Wir danken Dr. Maiken Nedergaard (University of Rochester Medical Center) für den Kopf-Bauweise. Die Arbeit wurde von NIH Auszeichnungen wurden auf SD (R01DA026325 und P30AI078498 und Stiftung Stipendien an KK (Dana Foundation Brain and Immunoimaging Programm, American Heart Association 0635595T und der ALS Association [# 1112)]) unterstützt.

1. Vorbereitung der Tiere für die Bildgebung Hinweis: Wir verwenden erwachsene C57BL Mäusen. Verschiedene transgene Stämme können je nach Fragestellung werden. Mikrovaskuläre Praxen und Pulsoximetrie sind bei Mäusen mit weißem Pelz (zB FVB-Stamm) erleichtert. <ol><li> Bereiten Sie das Operationsgebiet an der Werkbank. Alle chirurgischen Instrumente müssen autoklaviert oder mit 70% Ethanol desinfiziert werden. </li><li> Legen Sie eine rektale Sonde, und messen kontinuierlich den Körper des Tieres Temperatur während des gesamten Verfahrens </li><li> Betäuben die Maus mit anfänglich 5% Isofluran. In 15 bis 30 s, wenn das Tier bewegt sich nicht, legen Sie es auf einem Heizkissen (37 ° C), und tragen Sie eine Gesichtsmaske für die kontinuierliche Lieferung von Luft mit 1,3 bis 1,5% Isofluran). Stellen Sie sicher, dass das Tier reagiert nicht auf einen Schmerzreiz (zB Schwanz Prise). </li><li> Verwenden Sie künstliche Tränenflüssigkeit Gel auf die Maus in die Augen bedecken, um die Exposition gegenüber trockener Luft zu verhindern. </li><li> Mit einem elektrischen Rasierer, Haare zu entfernen fROM den Kopf und aus beiden Oberschenkeln. Bewerben Haarentferner (zB Nair) zum Oberschenkel für 2 min, und wischen Sie es sorgfältig, um die restlichen Haare zu entfernen. Dieser Schenkel wird für Oximetrie verwendet werden. </li><li> Desinfizieren Sie die Kopfhaut mit einer 10% Povidon-Jod-Lösung und 70% Ethanol. </li></ol> 2. Vorbereiten des offenen Schädel Schädel-Fenster <ol><li> Ab 5 mm kaudal der Schädelbasis, einen Einschnitt in der Kopfhaut mit einer Schere und einem Zentimeter vorrücken. Bewegen Haut an den Seiten, um den Schädel freizulegen. </li><li> Um die Membranen auf der Oberseite des Schädels entfernen gelten 10% Eisenchloridlösung an die Spitze des Schädels. Wischen Sie die überschüssige Lösung, und kratzen die Membranen weg mit 45 °-Winkel Nr. 5 Pinzette. Es ist wichtig, um die Site sorgfältig vorzubereiten, um sicherzustellen, daß die Kopfplatte sicher an dem Schädel befestigt werden (Schritte # 4-6). </li><li> Mit einem Dissektionsmikroskop, identifizieren den Bereich von Interesse. Beachten Sie, dass die Schädelnähte vermieden werden, da der Schädel cein unvorhersehbar brechen in dieser Richtung. </li><li> Tragen Sie eine dünne Schicht des schnellen Kleber (zB Loctite 454) an den Rändern des Fensters von der Kopfplatte (Abbildung 1). Positionieren der Kopfplatte in einer solchen Weise, dass der Bereich von Interesse in dem Fenster freigelegt. Wenden Sie leichten Druck auf der Kopfplatte. Eine kleine Menge von Zahnzement, um den Klebstoff schnell polymerisieren. Halten Sie für 10 Sekunden, während der Leim Polymerisation. </li><li> Eine kleine Menge des schnellen Leim auf den Rändern des Fensters, um die Kopfplatte und den Schädel zu versiegeln. Schrauben Sie die Kopfplatte an das Tier Halterung unter dem Sezieren Umfang. </li><li> Mit dem Bohrer MicroTorque II bei 6000 Umdrehungen pro Minute und einer IRF 005 Bohrer gesetzt, entfernen Sie alle zusätzlichen Klebstoff aus dem Schädel und aus der Kopfplatte. Ein verbleibender Klebstoff auf der Kopfplatte sollte entfernt werden, da es sonst mit der Befestigung der Glasabdeckung stören. </li><li> Setzen Sie den Bohrer bei 1000 rpm, und starten Sie den Schädel bohren, indem Sie einen Kreis innerhalb der Kopfplatte Fenster, Durchmesser ca. 5 mm. Verwenden Sie leichte kreisenden Bewegungen, als ob Sie mit einem sehr weichen Bleistift zeichnen sind. Stop Bohren alle 20-30 Sekunden, um Knochen Staub mit Druckluft zu entfernen. Hinweis: Die Form der Öffnung in der Kopfplatte können zusätzliche Zugang für den Bohrer (für links und rechtshändige Chirurg), die es leichter, einen kreisförmigen Schädelfenster erstellen lassen. Darüber hinaus bieten die beiden seltsam geformten