Und dem Tri-institutionellen Stammzellen-Initiative (Starr-Stiftung); Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium für fortgeschrittene Forschende des Schweizerischen Nationalfonds und durch Zuschüsse aus NYSTEM (C026447 C026446) unterstützt.

1. Herstellung von Nährmedien, beschichtetes Geschirr und Wartung von hPSCs 1.1 Medien-Vorbereitung Hinweis: Filtern Sie alle Medien für die Sterilisation und bei 4 ° C im Dunkeln bis zu 2 Wochen. Reagenz Namen, Firmen-und Katalognummern werden in der Werkstoff-Tabelle aufgeführt. <ol><li> DMEM/10% FBS: Kombinieren 885 ml DMEM, 100 ml FBS, 10 ml Pen / Strep und 5 ml L-Glutamin. </li><li> HES-Medium: Kombinieren 800 ml DMEM/F12, 200 ml KSR, 5 ml L-Glutamin, 5 ml Pen / Strep, 10 ml MEM Mindest essentiellen Aminosäuren-Lösung, 1 ml β-Mercaptoethanol. Werden 10 ng / ml FGF-2 nach dem Filtern des Mediums. ACHTUNG: β-Mercaptoethanol ist giftig, das Einatmen, Verschlucken und Hautkontakt. </li><li> KSR-Differenzierungsmedium: Kombinieren 820 ml Knockout DMEM, 150 ml KSR, 10 ml L-Glutamin, 10 ml Pen / Strep, 10 ml MEM Mindest essentiellen Aminosäuren-Lösung und 1 ml β-Mercaptoethanol. </li><li> N2-differentiatiauf mittel: Lösen Sie 12 g Pulver in DMEM/F12 980 ml ​​dH 2 O, 1,55 g Glucose hinzuzufügen, 2 g Natriumbicarbonat und 100 mg APO menschliches Transferrin. Mix 2 ml dH 2 O mit 25 mg Humaninsulin und 40 ul 1 N NaOH, die aufgelöste Lösung für das Medium. 100 l Putrescin-dihydrochlorid, 60 ul Selenit, 100 ul Progesteron und bringe das Volumen auf 1 L mit dH 2 O. </li></ol> 1.2 Beschichtung der Kulturschalen <ol><li> Matrigel-Beschichtung: Tauwetter 1 ml eingefroren Matrigel aliquoten durch Pipettieren von 19 ml DMEM/F12 über den aliquoten bis es sich aufgelöst hat. Klumpen entfernen, indem man es durch ein 40 um-Sieb und Zellplatte 8 ml/10 cm Schüssel. Geschirr Inkubation für 1 h bei RT. Saugen Sie den Matrigel unmittelbar vor dem Ausplattieren der Zellen. Hinweis: schnell arbeiten mit Matrigel, da es bei Temperaturen über 4 ° C verklumpen </li><li> PO / Lam / FN-Beschichtung: 10 ml 1x PBS mit 15 ug / ml Poly-L-Ornithin Hydrobromid auf eine 10 cm-Schale. Inkubieren Sie die Schale über Nacht bei 37 ° C Waschen Platten mit 1x PBS einmal und fügen 10 ml/10 cm Schale aus 1x PBS mit 2 ug / ml Maus-Laminin-I und 2 pg / ml Fibronektin. Die Gerichte Inkubation über Nacht bei 37 ° C Vor der Beschichtung der Zellen, die Lösung vollständig zu entfernen und lassen die Platten gründlich trocknen bei RT für 15-20 min durch Stehen sie bis auf die Gewebekultur Haubenwand ohne den Deckel auf. Hinweis: Die Gerichte völlig trocken und bereit für die Zellbeschichtung, wenn man Kristallstrukturen auf der Oberfläche (sichtbar durch das Auge) zu sehen. Die Platten können bei Raumtemperatur für einige Stunden in diesem trockenen Zustand gehalten werden. PO / Lam / FN Gerichte haben bis 2 Tage vor der Zeit vorbereitet werden. In Notfällen können Lam / FN für nur 2-4 Stunden inkubiert werden. Dies kann jedoch suboptimal Differenzierung / Überlebensergebnisse riskieren. </li></ol> 1.3 Wartung von hPSCs Hinweis: hPSCs auf 0,1% Gelatine und mitotisch inaktivierten embryonalen Maus-Fibroblasten (M gehaltenEF) im HES-Medium, ergänzt mit 10 ng / ml FGF-2, wie zuvor beschrieben 10,12. Die Zellen sollten alle 6-8 Tage aufgeteilt werden. <ol><li> Mantel eine 10-cm-Spiegel mit 8 ml 0,1% Gelatine (in 1x PBS ohne Magnesium oder Calcium) bei RT für 5 min. </li><li> Tauen Sie gefrorene MEFs schnell in einem 37 ° C Wasserbad. In 1 Million MEFs auf 10 ml DMEM/10% FBS. </li><li> Saugen Sie die Gelatine und die Platte die Zellen. Inkubieren bei 37 ° C