Wir danken Asya Smirnov und Laura Gonyar für das kritische Lesen des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse NIH R00 und R01 TW008042 AI097312 zu AKCMBJ wurde zum Teil durch NIH T32 AI007046 getragen wird.

1. Beurteilung der Lebensfähigkeit der Bakterien mit Propidiumiodid und SYTO9 <ol><li> Infect adhärenten Zellen, die bis 12 mm Durchmesser kreisförmigen Deckgläsern in 24-Well-Platten mit Bakterien von Interesse sind. Beheben Sie NICHT die Zellen mit Aldehyden oder organischen Lösungsmitteln. </li><li> Spülen Zellen einmal vorsichtig in 0,1 M 3 - (N-Morpholino) propansulfonsäure (MOPS), pH 7,2, enthaltend 1 mM MgCl 2 (MOPS / MgCl 2). </li><li> Zellen, Inkubation für 10 min im Dunkeln bei Raumtemperatur mit Alexa Fluor 647-gekoppelten Antikörper oder Lectin, der den Bakterienspezies von Interesse bindet, in MOPS / MgCl 2, externe Bakterien detektieren. </li></ol> HINWEIS: Verhaltens steuert mit lebenden und toten Bakterien, in der Abwesenheit von Wirtszellen, um zu zeigen, dass das Lektin oder Antikörper von Interesse bindet alle Bakterien unabhängig von der Rentabilität (Abbildung 1). <ol start="4"><li> Spülen Zellen zweimal mit MOPS / MgCl 2. </li><li> Saugen medien aus Zellen und 0,5 ml Live / Dead-Färbung Lösung. Live / Dead-Färbung Solution ist 5 uM SYTO9, 30 uM Propidiumiodid und 0,1% Saponin (Endkonzentrationen) in MOPS / MgCl 2. </li><li> Zellen, Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Spülen Zellen zwei Mal in MOPS / MgCl 2. </li><li> Invert Deckseite nach unten auf Glasobjektträger und Dichtung mit klarem Nagellack. Verwenden Sie keine Montage Medien. </li><li> Erwerben Sie Bilder innerhalb von 30 min, mit einem Fluoreszenzmikroskop mit Filtersätze mit grünen, roten und dunkelroten Bildaufnahme kompatibel. </li></ol> HINWEIS: In der herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie und konfokaler Laserscanning-Mikroskopie verwendet werden. Nach 30 min die Fluoreszenzfarbstoffe beginnen, von den Bakterien austreten und die erfassten Daten nicht mehr genau. Bilder in diesem Artikel gezeigt wurden auf einem Nikon Eclipse-E800 aufrecht Fluoreszenzmikroskop mit Hamamatsu Orca-ER Digitalkamera mit Openlab Software erworben. 650 nm und einem Emissionsfilter von 663 - - Fluoreszenz von Alexa Fluor 647 wurde unter Verwendung eines Filters mit Anregungswellenlängen von 590 735 nm detektiert, und Falschfarben blau. 580 nm und einem Emissionsfilter von 600 - - 660 nm Fluoreszenz von Propidiumjodid wurde unter Verwendung eines Filters mit Anregungswellenlänge von 540 festgestellt. 495 nm und einem Emissionsfilter von 515 - - 555 nm Fluoreszenz von SYTO9 wurde unter Verwendung eines Filters mit Anregungswellenlänge von 465 festgestellt. <ol start="10"><li> Dieses Protokoll wird in dem externe Bilder nicht lebensfähigen Bakterien blau + rot erscheinen führen, nicht lebensfähigen Bakterien interne erscheinen nur rot, erscheinen externen lebensfähigen Bakterien blau + grün, und die interne lebensfähigen Bakterien erscheinen nur grün. Graf von Augen die Zahl der Bakterien, die nicht lebensfähig externe, interne nicht lebensfähig, lebensfähige externe und interne lebensfähig sind. </li><li> Die prozentuale externer lebensfähigen Bakterien, indem die Anzahl von externen lebensfähigen Bakterien durch die Gesamtzahl der externen Bakterien (lebensfähigen und nonviLage). Berechnet den Prozentsatz der lebensfähigen Bakterien von internen Teilen der Anzahl der internen lebensfähigen Bakterien durch die Gesamtzahl der inneren Bakterien (lebensfähigen und nicht lebensfähigen) (Abb. 4). </li><li> Es gibt zwei wesentliche Steuerelemente mit diesem Protokoll durchzuführen. Zuerst überprüfen, dass alle nicht lebensfähigen Bakterien sind Propidiumiodid-positiven und alle lebenden Bakterien sind SYTO9-positiv. Ein mittleren logarithmischen Bakterienkultur (in Abwesenheit von irgendeinem Wirtszellen) zu&gt; 95% SYTO9-positiv sein. In Abbildung 2 ist ein