Löcher den erforderlichen Raum, um eine Clark-Elektrode oder Glas-Elektrode in das Hirngewebe einfügen unter dem kranialen Fenster für zusätzliche polarographische oder elektrophysiologische Messungen. </li><li> Da das Bohren fortschreitet, wird ein Bau rund um den intakten Schädel in der Mitte gebildet. Achten Sie darauf, durch den ausgedünnten Schädel stecken, aber um diese Höhle von gleichmäßiger Dicke zu machen. Seien Sie besonders vorsichtig um große Blutgefäße, sie sollten nicht beeinträchtigt werden und, wenn möglich, nicht einmal berührt. </li><li> Verwenden Sie ein &quot;Bein&quot; der Pinzette # 3 zu heben (&quot;Flick Off&quot;) die Knochen in der Mitte des Fensters. Einen Tropfen Künial zerebrospinaler Flüssigkeit (ACSF) auf der Scheibe. </li><li> Wischen Sie sanft mit einem aCSF Ecke von weichem Tissue-Papier (z. B. Kimwipe). Gewöhnlich wird die Dura nach einem oder mehreren Orten um den Rand des Fensters beschädigt. Ab einer dieser Seiten, heben Sie vorsichtig und entfernen Sie dann die Dura von der Hirnoberfläche, mit 45 °-Winkel Pinzette # 5. Bei der Wahl der Stelle, an der zu beginnen Entfernen der Dura, vermeiden die Bereiche neben großen Blutgefäßen. Kommt es zu Blutungen, einen Tropfen aCSF und warten Sie 2-3 min für kleinere Blutungen zu stoppen. </li><li> Bereiten 0,07% niedrig schmelzende Agarose in aCSF gelöst) Bringen Sie die geschmolzene Agarose auf Körpertemperatur. Wischen über die aCSF von der Oberfläche des Gehirns. Gießen Sie die Agarose in dem Fenster, und decken mit einem Glasträger. Drücken Sie das Glas vorsichtig, um einen Kontakt zwischen dem Glas und der Kopfplatte machen, und warten Sie 10-20 Sekunden, bis die Agarose ist solide. </li><li> Entfernen Sie das überschüssige Agarose aus der Glasabdeckung mit einer Pinzette und weichem Tissue-Papier. </li><li> Geben Sie eine kleineHöhe der schnellen Leim um das Glas zu kleben das Glas an der Kopfplatte. Eine kleine Menge von Zahnzement, um den Klebstoff (1) verfestigen. </li></ol> 3. Die intravenöse Injektion und Blutoxygenierung Überwachung Hinweis: routinemäßig verwendet, die Oberschenkelvene zur intravenösen Applikation von Texas-Rot als die Schwanzvene injiziert. Dies liegt daran, Vena femoralis Injektionen sichere und reproduzierbare Bolusinjektionen des Farbstoffs. <ol><li> Drehen Sie das Tier teilweise über die Innenseite des linken Oberschenkels aussetzen. Klebeband, um die Tiere in dieser Position zu sichern. </li><li> Bewerben antiseptischen Gestrüpp, und dann 100% Ethanol auf die Haut. </li><li> Einen Einschnitt entlang der medialen Oberschenkel vom Knie bis zur Symphyse. Separate Weichteile durch stumpfe Präparation mit einer Pinzette # 5. </li><li> Füllen Sie 1 ml-Spritze mit 130 ul von Texas Red (2,5 mg / ml). Befestigen Sie eine neue Nadel (Gauge 30), und biegen Sie ihn sorgfältig bei 30 ° und hält die Fase auf. Füllen Sie die Nadel with Texas Red-Lösung. </li><li> Unter einem Dissektionsmikroskop, führen Sie die Nadel in die V. femoralis und injizieren 100 ul Texas Red. Entfernen Sie die Nadel und drücken Sie leicht die Vene mit Gaze, um eine Blutung zu stoppen. </li><li> Schließen Sie die Haut mit 4-0 Naht. </li><li> Zur kontinuierlichen Überwachung von Blut SpO 2 (auf angemessene Blutoxygenierung gewährleisten) setzen Sie den Oximetermeßfühler auf dem rechten Oberschenkel (aus denen Haare hatte es schon zuvor). </li></ol> 4. Zwei-Photonen-Imaging Hinweis: Wir verwenden eine Olympus Fluoview1000 Multiphotonen Imaging-System (stehend) mit einem Spectra-Physics MaiTai HP DeepSee Femtosekunden-Ti: Sa-Lasers als Anregungsquelle. Für die Bildgebung, nutzen wir × 10 NA 0,45 (Zeiss C-Apochromat) oder × 25 NA 1,05 (Olympus XLPlan N) Wasser-Immersions-Objektive. Wir nehmen Bilder auf 12-Bit-Farbtiefe bei einer Auflösung von 512 × 512 Pixel mit einem Pixel-Verweilzeit von 2 us. Die NADH-und Texas-Red-Dextran werden gleichzeitig bei 740 nm angeregt, und Fluorescence wird vom Anregungslicht getrennt mit einem dichroitischen Spiegel / Nah-IR-Sperrfilter Kombination (FF665-DI01; FF01-680/SP, Semrock, Rochester, NY, USA) gliedert sich in zwei Kanäle mit einem dichroitischen