für mindestens 6 Stunden. </li><li> Saugen Sie den DMEM/10% FBS aus dem vorbereiteten MEF Platte, Waschplatte mit 1x PBS und einmal mit 10 ml HES-Medium mit 10 uM Y-27632-dihydrochlorid ergänzt. Das Medium zum Aufwärmen bei 37 ° C für 20 min. Anmerkung: Für die manuelle Aufspaltung hPSCs einer Steril mit einem eingebetteten Mikroskop verwendet wird. Jedoch können die Zellen unter Verwendung von geeigneten alternativen Verfahren passagiert werden. </li><li> Unter einer Steril mit einem eingebetteten Mikroskop lösen einzelnen Kolonien mit einem Zellheber und lassen Sie sie schweben. </li><li> Verwenden Sie ein1-ml-Spritze, um die schwimmende Kolonien absaugen und versenden Sie sie auf den frischen, warmen MEF Platte. Übertragen etwa ein Viertel der Zellen in die neue Schale. Bei 37 ° C. </li><li> Feed-Zellen täglich mit frischen HES Medium. </li></ol> 2. Überzug von hPSCs für Differenzierung Hinweis: hPSCs aufgeteilt werden soll oder überzogen für die Differenzierung, wenn die Kolonien groß sind, aber immer noch scharfe Kanten haben, mit so wenig wie möglich zu differenzierenden Zellen an ihren Grenzen (siehe Abbildung 1B). Wenn die Zellen unter Verwendung manueller Passage aufrechterhalten die Kolonien groß genug, um leicht mit dem Auge gesehen werden kann. Um das richtige Gefühl für diese Zeit Punkt kann man einen separaten hpSC Gericht für zwei Wochen ohne Passagieren warten und beobachten, wie die Zellen zu erreichen und geben den idealen Zeitpunkt für die Passage / zu differenzieren sind. <ol><li> Bereiten 10 cm Gerichte mit Matrigel 1 Stunde vor Beginn der Differenzierung. Erfolgreiche Matrigel Beschichtung kannmit 4-facher Vergrößerung überprüft. </li><li> Wenn die hPSCs bereit sind, aufgeteilt werden, saugen Sie den mittel-und 4 ml 0,05% Trypsin-EDTA zu den Zellen. </li><li> Schütteln Sie die Schüssel horizontal für 2 min kräftig, bis man die MEFs als Einzelzellen Abheben der Platte unter dem Mikroskop zu sehen. Die hpSC Kolonien bleiben als Kolonien befestigt. </li><li> Sofort und gründlich absaugen Trypsin und lassen die Platte stehen bei RT für 2-4 min. </li><li> 2 ml HES-Medium auf die Platte und mit einer Pipette P1000, nehmen die Zellen. Hinweis: Wenn die Zellen nicht von der Oberfläche leicht angehoben werden, kann die Platte leer bei RT für weitere 2-3 min inkubiert werden. </li><li> Übertragen Sie die Zellen, die 8 ml HES-Medium mit 10 uM Y-27632-dihydrochlorid ergänzt. </li><li> Saugen Sie den Matrigel aus einer zuvor hergestellten 10 cm Schüssel. Platte die Zellen in einem Verhältnis 1:1 oder 1:2 (zum Beispiel: Die Zellen aus einem 10-cm-Spiegel sind in zwei 10 cm-Schalen aufgeteilt) auf die Matrigel Platte. Bei 37 °C über Nacht. Hinweis: Diese Beschichtung sollte in etwa 100.000 Zellen / cm 2 führen. </li></ol> 3. Induktion der Differenzierung Neural Hinweis: Die Differenzierung eingeleitet (Tag 0), wenn die Zellen 90-100% konfluent (siehe Fig. 1C), üblicherweise am folgenden Tag. Wenn der genaue Konfluenz noch nicht erreicht ist, können die Zellen täglich mit HES-Medium zugeführt werden, bis sie bereit zur Differenzierung. Alternativ kann die Anfangszahl der plattierten Zellen erhöht werden. <ol><li> Am Tag 0 bis 3, füttern die Zellen täglich mit 10 ml/10 cm austeilen KSR-Differenzierungsmedium mit 0,1 uM LDN193189 und 10 uM SB431542. </li><li> Am Tag 4 und 5 Futter die Zellen mit 75% KSR-Differenzierungsmedium und 25% N2-Differenzierungsmedium enthält sowohl LDN193189 und SB431542. </li><li> Am Tag 6 und 7 Futter die Zellen mit 50% KSR-Differenzierungsmedium und 50% N2-Differenzierungsmedium sowohl LDN193189 und SB4 enthalten31542. </li><li> Am