mittel logarithmischen Kultur von N. gonorrhoeae (bei ​​10 8 koloniebildenden Einheiten pro ml) mit Live / Dead Färbelösung inkubiert. Zweitens bestätigen, dass sowohl Propidiumiodid und SYTO9 können permeabilisiert, infizierten Wirtszellen zu gelangen. <ol><li> Um eine Bevölkerung von toten Bakterien zu erzeugen, sammeln 2 x 10 8 Bakterien-Kolonien bildenden Einheiten in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, fügen Sie 70% Isopropanol und sitzen für 10 min. Pellet die Bakterien in einem Mikrofuge einnd waschen die Bakterien zweimal in PBS, um restliche Isopropanol entfernen. Dann folgen die Schritte Protokoll 1,5-1,7. Werden 5 ul Bakteriensuspension auf einen Objektträger und Overlay mit einem Deckglas. Bild Proben wie in Schritt-Protokoll 1.9. Unter diesen Bedingungen sollte 100% der Bevölkerung Propidiumiodid-positiven (Abbildung 2). In einigen Bakterienarten können Propidiumiodid nicht vollständig überwältigen SYTO9 Färbung, und nicht lebensfähigen Bakterien erscheinen gelb oder orange. </li><li> Für phagozytischen Zellen wie Neutrophile, setzen die Zellen zu Isopropanol abgetötete Bakterien und sicherzustellen, dass 100% der intrazellulären Bakterien Propidiumiodid-positiven (Abbildung 3). Für nonphagocytic Zellen, die toten Bakterien nicht verinnerlichen kann, kann es ausreichen, infizierten Zellen mit Natriumazid oder anderen zell permeant antimikrobielle Mittel vor dem Hinzufügen von Live / Dead-Färbung Lösung zu behandeln. </li></ol></li></ol> 2. Beurteilung der Lebensfähigkeit der Bakterien mit SYTOX Green und DAPI <ol><li> Etikett Bakterien von Interesse mit 10 &amp;mgr; g / ml DAPI in Morse definiertem Medium 25 für 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Zellen infizieren, die haft bis 12 mm runde Glasdeckgläschen in 24-Well-Platten mit DAPI-markierten Bakterien sind. Beheben Sie NICHT die Zellen mit Aldehyden oder organischen Lösungsmitteln. </li><li> Zellen spülen einmal mit MOPS / MgCl 2. </li><li> Zellen für 10 min Inkubieren bei Raumtemperatur im Dunkeln mit Alexa Fluor 647-gekoppelten Antikörper oder Lectin, der den Bakterienspezies von Interesse bindet, in MOPS / MgCl 2, externe Bakterien detektieren. Siehe Hinweis im Protokoll 1.3 für Schritt vorgeschlagen Kontrollen. </li><li> Saugen Medien aus Zellen und 0,5 ml 0,4 uM SYTOX Green in MOPS / MgCl 2. </li><li> Zellen, Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Spülen Zellen zwei Mal in MOPS / MgCl 2. </li><li> Waschen der Zellen einmal in MOPS / MgCl 2 für 5 min. </li><li&gt; Bilder innerhalb von 30 Minuten mit einem Fluoreszenzmikroskop erhalten. Siehe Protokoll 1.9 für Schritt Beschreibung Mikroskop, Digitalkamera und Erfassungssoftware. </li></ol> HINWEIS: Die Fluoreszenz von Alexa Fluor 647 wurde unter Verwendung eines Filters mit Anregungswellenlänge von 590 detektiert - 650 nm und einem Emissionsfilter von 663 bis 735 nm, und falsch-rot gefärbt. 495 nm und einem Emissionsfilter von 515 - - 555 nm Fluoreszenz von SYTOX Grün wurde unter Verwendung eines Filters mit Anregungswellenlänge von 465 festgestellt. 375 nm-Sperrfilter von 400 nm - DAPI-Fluoreszenz wurde unter Verwendung eines Filters mit Anregungswellenlänge von 355 festgestellt. <ol start="10"><li> Grün + blau Dieses Protokoll wird in dem externe Bilder nicht lebensfähigen Bakterien erscheinen rot + grün führen, erscheinen nicht lebensfähigen Bakterien interne, externe lebensfähigen Bakterien erscheinen rot + blau, und die interne lebensfähigen Bakterien blau erscheinen nur (Abbildung 4). Quantifizierung der Prozent der externen und internen Bakterien als in der Protokoll-ste beschrieben1.11 p. </li><li> Die in Protokollschritt 1.12 Kontrollen sollten mit der DAPI / SYTOX Green-Farbstoff-Kombination (Abbildungen 2 und 3) durchgeführt werden. </li></ol> 3. Beurteilung der Lebensfähigkeit der Bakterien Neben subzelluläre Lokalisierung <ol><li> Etikett Bakterien von Interesse mit 10 &amp;mgr; g / ml DAPI