Spiegel (505DCXRU, Chroma , Rockingham, VT, USA), und bandpassgefiltert (NADH-Semrock FF460/80Texas-Red-dextran-Semrock FF607/36). Laserleistung nach dem Objektiv 10-20 mW gemessen wurde, war für die Bildgebung in Schicht I und 20-50 mW für die Bildgebung in Schicht II. <ol><li> Übertragen Sie die chirurgisch präparierten Maus auf dem Mikroskoptisch. Nehmen Sie ein erstes Bild der Schädelbasis Fenster Website mit Hellfeldbeleuchtung mit 4x-Vergrößerung um sie als Referenz für die Registrierung Karte mit höherer Vergrößerung Zwei-Photonen-Angiographien zu verwenden. </li><li> Zoomen Sie in dem interessierenden Gebiet mit x 10 Vergrößerung. Wählen Sie einen Bereich von Interesse in kortikalen Schichten I oder II (bis zu 150 um unterhalb der Pia-Oberfläche). Wenn höhere Vergrößerung gewünscht wird, verwenden × 25 Ziel </li><li> Start Aufzeichnung der Zeitreihen (FiguZu 2). Wir empfehlen, durchschnittlich 3-5 Frames, um die Qualität des Bildes zu erhöhen. </li><li> Induzieren Hypoxämie durch Zugabe von 50% N2 in die Luft, dass das Tier atmet. Dadurch wird der O2-Gehalt bis 10% zu bringen. Stellen Sie sicher, Hypoxämie durch Überwachung Oximeter Daten. </li><li> Fortfahren, um die Zeitreihe durch Hypoxämie (z. B. 30 Sekunden) aufzunehmen, und nach den üblichen O2 wird wiederhergestellt. </li><li> Sammeln von Daten für die Berechnung der Sauerstoff-Verteilung durch Erfassen, Messen und Quantifizieren der Bereich der Hypoxie und oxygenierten Gewebe Rollen, um die Blutgefäße. </li></ol> 5. Datenverarbeitung <ol><li> Bestimmen der Krogh Gewebezylinder Radius R Dies kann manuell erfolgen (3) durch Messung des Abstandes zwischen Mitte des Blutgefäßes und der Grenze, bei der hohen NADH Fluoreszenz nachgewiesen wird. </li><li> Alternativ können Sie auch den Rechenaufwand Ermittler-unabhängige semi-automatische Bestimmung des Gewebes Zylinder Radius R und die zentrale blood r Gefäß, das beschrieben wurde bisher 1 in ergänzender Form zusammengefasst und in der Diskussion Abschnitt dieses Protokoll. </li><li> Die Fläche von Hypoxie mit Open-Access-Bildanalyse-Software, zB ImageJ. Um dies zu tun, verwenden NADH-Signal, definieren Sie eine Schwelle, die die hohe Intensität NADH Bereich abgrenzt, und messen Sie dann den Bereich mit erhöhten NADH Fluoreszenz Gewebe. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 2 zeigt ein Video von NADH / Angiographie Bilder bei transienten Hypoxämie (für die PDF-Version dieser Abbildung, ausgewählten Standbilder verwendet wurden). Die eingeatmeten Sauerstoffkonzentration von 21% bis 10% für einen Zeitraum von 3 min abgesenkt. Dieses Niveau der experimentell induzierten Hypoxämie ausreichend ist, um schwere Hypoxie in der Hirnrinde zu induzieren. Hypoxie führte zu einem Anstieg der NADH-Fluoreszenz, zunächst in den Bereichen, die am weitesten von der arteriellen Durchblutung waren. Beachten Sie die scharfen NADH GewebeGrenzen, die Grenzen des beobachtbaren Gewebe Sauerstoffdiffusion vertreten von der kortikalen Mikrozirkulation. Das Bild in Abbildung 3 zeigt die Geometrie der Sauerstoffdiffusion Grenzen umliegenden Hirngefäße. Es ist möglich, Krogh Walzendurchmesser dieser Grenzen abzuleiten, wie zuvor beschrieben ein. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3466/3466fig1.jpg" /> Abbildung 1. (A)-Maus mit Schädel-Fenster für die Bildgebung vorbereitet. (B) Abmessungen der Kopfplatte. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3466/3466fig2.jpg" /> Abbildung 2. Endogenen NADH grüne Fluoreszenz sichtbar gemacht mit Zwei-Photonen-Imaging durch kraniale Fenster, ca. 50 um unterhalb der Pia-Oberfläche. Die Blutgefäße werden visualisiert mit Texas Red Dextran. Sauerstoff in der Atemluft wurde auf 10% für 3 min reduziert und dann für 21% wiederhergestellt. Maßstab: 50 um. &lt;img alt = &quot;Bild 3&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3466/3466fig3.jpg&quot; /&gt; Abbildung 3. Geometrie der NADH Fluoreszenz Grenzen. Gelb zeigt Umriss Grenze von funktionellen Hypoxie; blaue Kreise zeigen projiziert Sauerstoff (Krogh) Zylindern. Blaue Linien zeigen Zylinderradien; Zahlen zeigen Radien in Mikrometern.

