Die Autoren bedanken sich die Mitglieder des Lwigale Labor für die Kritik des Manuskripts. SLG wird von einem Ruth L. Kirschstein NRSA Stipendium des National Eye Institute (F32 EY02167301) unterstützt. PYL wird vom National Eye Institute (EY018050) unterstützt.

1. Inkubieren Küken und Wachteleier auf die gewünschte Stufe Für HH9 Embryonen, reichen typische Inkubationszeit von 29 bis 33 Stunden bei 38 ° C 63 <ol><li> Waschen Sie alle Fremdkörper aus den Eiern mit lauwarmem Wasser. </li><li> Vereinbaren Hühnereiern auf Tablett horizontal. Markieren Sie die Seite nach oben mit Bleistift, dies wird in die Region, wo der Embryo lokalisiert werden entsprechen wird. Inkubieren Wachteleier stumpfen Ende auf. </li><li> Place in 38 ° C befeuchteten Inkubator. Schalten Sie rocken Funktion. </li></ol> 2. Bereiten Sie Eier für Fenstertechnik und Dissektion <ol><li> Entfernen Sie Eier von Inkubator und sterilisieren Sie die Oberseiten mit 70% Ethanol. Am besten ist es auf der Ethanol sprühen und wischen Sie ihn schnell mit einem Papiertuch oder Kimwipe einer etwaigen Übernahme von Ethanol durch die Eierschale zu vermeiden. </li><li> Legen Sie das Huhn Ei auf einem einzelnen Ei-Halter (wir verwenden eine Petrischale mit gefalteten Papiertüchern ausgekleidet, zB &quot;Kimwipes&quot;). Mit AA Zangen, tippen Sie auf eine kleine HOLe in der oberen Oberfläche der Eischale am spitzen Ende des Eis. </li><li> Entfernen Sie 1,5-3ml von Licht Albumin aus dem Hühnerei mit einem 18 ½ G Injektionsnadel und 5 ml Spritze. Am besten ist es, die Nadel vertikal einfügen in das Loch, mit dem Kegelrad mit Blick auf den spitzen Ende des Eies (Abbildung 2A). Auf diese Weise, wenn Albumin entnommen wird, gibt es wenig Risiko einer versehentlichen Beschädigung der Dotter über eine Saug. Entsorgen Sie das Albumin. Dieser Schritt senkt den Dotter und die Embryos in das Ei, um für ein Fenster in der Eischale geöffnet werden muss. </li><li> Wischen Sie das Loch mit 70% Ethanol wie oben beschrieben und verschließen Sie diese mit Klebeband. Es ist wichtig, dass die Eischale das Loch umgibt vollständig frei von Albumin und trocken ist oder der Klebstoff nicht zu versiegeln. </li><li> Mit den AA Zangen, tippen Sie auf ein weiteres Loch in die markierten oberen Fläche der horizontalen Ei, nicht ganz an der Spitze. Achten Sie darauf, lassen Sie die Zange zu weit gehen durch die Eierschale nicht zu beschädigen das Eigelb oder Embryos. </li><li> Insert einer Seite der gekrümmten Irispinzetten in das Loch parallel zu der Eier Schale. Kneifen Sie auf der Schale, die in einer kreisförmigen Bewegung um ein ca. 2 cm im Durchmesser Fenster im Hühnerei Schale zu durchbrechen. Entsorgen Sie die Eierschale entfernt. Alternativ decken die obere Oberfläche des Eies mit Klebeband und verwenden eine Schere zu schneiden aus dem Fenster. Dies minimiert die Wahrscheinlichkeit von Eierschalen Trümmer fallen in die Eizelle. Der Embryo ist als eine undurchsichtige Platte auf der Oberseite des Eigelbs zu sehen. Entsorgen Sie alle unbefruchteten Eier (gekennzeichnet durch kleine weiße Fleck auf der Oberfläche Eigelb, oder Abwesenheit von Blastoderm). </li><li> Spritzen Sie eine kleine Menge von Tusche (1:10 verdünnt in steriler Ringer-Lösung mit &quot;Pen / Strep&quot; Antibiotika: Endkonzentration 100 pg / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin) unter dem Blastoderm mit Inszenierung des Embryos zu unterstützen. Verwendung einer 1 ml Spritze und 26 ½ G Injektionsnadel, gebogen in einem 45 ° Winkel an der Basis der Nadel mit der Abschrägung nach oben, alternativ, ein may mit einem Glas Pasteur-Pipette gezogen und Pipettieren mit dem Mund Apparat (Augenschutz tragen beim Biegen oder Brechen Injektionsnadel Glasnadel). Die Punktion der Dottermembran außerhalb des Perimeters des Blastoderms und schieben Sie die Spitze der Nadel unter dem Embryo, dicht an der Oberfläche des Dotters aber nicht in den embryonalen Schichten (Abbildung 2B). Injizieren Sie gerade genug Tinte, um den Embryo zu umreißen, dann ziehen Sie die Nadel vorsichtig (Abbildung 2C). Die Injektion kann zu viel Tinte auf Embryo zum Tod führen. Es ist wichtig, dass keine Luftblasen unter dem Embryo zu injizieren, da dies eine Quelle für Verunreinigungen sein kann. NB: Ringer-Lösung in diesem Verfahren verwendet wird sterilisiert und enthält Pen / Strep wie oben definiert. Sterile Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) ist ebenfalls als Alternative zu Ringer-Lösung in allen Schritten des Protokolls. </li><li> Stadium des Embryos nach Hamburger und Hamilton 63 und notieren Sie die Bühne auf der Eierschale in permanenter Tinte oder Kugelschreiber. Stufen werden am besten unter Ster beurteiltomicroscopy, mit Glasfaser &quot;Schwanenhals&quot;-Lichtquellen, die eine begrenzte Wärmebelastung haben. </li><li> 2-3 Tropfen warme sterile Ringer-Lösung auf der Oberfläche des Embryos zu Austrocknung und Kontamination zu verhindern. Vorübergehend abzudichten das Fenster mit Parafilm gestreckt über die Oberfläche des Eies. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2,2-2,9 mit allen Eiern Küken vor Beginn der Transplantation Experimente. </li><li> Da Wachteln Embryonen nur für Donor Gewebe verwendet werden, in ovo Schritte 2,2-2,9 kann weggelassen werden. Für ex ovo Vorbereitung von Spender-Embryos, sind Wachteleier stumpfen Seite inkubiert geöffnet und in dieser Region mit einer gebogenen Pinzette, um den Embryo zu offenbaren. Mit Präparierscheren, machen vier Schnitten in der Form eines Quadrats durch die Dotterhaut und Blastoderm außerhalb des Embryos (stellen Sie sicher, dass alle Schnitte treffen). Mit einem gebogenen Pinzette Iris, sanft erfassen Schnittkante ein und heben Sie den Embryo aus dem Ei und überträgt es auf Ringer-Lösung in einer Petrischale. Alternativ kann man mit der Kurved Irispinzetten um die herausgeschnittenen Embryo von unten, oder einem Embryo Löffel oder Kunststoff Transferpipette durch den breiteren Teil des Zylinders abgeschnitten zu heben, kann verwendet werden, um den Embryo zu übertragen aus dem Ei werden. Entfernen Sie vorsichtig