Pellet bei 14000 xg für 1 Minute. Entfernen und den Überstand verwerfen. </li><li> Resuspendieren der Mikrosphären in 50 ul (12,5 ul) bei Raumtemperatur 0,1 M 2 - (N-Morpholino) ethansulfonsäure (MES) pH 4,5. </li><li> Bereiten Sie eine frische Lösung von EDC bei 10 mg / ml in Wasser. <ol><li> Bereiten Sie weniger als 1 ml dieser Lösung durch Wiegen 5-10 mg EDC im analytischen Maßstab, dann Zugabe von Wasser bis 10 mg / ml. </li></ol></li><li> Add 1 nmol von 5&#39;-Amino C12-modifizierte Fänger-Oligonukleotid (Tabelle 2) zu Mikrosphären und vortexen. 1 nmol ist 5 ul 200 uM OligoNukleotid. </li><li> Fügen Sie 2,5 ml frisches EDC-Lösung, um die Mikrosphären und vortexen für 5 Sekunden. </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 Minuten im Dunkeln. </li><li> Entsorgen Sie die EDC-Lösung (Schritt 1,6) und bereiten eine frische Probe von 10 mg / ml EDC in Wasser wie oben beschrieben (Schritt 1.6). </li><li> Fügen Sie weitere 2,5 ml frisches EDC-Lösung, um die Mikrosphären und Vortex für 5 Sekunden. </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 Minuten im Dunkeln. </li><li> Waschen Sie die Beads durch Zugabe von 1 ml 0,02% Tween 20. Vortex (optional für 20 Sekunden sowie beschallen), um die Perlen zu resuspendieren. </li><li> Centrifuge 14000 xg 1 Minute. Entfernen und den Überstand verwerfen. </li><li> Waschen Sie die Kugeln wieder durch Zugabe von 1 ml 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS). Vortex (optional für 20 Sekunden sowie beschallen), um die Perlen zu resuspendieren. </li><li> Centrifuge 14000 xg 1 Minute. Entfernen und den Überstand verwerfen. </li><li> Resuspendieren der Beads in 100 ul (25 ul) Tris-EDTA (TE)-Puffer [10 mM Tris-Cl pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0]. </li><li> Zählen Sie die Perlen in einer Zählkammer oder Coulter-Zähler auf die Lager-Konzentration zu bestimmen. </li><li> Bereiten Sie eine Microsphere Master Mix durch Verdünnen jede Perle, um eine Endkonzentration von 100 Perlen / ul in TE-Puffer. Pool gekoppelt Perlen entsprechend der gewünschten plex des Tests (zB für eine 10-plex-Assay-Mix 10 verschiedene gekoppelt Perlen an einer Endkonzentration von 100/μl der jede Perle). </li><li> Bewahren Sie die Microsphere Master Mix bei 4 ° C im Dunkeln. Die Mischung kann über Monate gelagert werden, wenn unter diesen Bedingungen gehalten. </li></ol> 2. Chaperonin 60 Universal-Ziel (cpn60 UT) Amplikon Produktion und Erzeugung von Einzelsträngen. <ol><li> Generieren Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Produkt für jede Probe. Fügen Sie die Phosphorothioat-und Biotin-modifizierten 5 &#39;Primer (Tabelle 1). Siehe Tabelle 3 für Volumina zu mischen und Konzentrationen. </li><li> Unmittelbar nach der PCR abgeschlossen ist, fügen Sie 2 ul (20 Einheiten) von T7 abonuclease jedem PCR-Röhrchen (die PCR-Puffer wird für die T7 Reaktion genügt). Inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur (~ 22-25 ° C) für 40 Minuten. </li><li> Am Ende dieser Inkubation add 12,5 ul 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), pH 8,0 und mischen. Dies ergibt eine Gesamtsumme von ~ 64.5μl einzelner PCR-Produkt. </li></ol> 3. Die Hybridisierung der einzelsträngigen PCR-Produkt auf Oligonukleotid-coupled Polystyrol-Kügelchen. <ol><li> Vorwärmen das Gerät bis 60 ° C bis Hybridisierungstemperatur während der Analyse zu erhalten. Biegen Sie auf der Plattform Heizer mit dem Instrument der Software und achten Sie darauf, die Messing-Heizblock, dass die PCR-Stil Platte, die die hybridisierten bead Mischung enthält passt zu verwenden. </li><li> Resuspendieren Microsphere Master Mix (Schritt 1,20) mit einer Pipette, verzichten entsprechende Menge in ein Eppendorf-Röhrchen, Kappe der Röhre, und beschallen in einem Wasserbad Sonicator für 2 Minuten. Alternativ zu gewährleisten absolute Konsistenz in bead resuspension, kann das Mikrokügelchen Master-Mix durch Vortexen und Pipettieren, dann Ultraschallbehandlung wie oben resuspendiert werden, dann Dosieren der gewünschten Menge in ein Eppendorf-Röhrchen aus Polypropylen. </li><li> Dispense 17 ul der einzelnen PCR-Produkt (Schritt 2,2) in die entsprechenden Vertiefungen einer Low-Profile-96-well PCR-Platte Schutzrohr (Tabelle 2). Add 33 ul resuspendiert, sonciated bead Mischung in jede Vertiefung. Deckel mit Silikon-Deckel (Tabelle 2) und tippen Sie vorsichtig. </li><li> Legen Sie die Platte in den Thermocycler mit einem Programm von: 95 ° C für 5 min, 60 ° C für 10 min, 60 ° C zu halten, 60 ° C für 5 min, zu beenden. Starten Sie das Programm. </li><li> Machen Sie frische Streptavidin-Phycoerythrin (SA-PE)-Lösung, Sie werden 25 ul pro Well müssen (make mehrere Brunnen extra). Machen Sie SA-PE-Lösung durch Verdünnung Lager SA-PE (1 mg / ml) 1:50 bis 20 pg / ml mit 1x Tetramethylammoniumchlorid (TMAC) Puffer (3 M TMAC, 0,1% Sarkosyl; 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 ; 4 mM EDTA, pH 8,0). </li><li> Wenn der Thermocycler die 60 ° C zu halten Schritt erhält,öffnen Sie den