<ol>
	<li>Kasischke, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+NADH+imaging+exposes+boundaries+of+oxygen+diffusion+in+cortical+vascular+supply+regions.">Two-photon NADH imaging exposes boundaries of oxygen diffusion in cortical vascular supply regions.</a> J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 31, 68-81 (2011).</li><li>Ndubuizu, O., LaManna, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tissue+oxygen+concentration+measurements.">Brain tissue oxygen concentration measurements.</a> Antioxid. Redox. Signal. 9, 1207-1219 (2007).</li><li>Sharan, M., Vovenko, E. P., Vadapalli, A., Popel, A. S., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+theoretical+studies+of+oxygen+gradients+in+rat+pial+microvessels.">Experimental and theoretical studies of oxygen gradients in rat pial microvessels.</a> J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 28, 1597-1604 (2008).</li><li>Sakadzic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+high-resolution+measurement+of+partial+pressure+of+oxygen+in+cerebral+vasculature+and+tissue.">Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue.</a> Nat. Methods. 7, 755-759 (2010).</li><li>Vishwasrao, H. D., Heikal, A. A., Kasischke, K. A., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+dependence+of+intracellular+NADH+on+metabolic+state+revealed+by+associated+fluorescence+anisotropy.">Conformational dependence of intracellular NADH on metabolic state revealed by associated fluorescence anisotropy.</a> J. Biol. Chem. 280, 25119-25126 (2005).</li><li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex.">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 15741-15746 (1998).</li><li>Brown, W. R., Thore, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+cerebral+microvascular+pathology+in+ageing+and+neurodegeneration.">Review: cerebral microvascular pathology in ageing and neurodegeneration.</a> Neuropathol. Appl. Neurobiol. 37, 56-74 (2011).</li><li>de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+brain+microcirculation+may+trigger+Alzheimer's+disease.">Impaired brain microcirculation may trigger Alzheimer's disease.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 18, 397-401 (1994).</li><li>Brown, C. E., Boyd, J. D., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+in+vivo+imaging+reveals+balanced+and+branch-specific+remodeling+of+mature+cortical+pyramidal+dendritic+arbors+after+stroke.">Longitudinal in vivo imaging reveals balanced and branch-specific remodeling of mature cortical pyramidal dendritic arbors after stroke.</a> J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 30, 783-791 (2010).</li><li>Wilson, D. F., Erecinska, M., Drown, C., Silver, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oxygen+dependence+of+cellular+energy+metabolism.">The oxygen dependence of cellular energy metabolism.</a> Arch. Biochem. Biophys. 195, 485-493 (1979).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Eine hohe räumliche Auflösung Informationen über Sauerstoffdiffusion ist wichtig zu verstehen, wie Blutfluss im Gehirn reguliert wird, um Sauerstoff zu Gehirnzellen zu gewährleisten und metabolischen Bedarf zu decken. Traditionelle polarographischen Sauerstoff-Messungen mit Clark-Stil Glaselektroden sind sehr invasiv und haben eine geringe räumliche Auflösung und 3.2 signifikant (zweite Reihe) Reaktionszeit. Bisher ist die einzige nicht-invasive Methode zur Messung von pO 2 im Hirngewebe ist Phosphoreszenz Abschrecken, wo die Rate der Zerfall des angeregten Sonde ist proportional zur Sauerstoffkonzentration 4. Diese Methode liefert genaue Sauerstoffkonzentrationen, erfordert aber eine proprietäre Farbstoff und ein technisch ausgereiftes Phosphoreszenz Lifetime-Imaging-System. Hier zeigen wir ein übersichtlicher und einfacher Ansatz, der auf einem Standard-Zwei-Photonen-Imaging-System mit zwei flurescence Kanäle geleitet werden kann. Unser Ansatz nutzt eine intrinsische Gewebe ein Signal 5ND benötigt nur kontrastierende Darstellung der kortikalen Mikrozirkulation. Aufgrund der nicht-linearen, im wesentlichen binären Zunahme der Fluoreszenz bei NADH funktional Sauerstoffgrenzkonzentrationen 1, erhöhte intrinsische NADH Fluoreszenz nur in Bereichen mit hohem, metabolisch begrenzen Hypoxie beobachtet. Eine wichtige Folgerung ist, dass Gewebe Grenzen der Sauerstoffdiffusion aus kortikalen Mikrogefäße direkt von zylindrisch geformten Intensität Veränderungen der endogenen NADH Fluoreszenz zu beobachten. Wir bezeichnen diese Strukturen als Krogh Zylinder, weil der Begriff der zylindrisch geformte Strukturen, die das Volumen des oxygenierten umgebende Gewebe ein Blutgefäß durch definieren August Krogh eingeführt wurde, und wurde kürzlich experimentell beobachteten mit Zwei-Photonen-Imaging-NADH ein. Krogh Zylindern Bilder können in 3D, indem sie eine Z-Stapel von Bildrahmen gesammelt werden. Sie sind besonders deutlich in der Nähe des durchdringenden Arteriolen und sie sind nämlich kongruenth