die Dotterhaut mit Nr. 5 Zange. Sammelt die übrigen Embryonen Wachtel wie oben, und inszenieren sie unter einem Binokular. </li></ol> 3. Bereiten Sie die Wirtsembryo, um das Transplantat empfangen <ol><li> Entfernen Sie Parafilm vom Host (Küken) und Embryo mit einem geschärften Wolframnadel oder Nr. 5 Zangen, reißt ein kleines Loch in der Dotterhaut an der gewünschten Region des Neuralrohrs (Abbildung 3A). </li><li> Einen Tropfen Ringer-Lösung auf den Embryo. Achten Sie darauf, um den Embryo vollständig in Ringer-Lösung während des gesamten Verfahrens zur Austrocknung des Gewebes zu verhindern untergetaucht zu halten. Halten Hinzufügen von Tropfen von Ringer-Lösung auf die Oberfläche des Embryos über Überführungspipettenmechanismus falls erforderlich. </li><li> Mit einer Nadel gezogen Glas, sorgfältig machen rostralen und ca.UDAL Quereinschnitte entsprechend der Länge und der Region des Interesses an der dorsalen Neuralrohr. (Gezapftes Nadeln aus Silicium Glaskapillarrohre die unter Wärme wurden mit einer Nadel Ziehvorrichtung hingezogen wird.) Für einseitige Transplantate die Einschnitte nur in das Lumen des dorsalen Neuralrohr erstrecken, und für die bilaterale Transplantate, um die Einschnitte in die gesamte dorsalen Neuralrohr. Dann schneiden bilateral zwischen dem dorsalen Neuralrohr und dem paraxialen Mesoderm. </li><li> Sie vorsichtig die herausgeschnittenen Explantat aus dem Neuralrohr entfernen Sie sie dann aus dem Embryo durch Absaugen in ein Glas Mikropipette (3B). </li></ol> 4. Bereiten Sie die Spendertransplantat Gewebe <ol><li> Wählen Sie eine Etappe abgestimmt Wachtel Embryo. Halten Sie das Embryo sich mit AA-Zange, entfernen Sie die Dotterhaut, und Verbrauchsteuern ein ähnlich großer Bereich von Neuralrohrdefekten wie oben beschrieben (3,3-3,4) (Abbildung 3a&#39;-B &#39;). Je nach den Bedürfnissen des Experiments, kann diese Region zu einem seinkomplementären Bereich des Wirtes (Küken) Neuralrohr oder aus einer anderen Region entlang der rostro-caudale Achse. (NB: für eine größere regionale Transplantate, einschließlich vollständiger Neuralrohr Transplantate, können Forscher wollen eine Proteaseverdau bei diesem Schritt hinzufügen, um jeglichen anhaftenden mesenchymalen Gewebes aus dem Spendergewebe vor der Transplantation zu entfernen jedoch für kleine dorsalen Neuralrohr Transplantate in einem frühen Stadium. , wie hier erläutert, ist Proteaseverdau nicht erforderlich, da das Neuralrohr ist leicht von benachbarten Mesenchym durch streng chirurgischen Techniken getrennt.) </li></ol> 5. Graft das Gewebe <ol><li> Saugen Sie die Spender Explantat in ein Glas Mikropipette mit Ringer-Lösung. Achten Sie darauf, dass keine Luftblasen in die Pipette einzuführen. </li><li> Übertragen der benachbart zu dem Explantat ausgeschnitten Bereich des Hühnchens Host. Mit gezogen Glasnadel, das Explantat orientieren und sanft leiten es in die abgetragenen Bereichs (3C). </li><li> Vorsichtig ein paar Tropfen von Ringer-Lösungauf den Embryo zu Austrocknung zu verhindern. Achten Sie darauf, um Stürze zu vermeiden Flüssigkeit direkt auf das Transplantat vor Ort, da dies das Transplantat zu verdrängen können. </li><li> Verschließen Sie die Fenster mit Klebeband. Stellen Sie sicher, dass das Band dichtet den gesamten Bereich der Fenster Ei. Dadurch wird verhindert, Dehydratisierung und Verunreinigung des Embryos während anschließender Inkubation. </li><li> Senden Sie das Ei in den Inkubator, bis die gewünschte Stufe. Stellen Sie sicher, dass die &quot;Schaukel&quot;-Funktion ausgeschaltet wird, während die Inkubation der Chimären gedreht. Eier können leicht von Hand zwei Mal pro Tag, da dies ihre Lebensfähigkeit zu erhöhen, wenn späteren Stadien der Entwicklung ausgerichtet sind, gedreht werden. </li></ol> 6. Bereiten chimären Embryonen zum Schneiden <ol><li> Bei der experimentellen Endpunkt, schneiden Sie das Klebeband auf das Fenster mit einer feinen Schere. </li><li> Greifen Sie den Rand des Blastoderms mit gebogenen Pinzette Iris (am einfachsten mit geriffelten Spitzen zu tun), dann schneiden Sie den Embryo vom Dotter mit 4 großen Schnitte außerhalb der Grenzen des Blastoderms. </li&gt; <li> Übertragen Sie den Embryo in eine Petrischale mit Ringer-Lösung. Achten Sie darauf, um die Exposition des Embryos in die Luft zu minimieren, um Dehydrierung des Gewebes zu vermeiden. </li><li> Unter Stereomikroskopie, sanft trennen die Dotterhaut aus dem Blastoderm mit Nr. 5 Zange. </li><li> Vorsichtig anzuordnen den Embryo in der Schale, so dass der Embryo in der gleichen Orientierung ist, wie es in der Ei war, mit umgebenden Membranen flach ausgelegt. </li><li> Verwendung Sezieren Nadeln aus Wolfram-Drähten 64 angebracht sauber zu entfernen um die Keimscheibe aus dem Embryo durch Anordnen der Nadel an der Grenze des Embryos und extraembryonalen Gewebe, wobei die Länge des Wolframdrahts parallel zum Boden der Schale. Verwenden Sie einen sanften Sägebewegung um durch das Gewebe schneiden. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Amnion mit Nr. 5 Zange. An dieser Stelle können Sie, wollen entweder weiter sezieren die Region, die Sie interessieren, oder lassen Sie das ganze Embryo. </li><li> Übertragen Sie den Embryo zu eiskaltem 4% Paraffinormaldehyde-und Rock-Nacht bei 4 ° C. </li><li> Bereiten Sie die Proben und betten für Cryo-oder Paraffin-Schnitte. </li></ol> Verfolgen Sie die transplantierten Gewebes innerhalb der Wirtsembryo. Es gibt verschiedene Techniken zur Identifizierung von Wachtel Gewebe innerhalb eines Hühnerembryo, einschließlich der Erkennung von Wachtel Nucleoli durch Hämatoxylin-Färbung (Wachtel Kerne haben sehr große, dunklere Färbung als Einschlüsse chick Kerne), der Feulgen-Reaktion Rossenbeck, Acridin-orange oder biz-benzamid Fleck kombiniert mit der Elektronenmikroskopie, oder Immunomarkierung für Wachtel-spezifische Antigene 3,47,65,66. Hier verwenden wir QCPN Antigen und Standard-whole-mount oder Abschnitt Immunfluoreszenztechniken zu Wachtel Neuralleistenzellen in Wachtel-Küken Chimären (Abbildung 4) zu identifizieren. Diese Technik bietet die größte Flexibilität im experimentellen Design, die QCPN Immunfluoreszenz können auch mit anderen Antikörper kombiniert werden, um differenzierte Zellen vom Spender (Wachteln) Gewebe gewonnen identifizieren. Verwenden Sie StandaRD whole-mount oder Abschnitt Immunfluoreszenztechniken auf Wachtel-abgeleiteten Zellen in Chimären zu beschriften. 