Tag 8 und 9 Futter die Zellen mit 25% KSR-Differenzierungsmedium und 75% N2-Differenzierungsmedium enthält sowohl LDN193189 und SB431542. </li><li> Am Tag 9 und 10 bereiten PO / Lam / FN Gerichte wie in 1.2.2 für Replattierung der Zellen am Tag 11 angedeutet. </li><li> Am Tag 10 Futterzellen mit N2-Differenzierungsmedium enthält LDN193189 und SB431542. </li></ol> 4. Replattierung in Tröpfchen für NC-Daten <ol><li> Am Tag 11 absaugen Lam / FN von den zuvor hergestellten Platten und sie vollständig trocknen bei RT für 20-30 min, wie in 1.2.2 erläutert zu lassen. </li><li> Entfernen Sie das Medium aus den differenzierenden Zellen, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS und 1x 8 ml accutase/10 cm Schüssel. Inkubation für 20 min bei 37 ° C. </li><li> Die Verwendung eines Handys Heber, nehmen die Zellen und resuspendieren sie in Accutase mit einer 5 ml Pipette. Die Suspension in einem 15-ml-Tube. </li><li> 5 ml 1 × PBS und drehen die Zellen 5 min bei 114 x g. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 10 ml 1x PBS. Um eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten, filtern sie durch eine 40 um Zellsieb und zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer oder gleichwertige Technik. </li><li> Dreh die Zellen nach unten und resuspendieren sie in N2-Differenzierungsmedium, das 200 uM Ascorbinsäure (AA), 20 ng / ml BDNF, 100 ng / ml FGF8, 20 ng / ml SHH, 10 uM Y-27632 Dihydrochlorid bei der Konzentration von 100.000 -150.000 Zellen/10 ul. </li><li> Mit ein Wiederholungs-Pipetten, Platte 10 ul Tröpfchen nahe beieinander, ohne sie zu berühren auf die getrocknete PO / Lam / FN 15 cm Gerichte. Hinweis: Ein 10-cm-Spiegel von differenzierten Zellen führt in der Regel etwa 2-3 mal 15 cm Geschirr oder ca. 100 x 10 cm ul droplets/15 Gericht. </li><li> Lassen Sie die Tropfen stehen bei RT für 20-30 min, dann sehr vorsichtig (nicht zu stören die Tropfen) 30 ml N2/AA/BDNF/FGF8/SHH/Y und bei 37 ° C </li><li> Am Tag 12 sorgfältig füttern die Zellen mit 20 ml/15 cm Schale N2/AA/BDNF/FGF8/SHH. </li><li> Von day 14-17 füttern die Zellen jeden zweiten oder dritten Tag mit N2/AA/BDNF/FGF8. </li><li> Am Tag 16 und 17 vorzubereiten PO / Lam / FN Platten NC-Zellen nach FACS-Sortierung Ausstrich. </li></ol> 5. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) von NC-Zellen Anmerkung: Die Vorbereitung der Zellen für die FACS erfordert etwa 2 Stunden. <ol><li> Am 18. Tag entfernen Medium, waschen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS in die Schüssel und fügen Sie 12 ml Accutase. Die Zellen für 20 min bei 37 ° C. </li><li> Die Verwendung eines Handys Heber, nehmen die Zellen von der Oberfläche und lassen Sie sie schweben. Pipettieren Sie die Zellen in Suspension mit einer 5 ml Pipette, übertragen Sie sie auf einer 50-ml-Tube und 30 ml 1x PBS. Dreh die Zellen 5 min bei 114 x g. </li><li> Verwendung einer P1000-Pipette resuspendiert die Zellen in 1 ml 2% FBS / HBSS (HBSS enthält 15 mM HEPES). Hinzufügen von 19 ml 2% FBS / HBSS, und die Zellen filtriert durch ein 40 &amp;mgr; m Zellsieb um eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten. Die Zellen auf Eis inkubieren 15 min für die Antikörper-Blocking und dann zählen sie mit einer Zählkammer. </li><li> Dreh die Zellen nach unten und wieder zu suspendieren sie bei der Konzentration von 10 Millionen Zellen / ml in 2% FBS / HBSS. </li><li> Beiseite 1 Million Zellen, die jeweils für die ungefärbten, single-gefärbt (HNK-1 nur und nur p75) und sekundären Antikörper gefärbt nur (APC nur und nur 488) FACS steuert. </li><li> In 5 ul der HNK-1 und 5 ul p75 primären