in Morse definiertem Medium für 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Zellen infizieren, die haft bis 12 mm runde Glasdeckgläschen in 24-Well-Platten mit DAPI-markierten Bakterien sind. Beheben Sie NICHT die Zellen mit Aldehyden oder organischen Lösungsmitteln. </li><li> Zellen spülen einmal mit MOPS / MgCl 2. </li><li> Inkubieren 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln mit Alexa Fluor 647-gekoppelten Antikörper oder Lectin, der den Bakterienspezies von Interesse bindet, in MOPS / MgCl 2, externe Bakterien detektieren. Siehe Hinweis im Protokoll 1.3 für Schritt vorgeschlagen Kontrollen. </li><li> Saugen Medien aus Zellen und Zellen spülen zwei times in MOPS / MgCl 2. </li><li> Inkubieren Zellen mit Alexa Fluor 555-gekoppelten Antikörper gegen subzellulären Marker von Interesse für 20 min in MOPS / MgCl 2, enthaltend 0,2% Saponin. </li><li> Spülen Zellen zwei Mal in MOPS / MgCl 2. </li><li> Waschen der Zellen einmal in MOPS / MgCl 2 für 5 min. </li><li> Saugen Medien aus Zellen und fügen 0,4 uM SYTOX Green in MOPS / MgCl 2. </li><li> Inkubiere Zellen 5 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Spülen Zellen zwei Mal in MOPS / MgCl 2. </li><li> Waschen der Zellen einmal in MOPS / MgCl 2 für 5 min. </li><li> Erwerben Sie Bilder von Folien innerhalb von 30 min auf Fluoreszenzmikroskop. Siehe Protokoll 1.9 für Schritt Beschreibung Mikroskop, Digitalkamera und Erfassungssoftware. </li></ol> HINWEIS: Die Fluoreszenz von Alexa Fluor 647 wurde mit einem Filter mit Anregungswellenlänge von 590 festgestellt - 650 nm und Emissionsfilter von 663 bis 735 nm und ist falsch-violett gefärbt. Fluoreszenz-f580 nm und einem Emissionsfilter von 600 - - 660 nm ROM Alexa Fluor 555 wurde unter Verwendung eines Filters mit Anregungswellenlänge von 540 festgestellt. 495 nm und einem Emissionsfilter von 515 - - 555 nm Fluoreszenz von SYTOX Grün wurde unter Verwendung eines Filters mit Anregungswellenlänge von 465 festgestellt. 375 nm-Sperrfilter von 400 nm - DAPI-Fluoreszenz wurde unter Verwendung eines Filters mit Anregungswellenlänge von 355 festgestellt. <ol start="14"><li> Grün + blau Dieses Protokoll wird in dem externe Bilder nicht lebensfähigen Bakterien lila + grün erscheinen führen, erscheinen nicht lebensfähigen Bakterien internen, lila + blau erscheinen externen lebensfähigen Bakterien scheinen interne lebensfähigen Bakterien nur blau und subzellulärer Protein scheint rot (Abbildung 4). Quantifizierung der perecent von externen und internen lebensfähigen Bakterien wie in Protokoll beschriebenen Schritte 1.11. </li><li> Die in Protokollschritt 1.12 Kontrollen sollten mit der DAPI / SYTOX Green-Farbstoff-Kombination (Abbildungen 2 und 3) durchgeführt werden. </li><li> InNeben den lebensfähigen und nicht lebensfähigen Zählung Bakterien, klassifizieren jeweils Bakterien als positiv oder negativ für die Co-Lokalisation mit subzellulärer Marker von Interesse. </li><li> Berechnet den Prozentsatz der lebensfähigen Bakterien, die mit subzellulären Marker durch Dividieren der Anzahl der lebensfähigen Bakterien kolokalisiert durch die Gesamtzahl der lebensfähigen Bakterien kolokalisiert. Berechnet den Prozentsatz der nicht lebensfähigen Bakterien, die mit subzellulären Marker indem die Anzahl lebensfähiger Bakterien kolokalisiert durch die Gesamtzahl lebensfähiger Bakterien kolokalisiert. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Präsentiert hier sind zwei Protokolle, die DNA-Bindung und Lebensfähigkeit Farbstoffe in Verbindung mit einem fluoreszierenden Lektin zu lebenden und toten Bakterien und menschlichen Zellen im Inneren angebracht identifizieren zu verwenden. Da beide Protokolle effektiv live aus toten Bakterien zu unterscheiden, deren Wahl-Protokoll zu verwenden, hängt von dem Ziel des Experiments. Das erste Protokoll verwendet Propidiumiodid zu nicht lebensfähigen Bakterien und SYTO9 intakte Nachweis von Bakterien zu erkennen. In <s...