7. Repräsentative Ergebnisse Ein repräsentatives Bild des gepfropften Region des Neuralrohrs nach 6h der Re-Inkubation (bis HH11) zeigt, erwartet Einverleibung des gepfropften Spender (Wachtel) Gewebe in den Wirt (Küken) Neuralrohr (Abbildung 4A). Embryonen zeigt unvollständige Integration des Transplantats, oder asymmetrische Entwicklung der Oberkopf oder Somiten nach reincubation sollte verworfen werden. Querschnitt durch den gepfropften Region anzeigen HH11 NCCs mit HNK-1-Migration in seitlicher Richtung vom Neuralrohr bezeichnet. Wachtel Zellen, die zur der NCC Migrationsstrom, und das Neuralrohr, sind eindeutig mit QCPN (4B) markiert. In späteren Stadien kann Wachtel NCC-abgeleiteten Zellen bis zu ihrer endgültigen Zielgewebe zurückgeführt werden. QCPN markierten Zellen werden im Hühnerembryo Mesenchym durchsetztdes Oberkiefer-Prozess bei E5 (4C). Die QCPN Antikörper können leicht mit anderen Antikörpern kombiniert werden, um die Differenzierung der Wachtel-derived NCCs in der Host-Umgebung zu untersuchen. Wachtel NCC-abgeleiteten Trigeminus sensorischen Neuronen durch QCPN und Tuj1 Antikörper (4D) markiert. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3622/3622fig1.jpg" /> Abbildung 1. Übersicht über die experimentellen Verfahren und Instrumente notwendig. A) Moderator (Küken) und Spender (Wachtel) Embryonen dürfen Bühne abgestimmt. Um die NCC-Stream, die dem Trigeminus-Ganglion, Kiefer-und Unterkiefer-Region trägt zu beschriften, ist HH9 ideal. Am HH9, wird das Neuralrohr beginnt im rostralen Region zu schließen, ist aber noch nicht vollständig abgedichtet. Die graue Linie in den Diagrammen stellt die Mittellinie des Schließung des Neuralrohrs. Die gepunkteten Linien zeigen die weißen Schnittlinien zum Ausschneiden eines Mittelhirn Bereich der rechten Seite des Neuralrohrs aus Host und Donor emEmbryonen. Das ausgeschnittene Bereich der Wirtsembryo wird verworfen und das Spendergewebe in den chimären Embryo zu erzeugen transplantiert. B) notwendigen Instrumente umfassen: a) 5 ml Spritze mit 18 ½ G Injektionsnadel, b) 1 ml-Spritze mit 26 ½ G Injektionsnadel gebogen 45 °-Winkel, c) Tusche, d) klar, Packband, e) Glaspipette mit Pipettieren mit dem Mund Apparat, f) 60 mm-Petrischale, g) AA Zangen, h) gebogenen Pinzette Iris mit geriffelten Spitzen, i) # 5 Zangen, j) feinen Schere, k) geschärft Wolframdraht, l) gezogen Glasnadel, m) Parafilm Quadrate. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3622/3622fig2.jpg" /> Abbildung 2. Vorbereitung der Eier und Embryonen. A) Querschnittsdiagramm des Eies, einschließlich ideale Einfügemarke von 18 ½ G Injektionsnadel für den Entzug von Licht Albumin. B) Nach dem Abziehen des Lichts ~ 3 ml Albumin, senkt das Eigelb und Embryo im Ei, so dass die Forscher ein &quot;Fenster&quot; (Pfeile) in t geschnittener Eierschalen, um den Embryo zugreifen. Tusche, 1:10 verdünnt in sterile Ringer-Lösung, kann dann unter der Keimscheibe injiziert werden, um zum leichten Staging der Embryonen bereitzustellen. C) Hühnerembryo nach Einfärbung. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3622/3622fig3.jpg" /> Abbildung 3. Schematische und Beispiele von HH-Stufe 9 Spender und Empfänger Embryonen bei jedem Schritt des Transplantationsverfahren. A) Küken Wirtsembryo. Die gestrichelten Linien im Diagramm zeigen an, wo die Dotterhaut sollte abgerissen, um den Oberkopf zum Pfropfen zugreifen zu können. Sobald zerrissen die dreieckige Klappe der Dotterhaut sollte kaudal geschält werden. Box im Bild zeigt Einschub eingesetzt in (BC). A &#39;) Wachtel Donor Embryo. Das Bild ist von Spender-Embryo vom Ei herausgeschnitten und in die Petrischale für die Präparation des Transplantats Gewebe. Box im Bild zeigt Einschub eingesetzt in (B &#39;). Die gestrichelten Linien im Schaltplan (A &#39;) geben an, wo die Vitellin und Eigelb Membranen sollten geschnitten werden, um t zu entfernener Embryo aus dem Ei. B) Wirtsembryo mit einseitiger Mittelhirn Region des Neuralrohrs exzidiert (weiße Pfeile) erwartet Transplantat. Die gestrichelte Linie in schematische Darstellung zeigt an, wo Schnitte sollten verbrauchsteuerpflichtige des Neuralrohrs im Mittelhirn Region vorgenommen werden. B &#39;) Donor Embryo mit dorsalen Neuralrohr Transplantatgewebe exzidiert (Transplantat-Gewebe durch schwarze Pfeilspitzen). Die gestrichelte Linie im Diagramm zeigt an, wo Kürzungen sollten in der Wachtel Embryo verbrauchsteuerpflichtige das Spendergewebe für einseitige Transplantation des Mittelhirns Region des Neuralrohrs gemacht werden. C) chimärer Embryo nach der Transplantation von Wachtel dorsalen Neuralrohr Explantat in die Küken Mittelhirn Region. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3622/3622fig4.jpg" /> Abbildung 4. Immunfluoreszenz mit Antikörpern gegen Wachtel-spezifische nuclear antigen QCPN in Donor-abgeleiteten Zellen in der chimären Embryo. A) whole-mount Bild von HH11 Chimäre (aufgepfropft auf HH9) zeigt QCPN Färbung in rot, und HNK-1-Färbung (ein Marker für die Migration NCCs) ingrün. 10fache Vergrößerung, dorsale Ansicht. B) Querschnitt durch Embryo in (A), zeigt QCPN-positiven Zellen abgeleitet Wachtel im Neuralrohr und wandernde NCC mit HNK-1 (grün) co-gefärbt. 40-facher Vergrößerung. C) Querschnitt durch Oberkieferfortsatz von E5 Chimäre (inkubiert für 3 Tage nach Transplantation), zeigt QCPN-positiven NCC-abgeleiteten Zellen (rot), die aus dem gepfropften Bereich des Neuralrohr ihrem endgültigen Standort im Embryo gewandert sind. 10facher Vergrößerung. D) Abschnitt durch E5 Chimäre, welche von der Wachtel Beitrag NCC abgeleitet, um den Trigeminus-Ganglion (rot) und Differenzierung in TuJ1-positiven Neuronen (grün). 40-facher Vergrößerung. *, NCCs, MP-, Kiefer-Prozess, NT, Neuralrohr, TG, Trigeminus-Ganglion.