Deckel, entfernen Sie die Schutzhülle aus Silikon und fügen SA-PE-Lösung direkt in jede Vertiefung (nehmen Sie nicht die Platte aus dem Thermocycler). Ersetzen Sie die Silikonhülle, schließen Sie den Thermocycler Deckel und der Wiederaufnahme des Programms. </li><li> Wenn das Programm abgeschlossen ist, nehmen Sie die Platte aus und schnell zu übertragen, um die BioPlex Maschine zu lesen. Platte muss innerhalb von 10 Minuten abgelesen werden. Lesen Sie bei 60 ° C; sicherzustellen, dass die BioPlex zu dieser Temperatur wurde vorgewärmt. Seien Sie sicher, dass die Sonde Höhe eingestellt ist, die Platte verwendet, wie in der Bedienungsanleitung für das Gerät verwendet werden, beschrieben unterzubringen. </li><li> Für eine genaue Wulst und Signalerfassung, muss die Gate-Einstellungen auf dem BioPlex nach der Art der Mikrosphären verwendet eingestellt werden. BioRad Polystyrol-Kügelchen erfordern ein Tor Einstellung 4,335-10,000 während magnetische Mikrosphären eine Einstellung von 5.000-25.000 erfordern. Es besteht auch die Möglichkeit, den Teller mit dem High PMT-Einstellung, die der Reporter Gain-Wert erhöht. Dies kann increase die Intensität der unteren Signale jedoch ist es wichtig, auch eine negative Kontrolle als Hintergrund-Signal auch erhöht werden. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Eines unserer Ziele bei der Entwicklung und Umsetzung dieses Tests war es so einfach und einheitlich wie möglich zu machen. Deshalb optimiert den kritischen Nachverstärkung Schritte, einschließlich T7 Exonuklease-Behandlung Zeit und Hybridisierung Zeit, um einen Test, der in einer angemessenen Frist abgeschlossen werden kann entwickeln. Wie in Abbildung 2A gezeigt, ist T7 Behandlung des Amplikons wichtig für die Signalerzeugung, da die meisten Sonden wenig oder gar kein Signal mit kurzen oder gar keinen T7 Behandlung hatte. Das Signal stieg linear bis ca. 40 Minuten, zu welchem ​​Zeitpunkt das Signal zu erhöhen verlangsamt. Keine Verschlechterung des Signals war auch bei 2 Stunden T7 Behandlung beobachtet, was darauf hinweist, dass die Phosphorothioat Modifikation der Primer sehr wirksam bei der Verhinderung targe istt-Strang Abbau, wie beschrieben 15. Wir haben 40 Minuten für T7 Behandlung Zeit, um die Gesamt-Protokoll zu minimieren, aber es ist klar, 2A, dass T7 Behandlung kann sich über viel länger. Wir haben auch den Effekt der Hybridisierung Zeit auf Signalerzeugung (Abbildung 2B) bestimmt und festgestellt, dass 10 Minuten reichen für maximale Signal war, war da kein weiterer Anstieg der Signal auch nach 4 Stunden der Hybridisierung beobachtet. Daher wurde eine 10 Minuten Hybridisierung gewählt, erneut, um den gesamten Test zu minimieren. Mit diesen Ergebnissen im Hinterkopf, und mit schnellen DNA-Extraktion Techniken wie InstaGene (Bio-Rad), kann der gesamte Test einschließlich DNA-Extraktion, PCR, und Luminex-Analyse in 4-5 Stunden abgeschlossen sein. Auf einem Warnhinweis, kann der Grad der Aggregation der Polystyrol-Kügelchen in einem Luminex oder BioPlex ausgeführt haben einen großen Einfluss auf die Effizienz des Assays. Die BioPlex Software zeigt das Niveau der Bead-Aggregation, die der auftritt, wennmehr als eine Perle ist in der Laser-Pfad und führt zum Ausschluss des Hybridisierungssignal aus dem Aggregat erkannt. Scheinbare Bead-Aggregation kann auch durch jede Feinstaub, der nicht die richtige Größe für eine einzelne Perle verursacht werden, und kann sogar durch Luftblasen verursacht werden. In jedem dieser Ereignisse wird das Signal von der Perle Aggregat, Luftblase, oder Partikel verworfen. In den meisten Fällen finden wir, dass Bead-Aggregation ist minimal (Abbildung 3A) und dem angestrebten Niveau von 100 Zählen von Ereignissen für jede Perle ist leicht erreichbar. Gelegentlich zeigen jedoch, die Perlen einer moderaten (Abbildung 3B) oder schwerer (Abbildung 3C) Aggregationsebene. In diesen Fällen, da die meisten Daten verworfen wird, kann das Gerät Probleme haben, erreichen 100 Veranstaltungen pro Bead Art und die Ergebnisse fraglich sein kann. Die Beschallung (Schritt 3.2) soll Bead-Aggregation zu minimieren. Darüber hinaus können die Speicherung der Kügelchen als eine verdünnte Mikrosphäre Master-Mix (Schritt 1.20) zu helfen. Wir haben, dass der Ausschluss TMAC aus dem Hy bemerktdization Puffer - Zugabe zu den SA-PE Verdünnungsmittel statt (Schritt 3,5) - hilft bei der Bead-Aggregation zu minimieren. Darüber hinaus, während wir noch nicht getestet, sind die neueren magnetischen Beads sind aus Luminex oder BioRad gedacht, eine geringere Tendenz zur Aggregation anzuzeigen. Die Ergebnisse der Anwendung eines 5-plex Luminex Array Targeting G. vaginalis, A. vaginae, L. iner, L. crispatus und L. gasseri zusammen mit den entsprechenden Gram gefärbt vaginalen Abstrich Abstriche sind in Abbildung 4 dargestellt. Diese Proben wurden aus einer einzigen Person zu mehreren Zeitpunkten entnommen. Zum Zeitpunkt 0 wurde die Person mit BV basierend auf Gram-Färbung diagnostiziert (Abbildung 4A) und der