Kapillare erschöpft periarteriolären Gewebszylinder 1,4. Um eine objektive Bestimmung des Krogh Gewebe Zylinder Radius R (siehe Abschnitt 5.2) messen wir ihre radiale Pixelintensitätswerte innerhalb eines klar definierten Segment zwischen der Mitte des Zylinders und der äußeren Grenze mit dem Matlab-Funktion &quot;improfile&quot; bieten. Der äußere Rand des Segments sollte so gewählt werden mit einem Sicherheitsabstand über die sichtbare Grenze verlängert werden kann. Um das Signal-Rausch-Ebene zu verbessern averageed wir über alle radialen Linien benötigt, um den sichtbaren Zylinder Segment bei 1 °-Schritten zu decken. Die daraus resultierende mittlere radiale Intensitätsprofil innerhalb des Segments wiesen einen starken Anstieg, der auf den sichtbaren Gewebe-Grenze R entsprach. Die passten wir noch eine sigmoide Funktion (zB Boltzmann-Funktion) mit dem gemittelten radialen Intensitätsverlauf und nutzte seine Wendepunkt (auch als x 0 genannt) als eine Definition von R. Die entsprechenden zwei-pHoton Mikroangiographie (Texas-Rot) zeigte den Querschnitt eines einsamen zentrale Blutgefäß in der Mitte des Zylinders. Der Durchmesser des zentralen Blutgefäß direkt angewendet werden, um r zu bestimmen. Zwei-Photonen-Imaging-NADH bietet die gleiche räumliche Auflösung als die gleichzeitige hochauflösende Bildgebung der kortikalen Mikroangiographie. Ein wichtiges Merkmal für die quantitative Anwendung dieses Verfahrens ist, daß p 50 des NADH Fluoreszenzanstieg wurde gemessen, um von 3,4 sein ± 0,6 mm Hg 1 und dass die NADH-Fluoreszenzintensität als eine Funktion der mikroregionale Gewebe pO 2 kann mathematisch beschrieben werden eine sigmoidale Funktion. . Wir zeigen, dass diese Technik, um Brain Bereichen, die besonders anfällig für Hypoxie (durch Verringern Sauerstoffgehalt in der Luft um 10%) zu identifizieren. Wir zeigen auch, dass Sauerstoffdiffusion eine einfache geometrische perivaskuläre Muster folgt. Ein critschen Schritt dieses Verfahrens ist die Qualität des Schädelfenster Herstellung. Die Operation sollte nur geringe Schäden, um nicht den Blutfluss in den exponierten Bereich stören. Eine Sorge ist, dass in einer chirurgisch kompromittiert Vorbereitung, die Rinde unter dem Fenster kann hypoxischen zunächst unter Ausschluss irgendwelcher aussagekräftige Experimente. Ein gut vorbereiteter kranialen Fenster sollte intakt Dur-und Moll Blutgefäße mit lebendigen Blutfluss in allen Schiffstypen und ohne signifikante Blutungen entlang der Kanten auf. Unter normoxischen Bedingungen (PaO2 80-100 mmHg, Sp. 97-99% O2) das Hirnparenchym sollten einheitliche, homogene NADH Fluoreszenz ohne auffällige, helle Gewebe Patches mit erhöhten NADH Fluoreszenz zeigen. Eine grundlegende physikalische Beschränkung unseres Ansatzes ist Eindringtiefe begrenzt. Die blau-grüne NADH Fluoreszenz im Gehirn ist schnell gedämpft durch Hämoglobin-Absorption und Streuung Gewebe bei diesen Wellenlängen. Selbst mit hoher numerischer Apertur (z. B. 1,05) WasserImmersionsobjektive Zwei-Photonen-Imaging-NADH ist derzeit auf kortikalen Schichten I und II beschränkt. Diese Einschränkung ist wissenschaftlich relevant, weil Energiestoffwechsel in oder in der Nähe der weißen Substanz wird wahrscheinlich von grauen Substanz unterscheiden. Jedoch würde die Untersuchung der tiefen kortikalen Strukturen wie Schichten IV-VI oder subkortikalen Strukturen wie weißen Substanz oder im Striatum erfordern die Verwendung von spezialisierten Mikrolinsen wie bei der Maus in vivo Cortex 6 beschrieben. NADH-basierte Messung der Sauerstoffdiffusion Grenzen kann besonders nützlich sein, wenn sie mit anderen Messungen, wie Analysen der funktionellen Hyperämie, und den Nachweis von Kapillare Fluxraten 7 zusammengefasst. Zum Beispiel kann diese Technik geeignet ist, Hypoxie Schlaganfall und Alzheimer-Krankheit (AD)-Modelle zu visualisieren. Die einfache Geometrie der Sauerstoffdiffusion ermöglicht es, die Sauerstoff-Gradienten in mikrovaskulären Betten unter Umständen, wo Kapillardichte ist de vorherzusagenerhöhte 8 (z. B. AD 9) und zu prüfen, ob Hirngewebe Regionen mit reduzierter Kapillardichte ein erhöhtes Risiko für Schäden, die durch Hypoxie Mikrohüben sind. Die Fähigkeit, Bild microregionally ermöglicht es auch, die Geometrie und Größe des Gewebes Mikrohüben prüfen und zu bestimmen das Volumen des Gewebes, in dem Hypoxie auftritt, sowie die Beziehung zwischen Gewebehypoxie und nachfolgenden neuronalen Tod oder Umbau Kapillare 10. Schließlich, da Erhöhungen der endogenen NADH Fluoreszenz die direkte Folge der akuten mitochondriale Dysfunktion sind, erstellt diese Methode die Möglichkeit, NADH-Bildgebung als eine spezifische Reporter für neuronale Energiestoffwechsel 11 und einen Proxy für mitochondriale Dysfunktion zu verwenden. Zusammenfassend ist Zwei-Photonen-Imaging von endogenen NADH Fluoreszenz eine einfache, anspruchslose Tool, mit dem Sauerstoffversorgung und-verbrauch im Gehirn sowohl unter normalen verstehen kannund in pathologischen Zuständen.