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das Pfropfen von der Wachtel Neuralrohr in Host Hühnerembryonen hier beschriebene ist eine unkomplizierte und kostengünstige Technik zur Verfolgung spezifischer Subpopulationen von Migration ausgehen NCCs aus verschiedenen Regionen entlang der rostro-caudale Achse 21,67-69. Diese Technik nutzt die Erleichterung des Zugangs zu Vogelembryonen (im Gegensatz zu Säugetierembryos Vergleich) und mit anderen Techniken, wie Gewebeablation, Injektion von inhibitorischen Moleküle, oder genetische Manipulation mittel...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Küken Eier </td><td> Various - wir verwenden Texas A &amp; M University Poultry Science Department, TX. </td><td></td></tr><tr><td> Wachteleier </td><td> Various - wir verwenden Ozarks Egg Company, MO. </td><td></td></tr><tr><td> Egg Inkubator (Digital Readout 1502 Sportsman Incubator w / Feuchtigkeit 110-120 Volt AC) </td><td> <a href="http://www.poultrysupply.com" target="_blank">www.poultrysupply.com</a> </td><td> 1502 </td></tr><tr><td> Dumont AA Zangen, Inox Epoxibeschichtete </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11210-10 </td></tr><tr><td> Tesafilm </td><td> Jedes Geschäft für Bürobedarf </td><td></td></tr><tr><td> Gebogene Irispinzetten </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11065-07 </td></tr><tr><td> IchNDIA Tinte </td><td> Jede Art Supply Store </td><td></td></tr><tr><td> Pen / Strep (Penicillin, Streptomycin) Lösung </td><td> VWR International </td><td> 101447-068 </td></tr><tr><td> Klare Packband </td><td> Jedes Geschäft für Bürobedarf </td><td></td></tr><tr><td> Needle Ziehvorrichtung </td><td> Narashige, Japan </td><td> PE-21 </td></tr><tr><td> Gezogen Glasnadel, gemacht von 1,5 bis 1,8 x 100mm Borosilikatglas Kapillarrohr </td><td> Kimble Chase </td><td> 34500 99 </td></tr><tr><td> Gezogen Glaspipette von 5 verwiesen ¾ &quot;Pasteurpipette </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13 bis 678-6A </td></tr><tr><td> Mund pipettieren Apparat (Ansaugrohr für Montage kalibriert Mikrokapillare Pipette) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5177-52A </td></tr><tr><td> Dumont Nr. 5 Zange </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11251-30 </td></tr><tr><td> Tungsten Draht, 0,1 mm Durchmesser </td><td> VWR International </td><td> AA10404-H2 </td></tr><tr><td> Nadelhalter (vernickelt Stifthalter) </td><td> Fine Science Tools </td><td> 26018-17 </td></tr><tr><td> QCPN Antiserum </td><td> Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa </td><td> QCPN </td></tr><tr><td> Alexa Fluor sekundären Antikörper (z. B., Alexa Fluor 594 Ziege-anti-Maus-IgG1) </td><td> Invitrogen </td><td> A21125 </td></tr><tr><td> Ringer-Lösung (2L): <ul><li> 14,4 g NaCl </li><li> 0,34 g CaCl 2 </li><li> 0.74g KCl </li><li> 0.230g Na 2 HPO 4 </li><li> 0,04 g KH 2 PO 4 </li><li> ddH 2 O bis 2L </li><li> Filter und Autoklaven </li></ul></td><td> Alle Reagenzien von Fisher Scientific </td><td><ul><li> 7647-14-5 </li><li> 10043-52-4 </li><li> 7447-40-7 </li><li> 7558-79-4 </li><li> 7778-77-0 </li></ul></td></tr></tbody></table>