Es ist eine dynamische Interaktion und Ko-Evolution zwischen Bakterien und den Gastgebern in dem sie wohnen. Bakterien haben die Einhaltung Organellen, die Sekretion Systeme und / oder die Fähigkeit, Giftstoffe, die ihre produktiven Infektion von Wirts phagocytic und nicht-Fresszellen aktivieren produzieren entwickelt. Die Bakterien müssen auch Erkennung und antimikrobiellen Aktivitäten von dem Immunsystem des Wirts zu kämpfen. Das Immunsystem des Wirts wird der angeborenen und erworbenen Komponenten einschließlich der physikalischen und chemischen Barrieren, Immunzellen, die das Komplementsystem und andere Komponenten, der humoralen Immunität besteht. Während viele Bakterien sind empfindlich gegen Tötung und der Freigabe durch Reaktion der mehrschichtigen Immun haben einige pathogene und opportunistische Bakterien Mechanismen, die eine Vielzahl von Wirtszellen zu infizieren und zu untergraben Freigabe durch die Wirtsimmunantwort 1 entwickelt. Neisseria gonorrhoeae ist ein Beispiel für ein bakterielles Pathogen dass ist sehr geeignet ist, in seiner menschlichen Wirt. N bestehen. gonorrhoeae kolonisiert leicht luminalen Oberflächen der Schleimhaut-Epithelzellen des Urogenitaltrakts, des Rachens, der Bindehaut und Rektum. Colonization löst die reichlich Rekrutierung von Neutrophilen bei Schleimhautstellen. Neutrophile Granulozyten sind professionelle Phagozyten, die eine Vielzahl von antimikrobiellen Prozesse zur Abtötung von Mikroorganismen besitzen, aber N. gonorrhoeae ist in der Lage zu überleben, in der Gegenwart von Neutrophilen 2-5. Verstehen, wie bakterielle Erreger wie N. gonorrhoeae zu untergraben, zu unterdrücken, und die Entführung der Immunantwort, um letztlich in der Regel feindlichen Host-Umgebungen zu überleben, ist entscheidend für die Entwicklung neuer Therapien zur Bekämpfung von Infektionskrankheiten. Versuchsprotokollen häufig verwendet, um bakterielle Überleben in Wirtszellen zu untersuchen sind Koloniezahl-Assays, Gentamicin-Schutztests und Elektronenmikroskopie. Koloniezahl in Assays wird eine Population von infizierten Zellen lysiert (z. B. mit einem Detergens whICH die Bakterien resistent sind), um die Bakterien zu befreien. Die Lysate werden verdünnt und auf Agar-basierten Medien ausplattiert und koloniebildende Einheiten in den Lysaten werden für jeden Zeitpunkt und / oder experimentellen Bedingungen aufgeführt. Dieser Ansatz berichtet die Lebensfähigkeit der gesamten Bakterienpopulation, ist aber nicht in der Lage, die Unterscheidung zwischen intra-und extrazelluläre Überleben. Eine Variation der Koloniezahl-Assay, der Gentamicin-Schutz-Assay misst speziell intrazelluläre Überleben der Bakterien, basierend auf der Unfähigkeit der Antibiotika Gentamicin, die eukaryotische Zellmembran 6 kreuzen. Allerdings ist dieser Test von den Bakterien empfänglich für die Tötung von Gentamicin (oder einem anderen Antibiotikum, das ähnlich eukaryotischen Membran impermeant ist) und die Unfähigkeit des Antibiotikums, um den Zugriff auf interne Bakterien. Daher kann ein Gentamicin-Schutz-Assay nicht effektiv zur Prüfung aller Bakterienarten oder bei der Prüfung überlebenden Bakterien in hochpinocytic Zellen wie Neutrophilen. Keiner dieser Ansätze zeigt die subzelluläre Lokalisation oder andere Verhalten einzelner Bakterien (z. B. wenn die Bakterien bilden Aggregate oder Mikrokolonien, die unterschiedlich von einzelnen Bakterienzellen verhalten). Eine andere häufig verwendete Ansatz, um die Lebensfähigkeit der einzelnen internen und externen Bakterien zu untersuchen ist dünn Schnitt Transmissionselektronenmikroskopie (TEM). Diese Vorgehensweise ist, dass sie Informationen über die Lage der Bakterien in Wirtszellen (zB Phagosom, Zytoplasma, Autophagosom), die durch Immunelektronenmikroskopie mit Gold-gekoppelten Antikörper gegen subzellulärer Marker untersucht werden kann vorteilhaft. Allerdings ist die Elektronenmikroskopie nicht besonders bei der Beurteilung der Lebensfähigkeit der Bakterien empfindlich. Wenn eingebetteten Abschnitte mit Uranylacetat, Bleicitrat oder andere elektronendichte Reagenzien gefärbt und mittels Elektronenmikroskopie abgebildet sind elektronendichte Bakterien lebensfähig und als elektrotron-Lucent