Antikörper pro 10 Millionen Zellen in 1 ml Suspension auf die richtigen Proben und Inkubation für 20 min auf Eis. </li><li> Waschen der Zellen in 10 ml 1x PBS (Zentrifuge 5 min bei 114 × g) und Resuspendieren der Zellen in 1 ml 2% FBS / HBSS. In 2 ul APC und 1 ul von 488 sekundären Antikörper pro 10 Millionen Zellen in 1 ml Suspension auf die richtigen Proben und Inkubation für 20 min auf Eis im Dunkeln. Hinweis: APC und 488 sind die sekundären Antikörper verwendet hier für das HNK-1-und p75-Färbung auf. </li><li> Die Zellen werden in 10 ml 1x PBS zweimal resuspendiert 10 Millionen Zellen in 500 &amp;mgr; l2% FBS / HBSS mit DAPI (0,5 ng / ul) oder alternativ entsprechende Live-Cell-Fleck auf toten Zellen von der FACS-Analyse auszuschließen. </li><li> Übertragen Sie die Proben auf FACS-Röhrchen eignen. </li><li> Bereiten FACS-Röhrchen mit 0,5 ml 2% FBS / HBSS für Zellsammlung. Hinweis: Die Zellen und das Entnahmeröhrchen auf Eis im Dunkeln während des Sortier Zeit gehalten. </li><li> Mit Hilfe eines Zellsortiermaschine mit Laser, die DAPI, APC und 488 sortieren DAPI-/HNK-1 + / P75 + doppelt positiven Zellen erkennen kann. Hinweis: Zubereitungszeit und die Handhabung der Zellen führt zu einem geringen Prozentsatz des Zelltods, ermöglicht DAPI Flecken toten Zellen und damit nur diese Zellen aus der sortierten Population auszuschließen. Jede Alternative Live / Dead-Färbung funktioniert genauso gut für diesen Zweck. DAPI selbst nicht Zytotoxizität verursachen in der Live-Zellpopulation. </li></ol> 6. Replattierung der sortierten Zellen, NC Wartung und Erweiterung Hinweis: FACS sortierten Zellen sollten Hand seinführte mit besonderer Sorgfalt, um eine optimale Überleben zu sichern. Halten Sie sie auf Eis, bis sie Neubelegung. Vortexen nicht oder pipettieren sie barsch. Die Zellen können durch Schwenken der Röhre resuspendiert werden. <ol><li> Nach FACS-Sortierung, zählen die NC-Zellen, dann drehen sie auf und resuspendieren in N2-Differenzierungsmedium mit 10 ng / ml FGF2, 20 ng / ml EGF und 10 uM Y-27632 dihydrochlorid in dem Volumen und gegebenenfalls ergänzt, um sie bei 30.000 Zellen Ausstrich / 10 ul Tröpfchen. </li><li> Gründlich trocken zuvor hergestellten PO / Lam / FN-Platten und Platten etwa 50-70 Tropfen pro 10 cm Schale. Lassen Sie die Gerichte stehen bei RT für 20-30 min. </li><li> 20 ml/10 cm Gericht N2/FGF2/EGF/Y-27632 Sehr vorsichtig hinzufügen, ohne die Tropfen zu stören. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C. </li><li> Füttern Sie die Zellen alle 2-3 Tage mit N2/FGF2/EGF. Hinweis: NC-Zellen erweitert oder agiert etwa alle 4-5 Tage oder, wenn sie beginnen häufen sich in den Tröpfchen. </li><li> Um Durchgang die NC-Zellen, entfernen Sie das Medium, wash die Zellen einmal mit PBS und 1x 8 ml accutase/10 cm Schüssel. Inkubation für 20 min bei 37 ° C. </li><li> Pipettieren Sie die Zellen von der Platte mit einer 5 ml Pipette und übertragen Sie sie auf einem 15-ml-Tube. In 6 ml 1x PBS. </li><li> Dreh die Zellen 5 min bei 114 x g. </li><li> Resuspendieren der Zellen in N2-Differenzierungsmedium mit 10 ng / ml FGF2, 20 ng / ml EGF und 10 uM Y-27632-dihydrochlorid um 20.000 Zellen/10 ul Tröpfchen ergänzt haben. </li><li> Ausstrich die Zellen in 10 ul Tröpfchen auf getrocknet PO / Lam / FN-Platten. Lassen Sie die Gerichte stehen bei RT für 20-30 min. </li><li> Vorsichtig 20 ml/10 cm Gericht N2/FGF2/EGF/Y-27632. Bei 37 ° C. Anmerkung: NC-Zellen aufrechterhalten oder für bis zu 2 Wochen als relativ homogene Vorläuferpopulation expandiert werden. Längere Kultur kann dazu führen, in diverse Nachkommen Zelltypen differenzieren. </li></ol>