analysis of neural crest migration and differentiation by cross-species transplantation

Vogelembryonen bieten eine einzigartige Plattform für die Erforschung von vielen Wirbeltieren Entwicklungsprozesse durch die gute Anbindung der Embryonen im Ei. Chimäre Vogelembryonen, in denen Wachteln Spendergewebe in einen Hühnerembryo in ovo transplantiert wird, verbinden die Kraft der unauslöschliche genetische Markierung von Zellpopulationen mit der einfachen Handhabung durch den Vogelembryo vorgestellt. Wachtel-Küken Chimären sind ein klassisches Instrument zur Nachverfolgung von wandernden Neuralleistenzellen (NCC) 1-3. NCCs sind eine vorübergehende wandernden Population von Zellen im Embryo, die im dorsalen Bereich der Entwicklung von neuronalen Rohr 4 stammen. Sie durchlaufen eine epitheliale zu mesenchymale Transition und in der Folge auch auf andere Regionen des Embryos, wo sie sich unterscheiden in verschiedene Zelltypen, einschließlich Knorpel 5-13, Melanozyten 11,14-20, 21-32 Neuronen und Glia zu migrieren. NCCs sind multipotente, und ihr Schicksal ist beeinbeeinflusst durch 1) die Region des Neuralrohrs in dem sie ihren Ursprung entlang der rostro-caudale Achse des Embryos 11,33-37, 2) Signale von benachbarten Zellen, wie sie 38 bis 44 zu migrieren, und 3) der Mikroumgebung ihre ultimative Ziel innerhalb des Embryos 45,46. Tracing diese Zellen von ihrem Entstehungsort im Neuralrohr, um ihre endgültige Position und Schicksal innerhalb des Embryos, liefert wichtige Einblicke in die Entwicklungsprozesse, die Musterbildung und Organogenese zu regulieren. Die Transplantation von komplementären Regionen der Spender Neuralrohr (homotop Transplantation) oder verschiedenen Regionen des Spenders Neuralrohr (heterotope Transplantation) kann zeigen Unterschiede in der Pre-Spezifikation von NCCs entlang der rostro-caudale Achse 2,47. Diese Technik kann angepasst werden, um eine einseitige Kammer des Neuralrohrs, so dass eine Seite von Spendergewebe abgeleitet transplantiert, und die Gegenseite Reste in der ungestörten Wirtsembryo, yiElding eine interne Kontrolle innerhalb der gleichen Probe 2,47. Es kann auch für die Transplantation von Gehirn-Segmente in späteren Embryonen angepasst werden, nachdem HH10, wenn die vordere Neuralrohr 47 geschlossen ist. Hier berichten wir über Techniken zur Erzeugung von Wachtel-Küken Chimären über Neuralrohr Transplantation, die für die Rückverfolgung der wandernden NCCs aus einer diskreten Segment des Neuralrohrs ableiten lassen. Artspezifische Etikettierung der Spender stammenden Zellen mit dem Wachtel-spezifische Antikörper QCPN 48-56 erlaubt dem Forscher, Spender-und Wirtszellen bei der experimentellen Endpunkt unterscheiden. Diese Technik ist einfach, kostengünstig und hat viele Anwendungen, einschließlich Schicksal-Mapping, Zelllinie Rückverfolgung und Identifizierung von Pre-Events Musterbildung entlang der rostro-kaudalen Achse 45. Wegen der Leichtigkeit des Zugangs zu den Vogelembryo, kann die Wachtel-Küken-Graft-Technik mit anderen Manipulationen, auch kombiniert werden, aber nicht auf die Linse Ablation 4 begrenzt0, Injektion von inhibitorischen Moleküle 57,58, oder genetische Manipulation mittels Elektroporation von Expressionsplasmiden 59-61, um die Reaktion des bestimmten wandernden Ströme von NCCs auf Störungen in der embryonalen Entwicklung Programm zu identifizieren. Darüber hinaus kann diese Pfropfen Technik auch verwendet, um andere interspezifische chimären Embryonen wie Wachtel-Enten-Chimären zu erzeugen, um NCC Beitrag zur kraniofazialen Morphogenese, oder Maus-Chimären-Küken, die Macht der Maus-Genetik mit der Leichtigkeit der Manipulation des Vogelembryo kombinieren studieren werden . 62