Luminex Ergebnisse aus dieser gleichen Probe (Abbildung 4B) zeigen, dass der Organismen in dem Array, G. vertreten vaginalis wurde am häufigsten, während A. vaginae und L. iner waren ebenfalls positiv. Neun Tage später war das Individuum noch BV positiv und die signal für G. vaginalis habe deutlich zugenommen, während A. vaginae und L. iner noch positiv. Wichtig ist, dass nach dieser Zeit die einzelnen begann Übergang zu einer normalen Mikroflora als Gram-positive Bazillen wurden in den Abstrichen nachweisbar (Abbildung 4A), während das Signal für G. vaginalis nachgelassen und das Signal für L. iner erhöht (Abbildung 4B). Durch unsere ursprüngliche Definition von BV mit dieser Methode (Proben positiv für G. vaginalis und / oder A. vaginae wurden als positive BV) 13, wurde dieser individuellen BV positive zu allen Zeitpunkten, obwohl die Gram-Färbung nicht zu erkennen G. vaginalis in den letzten beiden Zeitpunkten. Mit dem Luminex hier beschriebenen Verfahren können Trends schnell zu Sequenzierung-basierte Methoden verglichen werden, und die Ergebnisse der Luminex-Assay in der Regel bestätigen Gramfärbung 13, während die Bereitstellung zusätzlicher Informationen auf den Organismus Identität und Fülle. <img src=&quot;/ Files/ftp_upload/3344/3344fig1.jpg&quot; alt = &quot;Bild 1&quot; /&gt; Abbildung 1. Schematische Darstellung der Luminex-Protokoll für die Bestimmung der Mikroflora Profil eines komplexen klinischen oder Umwelt-Probe. Das Protokoll beginnt mit Template-DNA, die aus der Probe von Interesse extrahiert wurde. (1) generieren PCR-Produkt von Template-DNA-Strang mit spezifischen biotinylierten, Phosphorothioat-modifizierte cpn60 UT PCR-Primer mit unmodifizierten cpn60 UT PCR-Primer (Tabelle 1) gekoppelt ist; (2) Dies erzeugt eine PCR-Produkt-Pool, die die Mikroflora mit dem Biotin- Phosphorothioat Modifikation auf einem Strang, (3) Digest die doppelsträngige PCR-Produkt mit T7 Exonuklease, die nicht abbauen können die Phosphorothioat-modifizierten Strang und erzeugt somit Einzelstrang-DNA, die am 5&#39;-Ende mit Biotin modifiziert wird, (4) Paar Polystyrol-Kügelchen auf artspezifische cpn60 UT-Sonden - jede Perle hat einen einzigartigen spektralen Adresse (angezeigt durch bead Farbe), die is erkennbar durch die Luminex oder Bio-Plex Gerät, (5) hybridisieren die einzelnen PCR-Produkt erzeugt aus der Probe von Interesse, die Sammlung von artspezifischen Oligonukleotid-gekoppelten Kügelchen, (6) Add Streptavidin-Phycoerythrin-Konjugat, das bindet das biotinylierte Einzelstrang-PCR-Produkt und dient als Indikator für die Hybridisierung; (7) Bestimmen Sie die spektrale Adresse (bead Identität) und Hybridisierung Signalintensität mit einem Luminex oder Bio-Plex Gerät. Mindestens 100 Perlen sind für jede Perle Identität gezählt und die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) der Phycoerythrin-Signal als Ausgang berichtet. Bis zu 100 verschiedene Bead-Typen können gleichzeitig ausgewertet werden, sondern ein Test, welche die Diskriminierung von drei Kügelchen Typen dargestellt. (8) Wenn die MFI PCR aus der gleichen Probe repliziert erzeugt wird, deutlich größer als die negative Kontrolle für eine bestimmte Perle (one-tailed Student t-Test, p &lt;0,05), wird die Probe als für den Organismus positiv.<html><img src="/files/ftp_upload/3344/3344fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Optimierung der Luminex-Assay-Parameter. Fünf verschiedene Sonden gezielt zu Peptostreptococcus anaerobius wurden mit Amplikons aus einer gemischten Vorlage generiert verwendet mit Plasmiden, die die geklonten cpn60 UT von 20 Bakterien bekannt, mit der Vagina in Verbindung gebracht werden, einschließlich P. anaerobius. (A). Wirkung von T7 Exonuklease-Behandlung Zeit. Die oben beschriebenen Protokoll folgte aber die Zeit der Behandlung mit T7 Exonuklease wurde vor der Hybridisierung und das mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) wurde für alle Sonden bestimmt abwechslungsreich. (B). Einfluss der Hybridisierung Zeit. Die oben beschriebenen Protokoll wurde mit einer Vielzahl von Hybridisierung Zeiten folgten. Das gleiche Sätze von Sonden wurden mit einem Amplikon aus derselben Vorlage erzeugt, wie in A und die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) für alle Sonden ermittelt wurde. &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3344/3344fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Bestimmung der Bead-Aggregation mit BioPlex Software. Drei Beispiele sind BioPlex läuft in dem das Niveau der Raupe Aggregation (A) zulässig (5%) gegeben; (B) Borderline (50%), und (C) nicht akzeptabel (80%). <img src="/files/ftp_upload/3344/3344fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Die Anwendung eines 5-plex Luminex Array BV Diagnose in sequentiellen Proben von der gleichen Person übernommen. (A). Gram-gefärbten Objektträger, welche die traditionellen Diagnose verwendet werden, um jede Probe für BV zu beurteilen. (B). Die Anwendung eines 5-plex Luminex Array vorbereitet und durchgeführt, wie in diesem Protokoll, um die gleichen vier Proben in (A) gezeigt, beschrieben. Bakterielle Ziele, deren MFI-Signal war deutlich positiv von unserer Definition (one-tailed Student t-Test, p &lt;0,05) sind mit einem Sternchen (*) gekennzeichnet.