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offen zu legen.

Für die erfolgreiche Differenzierung von R-NC-Zellen, die aus menschlichen embryonalen Stammzellen / hiPSCs die folgenden Überlegungen sollten gemacht werden. Es ist kritisch, unter sterilen Kulturbedingungen jederzeit arbeiten. Insbesondere ist es wichtig, hpSC Kulturen für Mykoplasmen regelmäßig zu prüfen, da diese Kontamination erfolgreich Differenzierung behindern, aber nicht ohne weiteres visuell in hpSC Kulturen. Die R-NC Differenzierung sollte bei 90-100% Zelldichte eingeleitet werden; niedriger Zelldichte ...

Menschliche embryonale Stammzellen (hES) und humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) haben immense Potenzial gezeigt, insbesondere für die Untersuchung und die künftige Behandlung von Krankheiten des Menschen, für die weder gut noch Tiermodellen primären Gewebe zur Verfügung. Anwendungsbeispiele für den HES / hiPSC Technologie sind die folgenden: Zellen von besonderem Interesse kann von hESC / hiPSCs für die regenerative Medizin in unbegrenzter Menge 1 erzeugt werden. Zellen von Patienten, die eine spezifische Krankheit hergestellt und verwendet, um in vitro Krankheitsmodellen 2,3 einzurichten. Solche Krankheitsmodelle können dann für große Wirkstoff-Screening auf der Suche nach neuer Wirkstoffe 4 sowie die Prüfung vorhandener Arzneimittel auf Wirksamkeit und Toxizität 5 eingesetzt werden. In-vitro-Krankheitsmodelle können zur Identifikation von neuen Krankheitsmechanismen führen. Für alle Anwendungen der HES / iPS-Technologie ist es wichtig, mit spezifischen arbeiten, gut zu definierenin der Krankheit von Interesse betroffen d Zelltypen. So ist die Verfügbarkeit von festen und reproduzierbare in vitro Differenzierung Protokolle von entscheidender Bedeutung für alle Anwendungen der hESC / hiPSC Technologie. Protokolle sind wünschenswert, die minimale Variabilität, Zeitaufwand, Mühe, Schwierigkeiten und Kosten sowie maximale Reproduzierbarkeit unter hESC / hiPSC Linien und verschiedene Forscher zeigen. Neuralleiste (NC)-Zellen entstehen während der Wirbel Neurulation zwischen der Epidermis und dem neuronalen Epithel. Sie vermehren sich und wandern weitgehend in den sich entwickelnden Embryo und führen zu einer beeindruckenden Vielfalt der Nachkommen Zelltypen, einschließlich Knochen / Knorpel, kraniofazialen Skeletts, sensorische Nerven, Schwann-Zellen, die Melanozyten, glatte Muskelzellen, enterischen Neuronen, autonome Nervenzellen, chromaffinen Zellen , Herzscheidewand-Zellen, Zähne und Nebennieren / Schilddrüsenzellen 6. Somit NC-Zellen sind eine attraktive Zelltyp für die Stammzellfeld und wichtig für dieModellierung einer Vielzahl von Erkrankungen, wie Morbus Hirschsprung 7, familiärer Dysautonomie 8 sowie Krebserkrankungen, wie Neuroblastomen 9. Darüber hinaus bieten sie die Möglichkeit, Aspekte der menschlichen Embryonalentwicklung in vitro zu studieren. Die derzeit verfügbaren und weit in vitro Differenzierung Protokoll für die Ableitung von NC-Zellen von hES 10,11 aufgebracht erfordert bis zu 35 Tage der Differenzierung und es beinhaltet neurale Induktion auf Stromazellen Feeder-Zellen, wie Zellen, MS5 und somit schlecht unter definierten Bedingungen durchgeführt. Zwar kann es sein skaliert, um große Mengen von NC-Zellen zu erzeugen, beispielsweise zum Hochdurchsatz-Wirkstoff-Screening-4 erforderlich ist, ist dieser arbeits-und kostenintensiv. Darüber hinaus geht es um Hand Passagieren neuronaler Rosetten, die schwer zu reproduzieren können und damit unterliegt der Gesamtvariabilität, insbesondere, wenn es um eine Vielzahl von menschlichen embryonalen Stammzellen oder hiPSC angewendet wirdLinien. Hier wird die schrittweise Ableitung NC-Zellen in einem 18-Tage-Protokoll, das frei von Feederzellen ist gezeigt. Dieses Verfahren ist kürzer und definiert als das aktuell verwendete Protokoll. Darüber hinaus ist es sehr robust bei der Erzeugung NC-Zellen unter verschiedenen hiPSC Linien. Wichtig ist, wird gezeigt, dass die NC-Zellen durch beide Protokolle ergab entstehen an der Grenze von neuralen Rosetten (im Folgenden als Rosette-NC oder R-NC). Die Verwendung eines der beiden Protokolle abgeleiteten Zellen morphologisch identisch aussehen, können sie die gleichen NC-Marker exprimieren und Cluster zusammen in der Microarray-Analyse. NC-Zellen mit dem neuen Protokoll (R-NC) abgeleitet sind funktional, ähnlich wie NC-Zellen mit dem alten Protokoll (MS5-R-NC), so dass sie wandern können und weiter zu differenzieren zu Neuronen abgeleitet. Daher können die Zellen gleichzeitig mit den MS5-R-NC-Zellen verwendet werden. Die R-NC-Zelle-Protokoll für die Ableitung von NC-Zellen, die aus menschlichen embryonalen Stammzellen / iPS nützlich für alle Anwendungen der HES / iPS-Technologie, die die NC-Linie sein. &lt;/ P&gt;