<table border="1"><tbody><tr valign="top"><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Heizkissen </td><td> Jenseits von Bodi Hitze </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Augensalbe (Künstliche Tränen) </td><td> Pfizer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Povidon-Iod-Lösung 10% </td><td> Betadine </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Eisenchlorid 10% ige Lösung </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zement </td><td> Stoelting Unternehmen </td><td> 51456 </td><td></td></tr><tr><td> Cyanacrylat 454 </td><td> Loctite </td><td></td><td></td></tr><tr><td> aCSF </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 597316 </td><td></td></tr><tr><td> MicroTorque II Handstück Kit </td><td> Pearson </td><td> R14-0002 </td><td></td></tr><tr><td> IRF 007 Bohrer </td><td> Fine Science Tools </td><td> 19008-07 </td><td></td></tr><tr><td> Pinzetten # 5 </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11295 </td><td></td></tr><tr><td> Pinzetten # 5/45 </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11251-35 </td><td></td></tr><tr><td> # 0 Deckglas </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 63750-01 </td><td></td></tr><tr><td> Fotovervielfacherröhre </td><td> Hamamatsu </td><td> HC125-02 </td><td></td></tr><tr><td lang="it-IT" xml:lang="it-IT"> Ti: Saphir-Laser-Mai-Tai </td><td> Spectra-Physics </td><td> &amp;nbsp; </td><td></td></tr></tbody></table>