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Spezifität des Signals Generation von entscheidender Bedeutung ist, Sie müssen sicher sein, dass das Signal beobachtet reflektiert wirklich den Nachweis von Amplikon aus diesem Organismus erzeugt. Software wie PrimerPlex (Premier Biosoft) kann helfen, Sonden, die effizient hybridisieren Design, aber sie kann oder auch nicht, um Nicht-Zielarten cross-Hybridisierung. Als universelle PCR-Primer verwendet werden, wie in diesem Protokoll beschrieben, ist es wichtig zu bedenken, dass das Amplifikat generiert alle Organi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Oligonukleotid-Namen </td><td> Firma </td><td> Sequenz 1 </td></tr><tr><td> H279BP </td><td rowspan="3"> Invitrogen, IDT, oder andere </td><td> Biotin-OEFO GAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC </td></tr><tr><td> H280 </td><td> YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT </td></tr><tr><td> H1612BP </td><td> Biotin-OEFO GAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC </td></tr><tr><td> H1613 </td><td></td><td> CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT </td></tr><tr><td colspan="3"> 1O, Phosphorothioat-C, E, Phosphorothioat-G, F, Phosphorothioat-A; I, Inosin, Y, C oder T; R, A oder G, K, T oder G, S, C oder G. </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Sequenzen der Oligonucleotide für den universellen cpn60 PCR. <table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes</td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> 1-Ethyl-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimid HCl (EDC) </td><td> Durchstechen </td><td> 22980 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoreszierende Polystyrol-Kügelchen: MICROPLEX Microspheres (Luminex) oder Bio-Plex COOH Perle (Bio-Rad) </td><td> Luminex oder Bio-Rad </td><td> Bio-Rad: 171-506xxx wobei xxx entspricht der Raupe Kennung </td><td> Magnetic Beads sind immer für Oligonukleotid-Kopplung zur Verfügung und kann gewisse Vorteile bieten. Haben Sie nicht von diesen Autoren versucht worden. </td></tr><tr><td> Fänger-Oligonukleotide (5 &#39;Amino C12 modifiziert) </td><td> Invitrogen, IDT, oder andere </td><td> verschiedene </td><td> Entsalzt Reinheitsgrad ist akzeptabel. Sequenzen der Fängersonden zur Vaginaltupfer charakterisieren, sind in dem Manuskript, an dem dieses Protokoll 13 basiert zur Verfügung gestellt. </td></tr><tr><td> T7Exonuklease </td><td> New England Biolabs </td><td> M0263S </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin-R-Phycoerythrin (SA-PE) </td><td> Invitrogen </td><td> S-866 </td><td> Achten Sie darauf, hohe Reinheit SA-PE zu erhalten; diesem Katalog-Nummer wird empfohlen </td></tr><tr><td> Schutzrohr 96-Well-PCR-Platten </td><td> Fischer </td><td> CS006509 </td><td> passen in beiden 96-well Thermocycler und BioPlex Maschine </td></tr><tr><td> Schutzrohr Dichtmatte </td><td> Fischer </td><td> CS006555 </td><td> Kann wieder verwendet werden; abwaschen mit Seifenwasser, gut spülen und trocknen </td></tr><tr><td> 5M TMAC </td><td> Sigma </td><td> T3411 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Plex oder Luminex-Gerät </td><td> Bio-Rad oder Luminex </td><td> Bio-Rad: 171-000201 </td><td></td></tr><tr><td> PrimerPlex Software für Design der Sonde </td><td> Premier Biosoft </td><td> www.premierbiosoft.com </td><td> Empfohlen für Luminex-Sonde deZeichen, obwohl auch andere Software-Plattformen verwendet werden kann </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Reagenzien und Geräten. <table border="1"><tbody><tr><td> Komponente </td><td> ul / Test </td><td> μl/100 Assays </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td> 10x PCR-Puffer (Invitrogen) </td><td> 5 </td><td> 500 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> 50 mM MgCl 2 (Invitrogen) </td><td> 2,5 </td><td> 250 </td><td> 2,5 mM </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP </td><td> 1 </td><td> 100 </td><td> 0,2 mM jedes </td></tr><tr><td> H279BP, 25 uM </td><td> 0,25 </td><td> 25 </td><td> 375 nm </td></tr><tr><td> H1612BP, 25 uM </td><td> 0,75 </td><td> 75 </td><td> 125 nM </td></tr><tr><td> H280, 25 uM </td><td> 0,25 </td><td> 25 </td><td> 375 nm </td></tr><tr><td> H1613,25 uM </td><td> 0,75 </td><td> 75 </td><td> 125 nM </td></tr><tr><td> Wasser </td><td> 34 </td><td> 3400 </td><td> --- </td></tr><tr><td> Totals </td><td> 44,5 </td><td> 4450 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 3. Empfohlene Mischungen für die PCR mit modifizierten cpn60 UT Primer (Tabelle 1). Der Test ist bis zum 5 ul der Template-DNA und 0,5 ul (2,5 U) Taq DNA Polymerase (Invitrogen) gesetzt. Normalerweise großen Mengen hergestellt werden (z. B. ausreichend für 100 Tests) und bei -20 ° C.