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:897px;" width="897">
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		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM/F12</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Knockout Serum Replacement</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Lot should be tested</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicinlin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEM minimum essential amino acids solution&#160;</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>21985-023</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Recombinant human FGF basic (FGF2)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>233-FB-001MG/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Knockout DMEM</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>10829-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM/F12 powder&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12500-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Bicarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">APO human transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human insulin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Putriscine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrigel matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Poly-L Ornithin hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mouse Laminin-I</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3400-010-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fibronectin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dispase in Hank&#39;s Balanced Salt Solution 5U/ml</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris-R&#38;D Systems</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LDN193189</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SB431542</td>
			<td>Tocris-R&#38;D Systems</td>
			<td>1614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ascorbic Acid&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BDNF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>248-BD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FGF8</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>423-F8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>464SH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>14170-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>1563-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human recombinant EGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">gelatin (PBS without Mg/Ca)</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6680-100TST</td>
			<td>lot should be tested</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor)</td>
			<td>Advanced Targeting Systems</td>
			<td>AB-N07</td>
			<td>lot should be tested</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">APC rat anti-mIgM</td>
			<td>BD Parmingen</td>
			<td>550676</td>
			<td>lot should be tested</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21121</td>
			<td>lot should be tested</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti Oct4 mIgG2b (used at 1:200 dilution)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-5279</td>
			<td>lot should be tested</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Material/Equipment:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial)</td>
			<td>GlobalStem</td>
			<td>GSC-6105M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture dishes: 10cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes,&#160; pipetts, pipet tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass hematocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture laminar flow hood with embedded microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture biosafety hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell sorting machine, i.e. MoFlo</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Inverted microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 ml TB syringe 27Gx1/2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell lifter Polyethylene</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

feeder-free derivation of neural crest progenitor cells from human pluripotent stem cells

Menschen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) haben ein großes Potenzial für die Untersuchung menschlichen embryonalen Entwicklung, für die Modellierung menschlichen Krankheiten in die Schüssel und als eine Quelle von transplantierbaren Zellen für regenerative Anwendungen nach der Krankheit oder Unfälle. Neuralleiste (NC)-Zellen sind die Vorläufer für eine Vielzahl von adulten somatischen Zellen, wie Zellen des peripheren Nervensystems und Glia, Melanozyten und mesenchymalen Zellen. Sie sind eine wertvolle Quelle der Zellen, um Aspekte der menschlichen embryonalen Entwicklung, einschließlich Zellschicksal Spezifikation und Migration zu untersuchen. Eine weitere Differenzierung der NC-Vorläuferzellen in terminal differenzierten Zelltypen bietet die Möglichkeit, menschliche Krankheiten zu modellieren in vitro untersuchen Krankheitsmechanismen und erzeugen Zellen für die regenerative Medizin. Dieser Artikel stellt die Anpassung eines derzeit in vitro Differenzierung Protokoll für die Ableitung von NC-Zellen aus hPSCs. Dieses neue Protokoll erfordert 18 Tagen unterschiedrentiation ist Feeder-frei, einfach skalierbare und hoch reproduzierbare unter humanen embryonalen Stammzellen (hES) Linien sowie menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) Linien. Beide alten und neuen Protokolle ergeben NC-Zellen gleicher Identität.