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Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

Ein Ansatz zur Analyse von Migration und schließlich das Schicksal der aviären Neuralleistenzellen in Wachtel-Küken chimären Embryos beschrieben wird. Diese Methode ist eine einfache und unkomplizierte Technik zum Aufspüren Neuralleistenzellen während der Migration und Differenzierung, die sonst schwer zu unmanipulierten innerhalb eines Hühnerembryo zu unterscheiden sind.

Die Analyse der Neuralleiste Migration und Differenzierung von Cross-Spezies Transplantation

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. ...

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Serie: Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent progenitor cells to be an integral part of the neural crest1. Phenotypically, neural crest stem cells (NCSC) are defined by simultaneously expressing p75 (low-affine nerve growth factor receptor, LNGFR) and SOX10 during their migration from the neural crest2,3,4,5. These progenitor cells can differentiate into smooth muscle cells, chromaffin cells, neurons and glial cells, as well as melanocytes, cartilage and bone6,7,8,9. To cultivate NCSC in vitro, a special neural crest stem cell medium (NCSCM) is required10. The most complex part of the NCSCM is the preparation of chick embryo extract (CEE) representing an essential source of growth factors for the NCSC as well as for other types of neural explants. Other NCSCM ingredients beside CEE are commercially available. Producing CCE using laboratory standard equipment it is of high importance to know about the challenging details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes. In this protocol we describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE.

To cultivate neural crest stem cells (NCSC) in vitro, a special medium (NCSCM) is required. Essential part of NCSCM is chick embryo extract (CEE). We here describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE, including details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes.

Herstellung von Hühnerembryo-Extrakt für die Kultivierung von Murine Neural Crest Stem Cells

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent ...