multiplex detection of bacteria in complex clinical and environmental samples using oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres

Bakterielle Vaginose (BV) ist ein immer wiederkehrendes polymikrobiellen Syndrom, das durch einen Wechsel in die &quot;normale&quot; Mikroflora von einer Mikroflora durch eine Reihe von Bakterienarten, darunter Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae dominiert Lactobacillus-dominiert, und andere 1-3 charakterisiert ist. Dieser Zustand ist mit einer Reihe von negativen gesundheitlichen Folgen, einschließlich HIV Erwerb 4 zugeordnet, und es kann schwierig sein, klinisch 5 zu verwalten. Darüber hinaus hat Diagnose der BV über die Verwendung der Gramfärbung von vaginalen Abstrich Abstriche, die auf verschiedenen numerischen Kriterien 6,7 erzielt wird, sind verlassen. Während diese Diagnose ist einfach, kostengünstig und gut geeignet, um mit beschränkten Ressourcen, kann er von Problemen im Zusammenhang mit subjektiven Interpretationen und es gibt nicht ein detailliertes Profil der Zusammensetzung der vaginalen Mikroflora 8 leiden. Aktuelle deep sequencing Bemühungen haben eine reiche, vielfältige vaginale Mikroflora mit der geoffenbartendeutliche Unterschiede zwischen den Proben von Personen, die mit BV im Vergleich zu denjenigen Personen, die als normal 9,10 sind, die bei der Identifizierung einer Reihe von potenziellen Zielen für die molekulare Diagnostik der BV 11,12 geführt hat diagnostiziert werden übernommen. Diese Studien haben eine Fülle von nützlichen Informationen zur Verfügung gestellt, aber tief-Sequenzierung ist noch nicht praktisch wie ein diagnostisches Verfahren in einer klinischen Umgebung. Wir haben vor kurzem ein Verfahren zur schnellen Profilierung der vaginalen Mikroflora in einem Multiplex-Format Verwendung von Oligonukleotid-gekoppelte fluoreszierende Kügelchen mit Erkennung auf einem Luminex-Plattform 13 beschrieben. Diese Methode, wie aktuelle Gramfärbung-basierte Methoden, ist eine schnelle und einfache, aber fügt den zusätzlichen Vorteil der Nutzung molekularer Erkenntnisse aus der Sequenzierung Studien in Sonde Design. Diese Methode bietet daher eine Möglichkeit, die wichtigsten Mikroorganismen, die in einer vaginalen Abstrich, mit dem BV mit hoher Spezifität und Sensitivität comp diagnostizieren können, werden ProfileARED auf Gram-Färbung, während die Bereitstellung zusätzlicher Informationen über die Arten Präsenz und Fülle in einem semi-quantitative und schnelle Weise. Das Multiplex-Verfahren ist erweiterbar und über den Bereich der aktuellen quantitative PCR-Assays für bestimmte Organismen, die derzeit auf 5 oder 6 verschiedene Tests in einer einzigen Probe 14 ist begrenzt. Wichtig ist, dass das Verfahren nicht auf den Nachweis von Bakterien in Vaginaltupfer begrenzt und kann leicht angepasst werden, um schnell Profil nahezu jede mikrobielle Gemeinschaft von Interesse. Zum Beispiel haben wir vor kurzem damit begonnen, diese Methode auf die Entwicklung von Diagnose-Tools gelten für den Einsatz in Kläranlagen.