nicht lebensfähigen 7,8. Überschätzt jedoch diese Annahme Lebensfähigkeit der Bakterien, da nur jene toten Bakterien mit schwer gestört Membranen und frei von Zytoplasma elektronenleuchtenden angezeigt. Darüber hinaus können einige Bakterienarten eine Reihe von Elektronendichten in Abhängigkeit von ihrer Wachstumsphase anzuzeigen, was es schwierig macht, um die Lebensfähigkeit zu bestimmen. Als Alternative oder zusätzlich zu diesen verbreiteten Methoden hier stellen wir Protokolle und Gründe für die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen, die Lebensfähigkeit der Bakterien zeigen, um das Überleben von Bakterien, die an und von Wirtszellen internalisiert zu beurteilen. Extrazelluläre Bakterien zu identifizieren, werden infizierte Zellen zuerst mit einem fluoreszierenden Reagenz, wie ein Lectin oder Bakterien-spezifischen Antikörper ausgesetzt. Die infizierten Zellen werden dann permeabilisiert und DNA-spezifische Farbstoffe, die differentiell zugänglich Bakterien mit intakten Membranen gegen abgebaut, als Ersatz für die Lebensfähigkeit von Bakterien ausgesetzt sind. In der ersten protocol, identifiziert die durchlässige Membran Farbstoff SYTO9 die Gesamtbakterienpopulation, während Propidiumiodid ist nur für jene Bakterien, die Membranen beeinträchtigt haben, und werden daher als nicht lebensfähig. Propidiumiodid und SYTO9 verwendet worden, um die Lebensfähigkeit der Bakterien in Biofilmen zu bewerten, zu unterscheiden von nicht-pathogenen pathogenen Bakterien und aufzählen tragfähige Wasser übertragene Bakterien 9-12. In der zweiten Protokoll, 4 &#39;, 6&#39;-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) identifiziert Gesamt Bakterien, während SYTOX Grün ist nur für den nicht lebensfähigen Bevölkerung. Die Lebensfähigkeit Farbstoffpaare können mit Immunfluoreszenz an Position jedes Bakterium im Vergleich zu einem Protein von Interesse beispielsweise um Bakterien subzelluläre Lokalisierung definieren bestimmen, kombiniert werden. Die Verwendung dieser Assays bietet wichtige Einblicke in die Interaktionen, die in Bakterienabtötung oder Überleben während der Infektion der Wirtszellen führen. Die in diesem Artikel beschriebenen Protokolle wurden verwendet, um die Lebensfähigkeit der BeurteilungN. gonorrhoeae, die innerhalb und primären humanen neutrophilen Granulozyten, auch in verschiedenen Populationen von neutrophilen Phagosomen 5,13,14 angebracht ist. Allerdings können diese Protokolle angewendet werden, um die Lebensfähigkeit von gram-positiven und gram-negative Bakterien in professionellen Phagozyten, nicht-professionellen Phagozyten und Protozoen 15-24 beurteilen.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G 3/4 butterfly needles for blood collection</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water for irrigation</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>07-09-64-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 500</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>RDCD0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS no Ca2+ or Mg2+</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll solution</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm circular glass coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-80 12CIR-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pooled Human Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human interleukin-8</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>208-IL/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L7007 or L7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO9</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L7007 or L7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L-32463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CD63</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>H5C6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A20187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer Bright Line</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>EMS</td>
			<td>78320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend RT + Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004377</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells

Zentral auf das Gebiet der bakteriellen Pathogenese ist die Möglichkeit, festzulegen, ob und wie Mikroben nach Einwirkung von eukaryotischen Zellen überleben. Aktuelle Protokolle, um diese Fragen zu beantworten sind Koloniezahl-Assays, Gentamicin-Schutztests und Elektronenmikroskopie. Koloniezahl und Gentamicin-Schutztests beurteilen nur die Lebensfähigkeit der gesamten Bakterienpopulation und sind nicht in der Lage, einzelne Lebensfähigkeit der Bakterien zu bestimmen. Elektronenmikroskopie verwendet werden, um die Lebensfähigkeit der Bakterien zu bestimmen und einzelne Informationen hinsichtlich ihrer Lokalisation in Wirtszellen. Allerdings Bakterien zeigen oft eine Reihe von Elektronendichten, was eine Bewertung der Rentabilität schwierig. Dieser Artikel beschreibt Protokolle für den Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen, die die Lebensfähigkeit der einzelnen Bakterien im Inneren und mit Wirtszellen assoziiert offenbaren. Diese Tests wurden ursprünglich entwickelt, um das Überleben von Neisseria gonorrhoeae in primären humanen neutrophilen Granulozyten zu bewerten, sondern sollte einpplicable einem Bakterium-Wirt-Interaktion. Diese Protokolle kombinieren membranpermeablen Fluoreszenzfarbstoffen (SYTO9 und 4 &#39;,6-Diamino-2-phenylindol [DAPI]), die alle Bakterien färben, mit Membran-undurchlässig Fluoreszenzfarbstoffen (Propidiumiodid und SYTOX Grüne), die nur zugänglich sind nicht lebensfähige Bakterien. Vor der eukaryotischen Zelle Permeabilisierung wird ein Antikörper oder fluoreszierenden Reagens zugegeben, um extrazelluläre Bakterien zu identifizieren. So sind diese Tests unterscheiden die Lebensfähigkeit der Bakterien an und innen eukaryotischen Zellen haften. Ein Protokoll wird auch für die Verwendung der Lebensfähigkeit Farbstoffe in Kombination mit fluoreszierenden Antikörpern gegen eukaryotische Zellmarker, um die subzelluläre Lokalisierung von einzelnen Bakterien zu bestimmen. Die in diesem Artikel behandelt bakterielle Lebensfähigkeit Farbstoffe sind eine sensible Ergänzung und / oder Alternative zu traditionellen Mikrobiologie Techniken, um die Lebensfähigkeit der einzelnen Bakterien zu bewerten und Informationen, wo Bakterien in Wirtszelle überlebens.