Forschung

Neurowissenschaften

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor functions. Most investigations of sensorimotor mechanisms rely on either examination of neurons while an animal is static1,2 or record extracellular neuronal activity during a movement.3,4 While these studies have provided the fundamental background for sensorimotor function, they either do not evaluate functional information which occurs during a movement or are limited in their ability to fully characterize the anatomy, physiology and neurochemical phenotype of the neuron. A technique is shown here which allows extensive characterization of individual neurons during an in vivo movement. This technique can be used not only to study primary afferent neurons but also to characterize motoneurons and sensorimotor interneurons. Initially the response of a single neuron is recorded using electrophysiological methods during various movements of the mandible followed by determination of the receptive field for the neuron. A neuronal tracer is then intracellularly injected into the neuron and the brain is processed so that the neuron can be visualized with light, electron or confocal microscopy (Fig. 1). The detailed morphology of the characterized neuron is then reconstructed so that neuronal morphology can be correlated with the physiological response of the neuron (Figs. 2,3). In this communication important key details and tips for successful implementation of this technique are provided. Valuable additional information can be determined for the neuron under study by combining this method with other techniques. Retrograde neuronal labeling can be used to determine neurons with which the labeled neuron synapses; thus allowing detailed determination of neuronal circuitry. Immunocytochemistry can be combined with this method to examine neurotransmitters within the labeled neuron and to determine the chemical phenotypes of neurons with which the labeled neuron synapses. The labeled neuron can also be processed for electron microscopy to determine the ultrastructural features and microcircuitry of the labeled neuron. Overall this technique is a powerful method to thoroughly characterize neurons during in vivo movement thus allowing substantial insight into the role of the neuron in sensorimotor function.

A technique is described to quantify the in vivo physiological response of mammalian neurons during movement and correlate the physiology of the neuron with neuronal morphology, neurochemical phenotype and synaptic microcircuitry.

Physiologische, morphologische und neurochemische Charakterisierung von Neuronen Modulated durch Bewegung

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a well-characterized niche for adult stem cells1. This segment of the outer root sheath contains a number of different types of stem cells, including epithelial stem cells2, melanocyte stem cells3 and neural crest like stem cells4-7. Hair follicles represent an accessible and rich source for different types of human stem cells. We and others have isolated neural crest stem cells (NCSCs) from human fetal and adult hair follicles4,5. These human stem cells are label-retaining cells and are capable of self-renewal through asymmetric cell division in vitro. They express immature neural crest cell markers but not differentiation markers. Our expression profiling study showed that they share a similar gene expression pattern with murine skin immature neural crest cells. They exhibit clonal multipotency that can give rise to myogenic, melanocytic, and neuronal cell lineages after in vitro clonal single cell culture. Differentiated cells not only acquire lineage-specific markers but also demonstrate appropriate functions in ex vivo conditions. In addition, these NCSCs show differentiation potential toward mesenchymal lineages. Differentiated neuronal cells can persist in mouse brain and retain neuronal differentiation markers. It has been shown that hair follicle derived NCSCs can help nerve regrowth, and they improve motor function in mice transplanted with these stem cells following transecting spinal cord injury8. Furthermore, peripheral nerves have been repaired with stem cell grafts9, and implantation of skin-derived precursor cells adjacent to crushed sciatic nerves has resulted in remyelination10. Therefore, the hair follicle/skin derived NCSCs have already shown promising results for regenerative therapy in preclinical models.
Somatic cell reprogramming to induced pluripotent stem (iPS) cells has shown enormous potential for regenerative medicine. However, there are still many issues with iPS cells, particularly the long term effect of oncogene/virus integration and potential tumorigenicity of pluripotent stem cells have not been adequately addressed. There are still many hurdles to be overcome before iPS cells can be used for regenerative medicine. Whereas the adult stem cells are known to be safe and they have been used clinically for many years, such as bone marrow transplant. Many patients have already benefited from the treatment. Autologous adult stem cells are still preferred cells for transplantation. Therefore, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin/hair follicles are a valuable source for regenerative medicine.

This article presents a robust protocol for isolation and culture of neural crest stem cells from human hair follicles.

Isolation und Kultur von Neural Crest Stem Cells aus menschlichen Haarfollikeln

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

T-maze Forced Alternation and Left-right Discrimination Tasks for Assessing Working and Reference Memory in Mice

Forced alternation and left-right discrimination tasks using the T-maze have been widely used to assess working and reference memory, respectively, in rodents. In our laboratory, we evaluated the two types of memory in more than 30 strains of genetically engineered mice using the automated version of this apparatus. Here, we present the modified T-maze apparatus operated by a computer with a video-tracking system and our protocols in a movie format. The T-maze apparatus consists of runways partitioned off by sliding doors that can automatically open downward, each with a start box, a T-shaped alley, two boxes with automatic pellet dispensers at one side of the box, and two L-shaped alleys. Each L-shaped alley is connected to the start box so that mice can return to the start box, which excludes the effects of experimenter handling on mouse behavior. This apparatus also has an advantage that in vivo microdialysis, in vivo electrophysiology, and optogenetics techniques can be performed during T-maze performance because the doors are designed to go down into the floor. In this movie article, we describe T-maze tasks using the automated apparatus and the T-maze performance of &alpha;-CaMKII+/- mice, which are reported to show working memory deficits in the eight-arm radial maze task. Our data indicated that &alpha;-CaMKII+/- mice showed a working memory deficit, but no impairment of reference memory, and are consistent with previous findings using the eight-arm radial maze task, which supports the validity of our protocol. In addition, our data indicate that mutants tended to exhibit reversal learning deficits, suggesting that &alpha;-CaMKII deficiency causes reduced behavioral flexibility. Thus, the T-maze test using the modified automatic apparatus is useful for assessing working and reference memory and behavioral flexibility in mice.