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Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Wir beschreiben ein Multiplex-Verfahren für den Nachweis von Mikroorganismen in einer Probe mit Oligonukleotid-gekoppelte fluoreszierende Kügelchen. Amplicon aus allen Organismen in einer Probe ist es, ein Gremium von Sonde-gekoppelten Beads hybridisiert. Ein Luminex oder Bio-Plex Gerät wird verwendet, um jede Perle für Perle Art und Hybridisierungssignal Abfrage.

Multiplex Nachweis von Bakterien in komplexen Clinical and Environmental Proben mit Oligonukleotid-gekoppelten Fluoreszenz-Mikrosphären

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

multiplex-detection-bacteria-complex-clinical-environmental-samples

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.1K Aufrufe.  Agriculture and Agri-Food Canada. Wir beschreiben ein Multiplex-Verfahren für den Nachweis von Mikroorganismen in einer Probe mit Oligonukleotid-gekoppelte fluoreszierende Kügelchen. Amplicon aus allen Organismen in einer Probe ist es, ein Gremium von Sonde-gekoppelten Beads hybridisiert. Ein Luminex oder Bio-Plex Gerät wird verwendet, um jede Perle für Perle Art und Hybridisierungssignal Abfrage.

Serie: Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Mit einem Pan-Viral Microarray-Assay (Virochip) zur klinischen Proben, die für virale Erreger Bildschirm

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to the best of these authors' knowledge, no method has been developed to allow for the in situ visualization of the 
bacteria in histological sections.
While bacterial localization has been determined in vivo in previous studies using plate counts 3, radiometric labeled 4, 
or bioluminescent bacteria 5, most of these studies have only been performed at the gross organ level, with one exception 6. This limitation 
is of particular concern because E. ictaluri has a complex infection cycle 1,7, and it has a variety of virulence factors 8,9. 
The complex interaction of E. ictaluri with its host is similar in many respects to Salmonella typhi 10, which is in the same taxonomic family.
Here we describe a technique allowing for the detection of bacteria using indirect immuno-histochemistry using the monoclonal Ed9 antibody described by Ainsworth et al.11.
Briefly, a blocking serum is applied to paraffin embedded histological sections to prevent non-specific biding. Then, the 
sections are incubated with the primary antibody: E. ictaluri specific monoclonal antibody Ed9. Excess antibodies are rinsed away and the FitC 
labeled secondary antibodies are added. After rinsing, the sections are mounted with a fluorescent specific mounting medium. 
This allowed for the detection of E. ictaluri in situ in histological sections of channel catfish tissues.

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish I. punctatus samples

Here we describe a procedure allowing the labeling of Edwardsiella ictaluri in situ in histological sections from channel catfish Ictalurus punctatus using indirect immunohistochemistry with monoclonal antibodies Ed9 as a primary, and fluorescent FitC labeled antibodies as a secondary. This allowed for the detection of the bacterium using fluorescent microscopy.

Verwendung von fluoreszierenden Immuno-Chemie für den Nachweis von Edwardsiella ictaluri In Kanal Wels ( I. punctatus) Proben

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to ...