detection of microregional hypoxia in mouse cerebral cortex by two-photon imaging of endogenous nadh fluorescence

Die Fähigkeit des Gehirns, um auf einem hohen Niveau der metabolischen Funktion abhängig von der Nachfrage kontinuierliche Sauerstoffversorgung durch den Blutfluss und Gewebe Sauerstoffdiffusion. Hier präsentieren wir eine visualisierte experimentellen und methodischen Protokoll direkt sichtbar mikroregionale Gewebehypoxie und perivaskuläre Sauerstoff Gradienten in der Maus Cortex abzuleiten. Es ist auf dem nicht-lineare Beziehung zwischen Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH) endogenen Fluoreszenzintensität und Sauerstoff-Partialdruck in dem Gewebe, wo das Gewebe NADH-Fluoreszenz abrupt am Gewebe Sauerstoff unter 10 mmHg 1 beobachtet bezogen. Wir verwenden zwei-Photonen-Anregung bei 740 nm, die für die gleichzeitige Anregung der intrinsischen Fluoreszenz NADH Gewebe und Blutplasma mit Texas-Red Dextran gegenübergestellt werden können. Die Vorteile dieses Verfahrens gegenüber bestehenden Ansätzen gehören die folgenden: es nutzt eine intrinsische Gewebe Signal und kann mit Standard-Zwei-Photonen in vivo im werdenAltern wird gebraucht und es erlaubt eine kontinuierliche Überwachung im gesamten Sichtfeld mit einer Tiefenauflösung von ~ 50 um. Wir zeigen, dass Hirngewebe Bereichen am weitesten von zerebralen Blutgefäße gefährdete Gebiete, die Wasserscheide der Erste, der sich funktionell hypoxischen nach einem Rückgang in der vaskulären Sauerstoffversorgung sind entsprechen. Diese Methode erlaubt es, Bild mikroregionale kortikaler Oxygenierung und ist daher nützlich für die Überprüfung der Rolle der Unangemessenheit oder des eingeschränkten Sauerstoffversorgung im Gewebe neurovaskulären Erkrankungen und Schlaganfall.