Die beiden wichtigsten Verbesserungen der R-NC-Protokoll über die MS5-R-NC-Protokoll 11 der Feeder-frei, definiert Differenzierungsbedingungen und die allgemeine Verkürzung der Zeitbedarf. MS5 Feeder-Zellen sind 13 Maus-Knochenmark-abgeleiteten Stromazellen, die gezeigt haben, neuronale Differenzierung von hES-Zellen 14 zu unterstützen. HESCs kultiviert auf MS5 Feeder-Zellen bei einer Dichte Form epithelialen Strukturen niedrig und neuronalen Rosetten 15, an der Peripherie ...

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Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Neuralleiste (NC)-Zellen aus humanen pluripotenten Stammzellen (hpSC) abgeleitet haben ein großes Potenzial für die Modellierung menschlichen Entwicklung und Krankheit und für die Zell-Ersatz-Therapien. Hier ein Feeder-freie Adaption des derzeit weit verbreitet<em&gt; In-vitro-</em&gt; Differenzierungsprotokoll für die Ableitung von NC-Zellen aus hPSCs dargestellt.

Feeder freie Ableitung von Neural Crest Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

feeder-free-derivation-neural-crest-progenitor-cells-from-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.1K Aufrufe.  Sloan-Kettering Institute for Cancer Research. Neuralleiste (NC)-Zellen aus humanen pluripotenten Stammzellen (hpSC) abgeleitet haben ein großes Potenzial für die Modellierung menschlichen Entwicklung und Krankheit und für die Zell-Ersatz-Therapien. Hier ein Feeder-freie Adaption des derzeit weit verbreitet In-vitro- Differenzierungsprotokoll für die Ableitung von NC-Zellen aus hPSCs dargestellt.

Serie: Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

Neural-Colony Forming Zell-Assay: Ein Test zur Bona Fide neuralen Stammzellen aus neuralen Vorläuferzellen Discriminate

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Forschung

Neurowissenschaften

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-Cell-Imaging von Sinnesorgan Vorläuferzellen im Intact Drosophila Puppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a well-characterized niche for adult stem cells1. This segment of the outer root sheath contains a number of different types of stem cells, including epithelial stem cells2, melanocyte stem cells3 and neural crest like stem cells4-7. Hair follicles represent an accessible and rich source for different types of human stem cells. We and others have isolated neural crest stem cells (NCSCs) from human fetal and adult hair follicles4,5. These human stem cells are label-retaining cells and are capable of self-renewal through asymmetric cell division in vitro. They express immature neural crest cell markers but not differentiation markers. Our expression profiling study showed that they share a similar gene expression pattern with murine skin immature neural crest cells. They exhibit clonal multipotency that can give rise to myogenic, melanocytic, and neuronal cell lineages after in vitro clonal single cell culture. Differentiated cells not only acquire lineage-specific markers but also demonstrate appropriate functions in ex vivo conditions. In addition, these NCSCs show differentiation potential toward mesenchymal lineages. Differentiated neuronal cells can persist in mouse brain and retain neuronal differentiation markers. It has been shown that hair follicle derived NCSCs can help nerve regrowth, and they improve motor function in mice transplanted with these stem cells following transecting spinal cord injury8. Furthermore, peripheral nerves have been repaired with stem cell grafts9, and implantation of skin-derived precursor cells adjacent to crushed sciatic nerves has resulted in remyelination10. Therefore, the hair follicle/skin derived NCSCs have already shown promising results for regenerative therapy in preclinical models.
Somatic cell reprogramming to induced pluripotent stem (iPS) cells has shown enormous potential for regenerative medicine. However, there are still many issues with iPS cells, particularly the long term effect of oncogene/virus integration and potential tumorigenicity of pluripotent stem cells have not been adequately addressed. There are still many hurdles to be overcome before iPS cells can be used for regenerative medicine. Whereas the adult stem cells are known to be safe and they have been used clinically for many years, such as bone marrow transplant. Many patients have already benefited from the treatment. Autologous adult stem cells are still preferred cells for transplantation. Therefore, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin/hair follicles are a valuable source for regenerative medicine.

This article presents a robust protocol for isolation and culture of neural crest stem cells from human hair follicles.

Isolation und Kultur von Neural Crest Stem Cells aus menschlichen Haarfollikeln

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

Effiziente Ableitung von humanen neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The differentiation process is initiated by breaking the human PSCs into clumps which round up to form aggregates when the cells are placed in a suspension culture. The aggregates are then grown in hESC medium from days 1-4 to allow for spontaneous differentiation. During this time, the cells have the capacity to become any of the three germ layers. From days 5-8, the cells are placed in a neural induction medium to push them into the neural lineage. Around day 8, the cells are allowed to attach onto 6 well plates and differentiate during which time the neuroepithelial cells form. These neuroepithelial cells can be isolated at day 17. The cells can then be kept as neurospheres until they are ready to be plated onto coverslips. Using a basic medium without any caudalizing factors, neuroepithelial cells are specified into telencephalic precursors, which can then be further differentiated into dorsal telencephalic progenitors and glutamatergic neurons efficiently. Overall, our system provides a tool to generate human glutamatergic neurons for researchers to study the development of these neurons and the diseases which affect them.