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as pathology of disease. While the properties of the variable domains of antibodies have long been considered critical to in vivo function, the ability of antibodies to recruit innate immune cells via their Fc domains has become increasingly appreciated as a major factor in their efficacy, both in the setting of recombinant monoclonal antibody therapy, as well as in the course of natural infection or vaccination1-3.
Importantly, despite its nomenclature as a constant domain, the antibody Fc domain does not have constant function, and is strongly modulated by IgG subclass (IgG1-4) and glycosylation at Asparagine 2974-6. Thus, this method to study functional differences of antigen-specific antibodies in clinical samples will facilitate correlation of the phagocytic potential of antibodies to disease state, susceptibility to infection, progression, or clinical outcome.
Furthermore, this effector function is particularly important in light of the documented ability of antibodies to enhance infection by providing pathogens access into host cells via Fc receptor-driven phagocytosis7. Additionally, there is some evidence that phagocytic uptake of immune complexes can impact the Th1/Th2 polarization of the immune response8.
Here, we describe an assay designed to detect differences in antibody-induced phagocytosis, which may be caused by differential IgG subclass, glycan structure at Asn297, as well as the ability to form immune complexes of antigen-specific antibodies in a high-throughput fashion. To this end, 1 &mu;m fluorescent beads are coated with antigen, then incubated with clinical antibody samples, generating fluorescent antigen specific immune complexes. These antibody-opsonized beads are then incubated with a monocytic cell line expressing multiple Fc&gamma;Rs, including both inhibitory and activating. Assay output can include phagocytic activity, cytokine secretion, and patterns of Fc&gamma;Rs usage, and are determined in a standardized manner, making this a highly useful system for parsing differences in this antibody-dependent effector function in both infection and vaccine-mediated protection9.

We present a high-throughput flow cytometric assay to determine the phagocytic activity of antigen-specific antibodies from clinical samples, utilizing fluorescent antigen-coated beads and a monocytic cell line expressing multiple Fc receptors&#x2014;providing receptor usage and phagocytic activity determinations in a standardized and reproducible fashion for any antigen of interest.

Die Bestimmung der Phagozytoseaktivität of Clinical Antikörper Proben

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses each and every year. Prevention of such outbreaks and minimization of the impact of an ongoing epidemic place an ever-increasing demand for analytical methods that can accurately identify culprit pathogens at the earliest stage. Although there is a large array of effective methods for pathogen detection, none of them can satisfy all the following five premier requirements embodied for an ideal detection method: high specificity (detecting only the bacterium of interest), high sensitivity (capable of detecting as low as a single live bacterial cell), short time-to-results (minutes to hours), great operational simplicity (no need for lengthy sampling procedures and the use of specialized equipment), and cost effectiveness. For example, classical microbiological methods are highly specific but require a long time (days to weeks) to acquire a definitive result.1 PCR- and antibody-based techniques offer shorter waiting times (hours to days), but they require the use of expensive reagents and/or sophisticated equipment.2-4 Consequently, there is still a great demand for scientific research towards developing innovative bacterial detection methods that offer improved characteristics in one or more of the aforementioned requirements. Our laboratory is interested in examining the potential of DNAzymes as a novel class of molecular probes for biosensing applications including bacterial detection.5
DNAzymes (also known as deoxyribozymes or DNA enzymes) are man-made single-stranded DNA molecules with the capability of catalyzing chemical reactions.6-8 These molecules can be isolated from a vast random-sequence DNA pool (which contains as many as 1016 individual sequences) by a process known as "in vitro selection" or "SELEX" (systematic evolution of ligands by exponential enrichment).9-16 These special DNA molecules have been widely examined in recent years as molecular tools for biosensing applications.6-8
Our laboratory has established in vitro selection procedures for isolating RNA-cleaving fluorescent DNAzymes (RFDs; Fig. 1) and investigated the use of RFDs as analytical tools.17-29 RFDs catalyze the cleavage of a DNA-RNA chimeric substrate at a single ribonucleotide junction (R) that is flanked by a fluorophore (F) and a quencher (Q). The close proximity of F and Q renders the uncleaved substrate minimal fluorescence. However, the cleavage event leads to the separation of F and Q, which is accompanied by significant increase of fluorescence intensity.
More recently, we developed a method of isolating RFDs for bacterial detection.5 These special RFDs were isolated to "light up" in the presence of the crude extracellular mixture (CEM) left behind by a specific type of bacteria in their environment or in the media they are cultured (Fig. 1). The use of crude mixture circumvents the tedious process of purifying and identifying a suitable target from the microbe of interest for biosensor development (which could take months or years to complete). The use of extracellular targets means the assaying procedure is simple because there is no need for steps to obtain intracellular targets.
Using the above approach, we derived an RFD that cleaves its substrate (FS1; Fig. 2A) only in the presence of the CEM produced by E. coli (CEM-EC).5 This E. coli-sensing RFD, named RFD-EC1 (Fig. 2A), was found to be strictly responsive to CEM-EC but nonresponsive to CEMs from a host of other bacteria (Fig. 3).
Here we present the key experimental procedures for setting up E. coli detection assays using RFD-EC1 and representative results.

We have recently reported a novel approach for generating fluorogenic DNAzyme probes that can be applied to set up a simple, "mix-and-read" fluorescent assay for bacterial detection. These special DNA probes catalyze the cleavage of a chromophore-modified DNA-RNA chimeric substrate in the presence of crude extracellular mixture (CEM) produced by a specific bacterium, thereby translating bacterial detection into fluorescence signal generation. In this report we will describe key experimental procedures where a specific DNAzyme probe denoted "RFD-EC1" is employed for the detection of the model bacterium, Escherichia coli (E. coli).