This article presents the protocol of T-maze tests using a modified automated apparatus for assessing the learning and memory functions in mice.

T-Labyrinth Erzwungener Wechsel und die Links-Rechts-Discrimination Aufgaben für die Beurteilung der Arbeitsbedingungen und Referenz-Gedächtnis bei Mäusen

Forced alternation and left-right discrimination tasks using the T-maze have been widely used to assess working and reference memory, respectively, in ...

Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after undergoing an epithelial-mesenchymal transition 1,2. Following EMT, NCCs migrate large distances along stereotypic pathways until they reach their targets. NCCs differentiate into a vast array of cell types including neurons, glia, melanocytes, and chromaffin cells 1-3. The ability of NCCs to reach and recognize their proper target locations is foundational for the appropriate formation of all structures containing trunk NCC-derived components 3. Elucidating the mechanisms of guidance for trunk NCC migration has therefore been a matter of great significance. Numerous molecules have been demonstrated to guide NCC migration 4. For instance, trunk NCCs are known to be repelled by negative guidance cues such as Semaphorin, Ephrin, and Slit ligands 5-8. However, not until recently have any chemoattractants of trunk NCCs been identified 9. 
Conventional in vitro approaches to studying the chemotactic behavior of adherent cells work best with immortalized, homogenously distributed cells, but are more challenging to apply to certain primary stem cell cultures that initially lack a homogenous distribution and rapidly differentiate (such as NCCs). One approach to homogenize the distribution of trunk NCCs for chemotaxis studies is to isolate trunk NCCs from primary NT explant cultures, then lift and replate them to be almost 100% confluent. However, this plating approach requires substantial amounts of time and effort to explant enough cells, is harsh, and distributes trunk NCCs in a dissimilar manner to that found in in vivo conditions. 
Here, we report an in vitro approach that is able to evaluate chemotaxis and other migratory responses of trunk NCCs without requiring a homogenous cell distribution. This technique utilizes time-lapse imaging of primary, unperturbed trunk NCCs inside a modified Zigmond chamber (a standard Zigmond chamber is described elsewhere10). By exposing trunk NCCs at the periphery of the culture to a chemotactant gradient that is perpendicular to their predicted natural directionality, alterations in migratory polarity induced by the applied chemotactant gradient can be detected. This technique is inexpensive, requires the culturing of only two NT explants per replicate treatment, avoids harsh cell lifting (such as trypsinization), leaves trunk NCCs in a more similar distribution to in vivo conditions, cuts down the amount of time between explantation and experimentation (which likely reduces the risk of differentiation), and allows time-lapse evaluation of numerous migratory characteristics.

An approach to analyze the migration of explanted cells (trunk neural crest cells) is described. This method is inexpensive, gentle, and capable of distinguishing chemotaxis from both chemokinesis and other influences on migratory polarity such as those derived from cell-cell interactions within the primary trunk neural crest cell culture.

Analyse der Trunk Neural Crest Cell Migration mit Hilfe eines modifizierten Zigmond Chamber Assay

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

Erkennung von mikroregionale Hypoxie in Maus-Großhirnrinde Zwei-Photonen-Imaging von endogenen NADH Fluoreszenz

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Reproduzierbare Maus Ischiasnerv Crush und anschließende Bewertung der Regeneration von Whole mount Muskelanalyse

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

The discovery of neural stem and progenitor cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult mammalian brain has led to a body of research aimed at utilizing the multipotent and proliferative properties of these cells for the development of neuroregenerative strategies. A critical step for the success of such strategies is the mobilization of NPCs toward a lesion site following exogenous transplantation or to enhance the response of the endogenous precursors that are found in the periventricular region of the CNS. Accordingly, it is essential to understand the mechanisms that promote, guide, and enhance NPC migration. Our work focuses on the utilization of direct current electric fields (dcEFs) to promote and direct NPC migration - a phenomenon known as galvanotaxis. Endogenous physiological electric fields function as critical cues for cell migration during normal development and wound repair. Pharmacological disruption of the trans-neural tube potential in axolotl embryos causes severe developmental malformations1. In the context of wound healing, the rate of repair of wounded cornea is directly correlated with the magnitude of the epithelial wound potential that arises after injury, as shown by pharmacological enhancement or disruption of this dcEF2-3. We have demonstrated that adult subependymal NPCs undergo rapid and directed cathodal migration in vitro when exposed to an externally applied dcEF. In this protocol we describe our lab's techniques for creating a simple and effective galvanotaxis assay for high-resolution, long-term observation of directed cell body translocation (migration) on a single-cell level. This assay would be suitable for investigating the mechanisms that regulate dcEF transduction into cellular motility through the use of transgenic or knockout mice, short interfering RNA, or specific receptor agonists/antagonists.

In this protocol we demonstrate how to construct custom chambers that permit the application of a direct current electric field to enable time-lapse imaging of adult brain derived neural precursor cell translocation during galvanotaxis.

A Galvanotaxis Assay für die Analyse von neuralen Vorläuferzellen Cell Migration Kinetics in einem von außen angelegten Direct Current Electric Field

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

Feeder freie Ableitung von Neural Crest Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...