Die skizzierten Protokolle wurden verwendet, um das Überleben von N. prüfen gonorrhoeae nach Einwirkung von primären humanen Neutrophilen 5,26. Neutrophile wurden mit N. infiziert gonorrhoeae und verarbeitet mit Protokoll 1, mit dem grün-fluoreszierenden Farbstoff SYTO9 Lebensfähigkeit und die rote fluoreszierende Propidiumiodid (Abbildung 4A). Die Farbstoffe wurden in Gegenwart von Saponin, die Cholesterin sequestriert, um vorzugsweise permeabilisiert...

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Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Zentral auf das Gebiet der bakteriellen Pathogenese ist die Möglichkeit, festzulegen, ob und wie Mikroben nach Einwirkung von eukaryotischen Zellen überleben. Dieser Artikel beschreibt Protokolle für den Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen, die die Lebensfähigkeit der einzelnen Bakterien im Inneren und mit Wirtszellen assoziiert offenbaren.

Fluoreszenz-Mikroskopie-Methoden zur Bestimmung der Lebensfähigkeit der Bakterien in Verbindung mit Säugerzellen

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

fluorescence-microscopy-methods-for-determining-viability-bacteria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

43.5K Aufrufe.  University of Virginia Health Sciences Center.  Zentral auf das Gebiet der bakteriellen Pathogenese ist die Möglichkeit, festzulegen, ob und wie Mikroben nach Einwirkung von eukaryotischen Zellen überleben. Dieser Artikel beschreibt Protokolle für den Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen, die die Lebensfähigkeit der einzelnen Bakterien im Inneren und mit Wirtszellen assoziiert offenbaren. 

Serie: Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

Nach Cell-Schicksal<em&gt; E. coli</em&gt; Nach Infektion mit Phagen

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the causative agent of Legionnaires' pneumonia, gains a pathogenic advantage over in vitro cultured bacteria when first harvested from protozoan cells prior to infection of mammalian macrophages. This suggests that important virulence factors may not be properly expressed in vitro. We have developed a tractable system for priming L. pneumophila through its natural protozoan host Acanthamoeba castellanii prior to mammalian cell infection. The contribution of any virulence factor can be examined by comparing intracellular growth of a mutant strain to wild-type bacteria after protozoan priming. GFP-expressing wild-type and mutant L. pneumophila strains are used to infect protozoan monolayers in a priming step and allowed to reach late stages of intracellular growth. Fluorescent bacteria are then harvested from these infected cells and normalized by spectrophotometry to generate comparable numbers of bacteria for a subsequent infection into mammalian macrophages. For quantification, live bacteria are monitored after infection using fluorescence microscopy, flow cytometry, and by colony plating. This technique highlights and relies on the contribution of host cell-dependent gene expression by mimicking the environment that would be encountered in a natural acquisition route. This approach can be modified to accommodate any bacterium that uses an intermediary host as a means for gaining a pathogenic advantage.

This technique provides a method to harvest, normalize and quantify intracellular growth of bacterial pathogens that are pre-cultivated in natural protozoan host cells prior to infections of mammalian cells. This method can be modified to accommodate a wide variety of host cells for the priming stage as well as target cell types.

Gefügig Mammalian Cell Infektionen mit Protozoen-grundiert Bakterien

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans commonly employ infection of mammalian hosts or host cells (i.e. macrophages) followed by yeast quantification using colony forming unit analysis or flow cytometry. While colony forming unit enumeration has been the most commonly used method in the field, this technique has disadvantages and limitations, including slow growth of some fungal species on solid media and low and/or variable plating efficiencies, which is of particular concern when comparing growth of wild-type and mutant strains. Flow cytometry can provide rapid quantitative information regarding yeast viability, however, adoption of flow cytometric detection for pathogenic yeasts has been limited for a number of practical reasons including its high cost and biosafety considerations. Here, we demonstrate an image-based cytometric methodology using the Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) for the quantification of viable pathogenic yeasts in co-culture with macrophages. Our studies focus on detection of two human fungal pathogens: Histoplasma capsulatum and Candida albicans. H. capsulatum colonizes alveolar macrophages by replicating within the macrophage phagosome, and here, we quantitatively assess the growth of H. capsulatum yeasts in RAW 264.7 macrophages using acridine orange/propidium iodide staining in combination with image cytometry. Our method faithfully recapitulates growth trends as measured by traditional colony forming unit enumeration, but with significantly increased sensitivity. Additionally, we directly assess infection of live macrophages with a GFP-expressing strain of C. albicans. Our methodology offers a rapid, accurate, and economical means for detection and quantification of important human fungal pathogens in association with host cells.

Here, we demonstrate how image cytometry can be used for quantification of pathogenic fungi in association with host cells in culture. This technique can be used as an alternative to CFU enumeration.