Nachweis von Bakterien mit fluorogenen DNAzyme

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

Schnelle Identifizierung von Gram-negativen Bakterien aus Blutkulturbrühe unter Verwendung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-&#945; (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler&#8217;s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the &#8216;Z&#8217; serial images.

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

The protocol to detect self-reactive CD4 T cells in brain and heart by direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers has been described in this report. For comprehensive analysis, a reliable method to enumerate the frequencies of antigen-specific CD4+ T cells in situ is also devised.

In-situ-Nachweis autoreaktiver CD4-T-Zellen in Gehirn und Herz Mit Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

In-situ-Nachweis von Bakterien in Paraffin eingebetteten Geweben Unter Verwendung eines Digoxin-markierte DNA-Sonde Targeting 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant viruses may be potentially pathogenic for many species of protists. They belong to the recently described order of Megavirales. The new lineage Faustovirus that has been isolated from sewage samples is distantly related to the mammalian pathogen African swine fever virus. This virus is also specific to its amoebal host, Vermamoeba vermiformis, a protist common in health care water systems. It is crucial to continue isolating new Faustovirus genotypes in order to enlarge its genotype collection and study its pan-genome. We developed new strategies for the isolation of additional strains by improving the use of antibiotic and antifungal combinations in order to avoid bacterial and fungal contaminations of the amoeba co-culture and favoring the virus multiplication. We also implemented a new starvation medium to maintain V. vermiformis in optimal conditions for viruses co-culture. Finally, we used flow cytometry rather than microscopic observation, which is time-consuming, to detect the cytopathogenic effect. We obtained two isolates from sewage samples, proving the efficiency of this method and thus widening the collection of Faustoviruses, to better understand their environment, host specificity and genetic content.

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.

Eine schnelle Strategie für die Isolierung neuer Faustoviruses von Umweltproben unter Verwendung von<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and infections using cost effective, high-throughput approaches would be indispensable. This manuscript describes the development and analysis of a bead-based multiplex immunoassay capable of measuring the presence of antibodies in human saliva to multiple pathogens simultaneously. Saliva is particularly attractive in this application because it is noninvasive, cheaper and easier to collect than serum. Antigens from environmental pathogens were coupled to carboxylated microspheres (beads) and used to measure antibodies in very small volumes of human saliva samples using a bead-based, solution-phase assay. Beads were coupled with antigens from Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, noroviruses (G I.1 and G II.4) and hepatitis A virus. To ensure that the antigens were sufficiently coupled to the beads, coupling was confirmed using species-specific, animal-derived primary capture antibodies, followed by incubation with biotinylated anti-species secondary detection antibodies and streptavidin-R-phycoerythrin reporter (SAPE). As a control to measure non-specific binding, one bead set was treated identically to the others except it was not coupled to any antigen. The antigen-coupled and control beads were then incubated with prospectively-collected human saliva samples, measured on a high throughput analyzer based on the principles of flow cytometry, and the presence of antibodies to each antigen was measured in Median Fluorescence Intensity units (MFI). This multiplex immunoassay has a number of advantages, including more data with less sample; reduced costs and labor; and the ability to customize the assay to many targets of interest. Results indicate that the salivary multiplex immunoassay may be capable of identifying previous exposures and infections, which can be especially useful in surveillance studies involving large human populations.

In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.

eine Speichel- Antikörper Multiplex-Immunoassay Entwicklung der Humanexposition Umwelt Pathogens zu messen

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global prevalence and severity of this disease, V. cholerae has been extensively studied in both environmental and laboratory settings, requiring proper maintenance and culturing techniques. Classical and El Tor are two main biotypes that compose the V. cholerae O1 serogroup, each displaying unique genotypic and phenotypic characteristics that provide reliable mechanisms for biotype characterization, and require distinct virulence inducing culturing conditions. Regardless of the biotype of the causative strain for any given infection or outbreak, the standard treatment for the disease involves rehydration therapy supplemented with a regimen of antibiotics. However, biotype classification may be necessary for laboratory studies and may have broader impacts in the biomedical field. In the early 2000&#39;s clinical isolates were identified which exhibit genotypic and phenotypic traits from both classical and El Tor biotypes. The newly identified hybrids, termed El Tor variants, have caused clinical and environmental isolate biotype identification to become more complex than previous traditional single assay identification protocols. In addition to describing V. cholerae general maintenance and culturing techniques, this manuscript describes a series of gene specific (ctxB and tcpA) PCR-based genetic screens and phenotypic assays (polymyxin B resistance, citrate metabolism, proteolytic activity, hemolytic activity, motility, and glucose metabolism via Voges-Proskauer assay) collectively used to characterize and/or distinguish between classical and El Tor biotypes. Together, these assays provide an efficient systematic approach to be used as an alternative, or in addition, to costly, labor-intensive experiments in the characterization of V. cholerae clinical (and environmental) isolates.

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

This manuscript describes proper Vibrio cholerae maintenance techniques in addition to a series of biochemical assays, collectively utilized for quick and reliable differentiation between clinical and environmental V. cholerae biotypes in a laboratory setting.