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Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Hier beschreiben wir eine Methode, um direkt zu visualisieren mikroregionale Gewebehypoxie in der Maus Kortex<em&gt; In-vivo-</em&gt;. Es wird auf gleichzeitigen Zwei-Photonen-Bildgebung von Nicotinamidadenindinucleotid (NADH) und der kortikalen Mikrozirkulation bezogen. Diese Methode eignet sich für hochauflösende Analyse von Gewebe-Sauerstoffversorgung.

Erkennung von mikroregionale Hypoxie in Maus-Großhirnrinde Zwei-Photonen-Imaging von endogenen NADH Fluoreszenz

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

detection-microregional-hypoxia-mouse-cerebral-cortex-two-photon

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.0K Aufrufe.  University of Rochester Medical Center. Hier beschreiben wir eine Methode, um direkt zu visualisieren mikroregionale Gewebehypoxie in der Maus Kortex In-vivo-. Es wird auf gleichzeitigen Zwei-Photonen-Bildgebung von Nicotinamidadenindinucleotid (NADH) und der kortikalen Mikrozirkulation bezogen. Diese Methode eignet sich für hochauflösende Analyse von Gewebe-Sauerstoffversorgung.

Serie: Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

In-vivo-Imaging von der Maus Spinal Cord mit Zwei-Photonen-Mikroskopie

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

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In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo Zwei-Photonen-Imaging Of Experience-abhängigen molekularen Veränderungen in kortikalen Neuronen

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Zwei-Photonen-<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging von dendritischen Dornen in der Maus Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Zwei-Photonen-Imaging von Zelluläre Dynamik in der Maus Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Die gleichzeitige Zwei-Photonen<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging der synaptischen Eingänge und Postsynaptische Targets in der Maus retrosplenialen Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

Die Quantifizierung der zerebrale vaskuläre Architektur unter Verwendung von Zwei-Photonen-Mikroskopie in einem Mausmodell der HIV-induzierten Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Zwei-Photonen-Kalzium Imaging in neuronalen Dendriten in Hirnschnitten

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Zwei-Photon Imaging der kortikalen Neuronen bei Neugeborenen Mäusen

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Transpupille Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal excitability. Recent studies have revealed the differential gene expression and functional heterogeneity of microglia in different brain regions. The unique functions of the hippocampal neural network in learning and memory may be associated with the active roles of microglia in synapse remodeling. However, inflammatory responses induced by surgical procedures have been problematic in the two-photon microscopic analysis of hippocampal microglia. Here, a method is presented that enables the chronic observation of microglia in all layers of the hippocampal CA1 through an imaging window. This method allows the analysis of morphological changes in microglial processes for more than 1 month. Long-term and high-resolution imaging of the resting microglia requires minimally invasive surgical procedures, appropriate objective lens selection, and optimized imaging techniques. The transient inflammatory response of hippocampal microglia may prevent imaging immediately after surgery, but the microglia restore their quiescent morphology within a few weeks. Furthermore, imaging neurons simultaneously with microglia allows us to analyze the interactions of multiple cell types in the hippocampus. This technique may provide essential information about microglial function in the hippocampus.

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

This paper describes a method for chronic in vivo observation of the resting microglia in the mouse hippocampal CA1 using precisely controlled surgery and two-photon microscopy.