Verwendung Bildzytometrie zur Quantifizierung von pathogenen Pilzen in Verbindung mit Wirtszellen

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells and can be further modified to visualize other components in the cell such as infection with viruses and bacteria. Spatial localization and visualization of viruses and bacteria during the infection process is an essential step that complements expression profiling experiments such as microarrays and RNAseq in response to different stimuli. Understanding the spatiotemporal infections with these agents complements biological experiments aimed at understanding their interaction with cellular components. Several techniques for visualizing viruses and bacteria such as reporter gene systems or immunohistochemical methods are time-consuming, and some are limited to work with model organisms&#160;and involve complex methodologies. FISH that targets RNA or DNA species in the cell is a relatively easy and fast method for studying spatiotemporal localization of genes and for diagnostic purposes. This method can be robust and relatively easy to implement when the protocols employ short hybridizing, commercially-purchased probes, which are not expensive. This is particularly robust when sample preparation, fixation, hybridization, and microscopic visualization do not involve complex steps. Here we describe a protocol for localization of bacteria and viruses in insect and plant tissues. The method is based on simple preparation, fixation, and hybridization of insect whole mounts and dissected organs or hand-made plant sections, with 20 base pairs short DNA probes conjugated to fluorescent dyes on their 5&#39; or 3&#39; ends. This protocol has been successfully applied to a number of insect and plant tissues, and can be used to analyze expression of mRNAs or other RNA or DNA species in the cell.

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

We describe here a simple fluorescence in situ hybridization (FISH) method for the localization of viruses and bacteria in insect and plant tissues. This protocol can be extended for the visualization of mRNA in whole mount and microscopic sections.

Fluoreszenz<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierungen (FISH) für die Lokalisierung von Viren und Bakterien in Endosymbiotic Pflanzen-und Insekten Gewebe

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. This information is particularly valuable in the context of host-pathogen interactions. Many pathogen proteins function within host cells in a variety of way such as, enabling evasion of the host immune system and survival within the intracellular environment. To study these pathogen-protein host-cell interactions, several approaches are commonly used, including: in vivo infection with a strain expressing a tagged or mutant protein, or introduction of pathogen genes via transfection or transduction. Each of these approaches has advantages and disadvantages. We sought a means to directly introduce exogenous proteins into cells. Electroporation is commonly used to introduce nucleic acids into cells, but has been more rarely applied to proteins although the biophysical basis is exactly the same. A standard electroporator was used to introduce affinity-tagged bacterial effectors into mammalian cells. Human epithelial and mouse macrophage cells were cultured by traditional methods, detached, and placed in 0.4 cm gap electroporation cuvettes with an exogenous bacterial pathogen protein of interest (e.g. Salmonella Typhimurium GtgE). After electroporation (0.3 kV) and a short (4 hr) recovery period, intracellular protein was verified by fluorescently labeling the protein via its affinity tag and examining spatial and temporal distribution by confocal microscopy. The electroporated protein was also shown to be functional inside the cell and capable of correct subcellular trafficking and protein-protein interaction. While the exogenous proteins tended to accumulate on the surface of the cells, the electroporated samples had large increases in intracellular effector concentration relative to incubation alone. The protocol is simple and fast enough to be done in a parallel fashion, allowing for high-throughput characterization of pathogen proteins in host cells including subcellular targeting and function of virulence proteins.

Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.

Elektroporation von Functional bakterielle Effektoren in Säugerzellen

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis als Modellorganismus für die Beurteilung der Interaktion von anaeroben Bakterien mit Wirtszellen

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Analyse von Lymphozyten-Extravasation einer Verwendung<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell des Barrier Menschliches Blut-Hirn

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Quantifizierung der Efferocytosis durch einzellige Fluoreszenz-Mikroskopie

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

Hochdurchsatz-Messung der Plasmamembran Wiederverschließen Effizienz in Säugerzellen

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using the analysis of cell membrane receptor clusters as a model, we present a detailed protocol for this image analysis task using Fiji (ImageJ) and Matlab routines to: 1) define regions of interest and design masks adapted to these regions; 2) track the particles in fluorescence microscopy videos; 3) analyze the diffusion and intensity characteristics of selected tracks. The quantitative analysis of the diffusion coefficients, types of motion, and cluster size obtained by fluorescence microscopy and image processing provides a valuable tool to objectively determine particle dynamics and the consequences of modifying environmental conditions. In this article we present detailed protocols for the analysis of these features. The method described here not only allows single-molecule tracking detection, but also automates the estimation of lateral diffusion parameters at the cell membrane, classifies the type of trajectory and allows complete analysis thus overcoming the difficulties in quantifying spot size over its entire trajectory at the cell membrane.

Here, we present a protocol for single particle tracking image analysis that allows quantitative evaluation of diffusion coefficients, types of motion and cluster sizes of single particles detected by fluorescence microscopy.

Bildverarbeitungs-Protokoll für die Analyse der Diffusion und Cluster-Größe von Membranrezeptoren durch Fluoreszenz-Mikroskopie

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...