This procedure yields telencephalic neurons by going through checkpoints which are similar to those observed during human development. The cells are allowed to spontaneously differentiate, are exposed to factors which push them towards the neural lineage, are isolated, and are plated onto coverslips to allow for terminal differentiation and maturation.

Die Spezifikation der telencephalen glutamatergen Neuronen von menschlichen pluripotenten Stammzellen

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the stem cell community. Many current expansion methods are laborious and costly, and those involving complete dissociation may cause several stem and progenitor cell types to undergo differentiation or early senescence. To overcome these problems, we have developed an automated mechanical passaging method referred to as &#8220;chopping&#8221; that is simple and inexpensive. This technique avoids chemical or enzymatic dissociation into single cells and instead allows for the large-scale expansion of suspended, spheroid cultures that maintain constant cell/cell contact. The chopping method has primarily been used for fetal brain-derived neural progenitor cells or neurospheres, and has recently been published for use with neural stem cells derived from embryonic and induced pluripotent stem cells. The procedure involves seeding neurospheres onto a tissue culture Petri dish and subsequently passing a sharp, sterile blade through the cells effectively automating the tedious process of manually mechanically dissociating each sphere. Suspending cells in culture provides a favorable surface area-to-volume ratio; as over 500,000 cells can be grown within a single neurosphere of less than 0.5 mm in diameter. In one T175 flask, over 50 million cells can grow in suspension cultures compared to only 15 million in adherent cultures. Importantly, the chopping procedure has been used under current good manufacturing practice (cGMP), permitting mass quantity production of clinical-grade cell products.

This protocol describes a novel mechanical chopping method that allows the expansion of spherical neural stem and progenitor cell aggregates without dissociation to a single cell suspension.&#160; Maintaining cell/cell contact allows rapid and stable growth for over 40 passages.

Ein cGMP-Verfahren zur Erweiterung anwendbar Aggregate von humanen neuralen Stamm-und Vorläuferzellen, abgeleitet von pluripotenten Stammzellen oder fetalen Hirngewebe

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

Regie dopaminergen Neuron Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants that circumvent histocompatibility barriers. However, progression through a pluripotent state and subsequent complete differentiation into desired lineages remains a roadblock for the clinical translation of iPSC technology because of the associated neoplastic potential and genomic instability. Recently, we and others showed that somatic cells cannot only be converted into iPSCs but also into different types of multipotent somatic stem cells by using defined factors, thereby circumventing progression through the pluripotent state. In particular, the direct conversion of human fibroblasts into induced neural progenitor cells (iNPCs) heralds the possibility of a novel autologous cell source for various applications such as cell replacement, disease modeling and drug screening. Here, we describe the isolation of adult human primary fibroblasts by skin biopsy and their efficient direct conversion into iNPCs by timely restricted expression of Oct4, Sox2, Klf4, as well as c-Myc. Sox2-positive neuroepithelial colonies appear after 17 days of induction and iNPC lines can be established efficiently by monoclonal isolation and expansion. Precise adjustment of viral multiplicity of infection and supplementation of leukemia inhibitory factor during the induction phase represent critical factors to achieve conversion efficiencies of up to 0.2%. Thus far, patient-specific iNPC lines could be expanded for more than 12 passages and uniformly display morphological and molecular features of neural stem/progenitor cells, such as the expression of Nestin and Sox2. The iNPC lines can be differentiated into neurons and astrocytes as judged by staining against TUJ1 and GFAP, respectively. In conclusion, we report a robust protocol for the derivation and direct conversion of human fibroblasts into stably expandable neural progenitor cells that might provide a cellular source for biomedical applications such as autologous neural cell replacement and disease modeling.

Generation of induced pluripotent stem cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants. However, progression through a pluripotent state and laborious re-differentiation still hinders clinical translation. Here we describe the derivation of adult human fibroblasts and their direct conversion into induced neural progenitor cells and the subsequent differentiation into neural lineages.

Ableitung von Adult menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umwandlung in Erweiterbar neuronalen Vorläuferzellen

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

Identifizieren von Zelloberflächenmarkern von primären neuralen Stamm- und Vorläuferzellen durch metabolische Kennzeichnung von Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...