Es gibt viele, trugen zu dieser Arbeit und die meisten sind von der Membrane Strukturelle und Funktionelle Biology Group, beide in Vergangenheit und Gegenwart Mitglieder. Um alles, was wir verlängern unsere wärmsten Dank und Anerkennung. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse aus Science Foundation Ireland (07/IN.1/B1836), den National Institutes of Health (GM75915, P50GM073210 und U54GM094599) und FP7 COST Action CM0902 unterstützt.

Ein. Vorbereiten der Kristallisation Platte Einrichten eine Kristallisation Studie Roboter zu tun beginnt mit der Vorbereitung der Bodenplatte des Glas-Sandwich Kristallisationsplatte (Abbildung 2), im Detail Reference 2 beschrieben. Die Bodenplatte muss zunächst silanisiert und die perforierte Doppel-stick Abstandshalter, die Brunnen erstellt, muss auf die Platte aufgetragen werden. Die Hilfs-und Betriebsstoffe für diese benötigt werden unter Materialien aufgeführt. <ol><li> Legen Sie die Platte auf einem Papiertuch, ein paar Tropfen der Silanisierung Lösung und verteilen sie gleichmäßig über die Plattenoberfläche mit einem Papiertuch. </li><li> Entfernen überschüssigen Silanisierungsmittel Lösung durch Eintauchen der Platte in ein Becherglas mit Wasser. </li><li> Nehmen Sie die Platte aus dem Becher, legen Sie sie auf ein trockenes Papiertuch, silanisiert Seite nach oben, und trocknen ihre exponierte Oberfläche durch Wischen leicht mit einem Papiertuch. </li><li> Ziehen Sie die Schutzabdeckung auf dem perforierten, Doppel-stick Abstandhalterund Anwendung des Abstandshalters, klebrigen Seite nach unten, um das trockene, silanisierte Oberfläche der Glasplatte. Stellen Sie sicher, dass der Abstandshalter richtig auf der Grundplatte positioniert ist, mit der oberen linken Ecke und den beiden benachbarten Seiten der Abstandshalter und der Platte zusammenfällt. </li><li> Mit einer Walze oder Brayer abzuflachen, um den Abstandshalter an der Basisplatte und um eine dichte Dichtung zwischen ihnen zu schaffen. </li></ol> Fertigteilplatten sind kommerziell erhältlich (HR3-151, Hampton Research; MD11-55-100, Molecular Abmessungen und LCP96T-UVP70U, Swissci). Aus Kostengründen bevorzugen wir unsere eigenen Platten nach dem Protokoll über zusammenzubauen. 2. In Meso Robot 1 Der erste in meso-Roboter in diesem Video Artikel gezeigt werden, ist das ein derzeit in der MS &amp; FB Group (Abbildung 3). Alle Einzelheiten der Roboter kann unter Materialien und in der Referenz 5 gefunden werden. Die Materialien und equipment zum Einrichten einer Kristallisation Studie mit Hilfe des Roboters sind unter Materialien aufgeführt. <ol><li> Legen Sie die Bodenplatte mit Abstandshalter in Abschnitt 1 auf dem Deck des Roboters vorbereitet. Es hat seine eigene Plattform mit gut Positionen für Zwecke der Grundplatte Ausrichtung markiert. Die Platte sollte für Identifizierungszwecke markiert werden. </li><li> Sichern den 96-well Block in Fällungsmittel eigene Plattform auf dem Deck des Roboters neben dem Kristallisationsplatte. </li><li> Öffnen Sie den Baustein sorgfältig durch Abziehen der Kunststoff-Verschlusskappe. </li><li> Einschalten des Befeuchters und lenken den Strom der feuchten Luft über und über der Basis-Platte auf dem Deck des Roboters. Der Befeuchter ist gezeigt worden, um die Verdampfung des Fällungsmittels Lösung zu reduzieren und die Reproduzierbarkeit über der Kristallisationstemperatur Platte 5 zu verbessern. Es kann nach vorheriger gedreht werden, um Set-up vor, befeuchten die Gegend, wenn relative Luftfeuchtigkeit niedrig ist, oder nicht, kurz vor der Abgabe von Mesophase beginnt. </li><li> Initialisieren des Roboters nach den Anweisungen des Herstellers. Instrument spezifische Anweisungen werden hier nicht im Detail beschrieben werden, weil genaue Verfahren im Laufe der Zeit verändern wird. Im Wesentlichen, was während der Initialisierung ist, dass der Arm auf Mesophase Abgeben des Roboters mit Referenzpositionen in drei orthogonalen Richtungen X, Y und Z bereitgestellt wird </li><li> Bringen Sie die Protein-beladenen Mesophase in einem Hamilton-Spritze, komplett mit Dosiernadel, um Arm 1 des Roboters (Abbildung 3). Ausführliche Informationen, wie man die Mesophase und wie bereiten Sie es in die Spritze geladen haben Referenzen 3,7-10 beschrieben worden. </li><li> Entfernen Sie die obere Schutzabdeckung von der Abstandshalter auf der Kristallisation Grundplatte und richten Sie die Vertiefungen auf der Platte mit Passermarken auf der Grundplatte Plattform. Anmerkung für die Zwecke dieser Video wurde die Schutzabdeckung an ihrem Platz gelassen, um das Viewer während der Ausrichtungsschritt unterstützen. </li><li> Richten Sie die Nadelspitze der Abgabe syringe mit der Unterseite des obersten gut in der linken Ecke der Kristallisation Platte (Well A1). Dies wird durch Einstellen der Höhe Auges oder Z-Koordinate des Abgeben Arm während beobachten, wie nahe die Nadelspitze auf den Grund des Bohrlochs kommt getan. Dass die Spitze gerade berührt den Boden des Bohrlochs kann durch Bewegen der Platte von Seite zu Seite auf der Plattform während immer so leicht Einstellen der Höhe der Abgabearm beurteilt werden. </li><li> Eintragen in den Computer die Z-Koordinate des Armes, wo die Abgabevorrichtung Spitze kontaktiert die Platte. Abgabevorrichtung programmiert ist, um Platz mit der Nadelspitze 80 Mikrometer von diesem Bezugspunkt Z-Position, die der Fläche der Grundplatte entspricht nehmen. </li><li> Position mit dem Auge die Spitze der Nadel in der Mitte des Well A1. Laden in dem steuernden Rechner der Verweis X, Y-Koordinate des Abgeben Arm, wo die Spitze zentriert ist. Dieses Koordinatensystem wird verwendet, um den Mittelpunkt der übrigen Vertiefungen auf der Platte zu definieren. </li><li> Prime die Spritze mit einem entsprechenden Befehl an den Roboter Computer dass frisches Mesophase sicherzustellen füllt die Dosiernadel und dass die ersten und nachfolgenden Vertiefungen erhalten ihre volle Ergänzung der Mesophase. Abzuwischen extrudierten Mesophase an der Nadelspitze mit Gewebe. </li><li> Starten Sie den Run Robot (X-AP) Programm, um eine Runde Spülschritte wo die Fällungsmittel Abgabe Tipps Arm 2 des Roboters gewaschen und bereit sind, Lösungen aus dem Fällungsmittel Block absaugen zu initiieren. </li><li> Aktivierung des Spendefunktion am Roboter in Bewegung zu setzen die sequentielle Laden von Vertiefungen mit Protein-beladenen Mesophase (üblicherweise 50 nl) erste, eine Spalte von acht Vertiefungen zu einer Zeit, durch Fällungsmittel Lösungen (in der Regel 800 nl) gefolgt. Spalten zwischen dem Laden, befeuchtet die Mesophase Abgabearm kehrt zu einer Parkposition, wo das Ende der Nadel in einen Schwamm gelegt wird, um den Mesophase an der Spitze zu verhindern das Austrocknen. Verfahren des Abgebens Mesophase und Fällungsmittel wird wiederholt11-mal über die Platte, bis die Platte gefüllt. Die Beladung einer 96-Well-Platte mit Mesophase und Fällungsmittel in 5 min in Anspruch. </li><li> Sobald die Platte gefüllt ist und die Roboterarme haben, um ihre Parkpositionen zurückgekehrt, entfernen Sie die Platte aus dem Deck des Roboters und legen Sie es auf eine ebene feste Oberfläche. </li><li> Unmittelbar, dichten die Platte mit einem Deckglas, um zeitabhängige Veränderungen in gut Zusammensetzung zu minimieren. Es ist wichtig, sicherzustellen, dass alle 96 Wells vollständig abgedeckt werden, dass das Deckglas ausgerichtet ist mit der Grundplatte quadratisch und dass keiner der Deckglas erstreckt sich über den Fußabdruck der Grundplatte. Eine Walze oder Brayer verwendet wird, um eine feste und eine gleichmäßige Abdichtung zwischen dem Deckglas und dem Abstandhalter zu schaffen. </li><li> Überprüfen Sie die Platte sicher zu sein das set up ging, wie es sollte. Was man sucht, ist ein &quot;Spiegelei auf einem pan &#39;Auftritt in jede Vertiefung. Das Eigelb des Spiegelei entspricht der Mesophase. Das Weiß des Eies ist das Fällungsmittel Löauf und der Rand der Pfanne ist vom Rand der Kristallisation gut. Idealerweise sind die drei konzentrischen. </li><li> Die Platte wird in einem temperierten Lagerraum für Kristallwachstum. </li><li> Wenn keine weiteren Platten eingerichtet werden sollen, entfernen Sie das Fällungsmittel Block vom Deck des Roboters, verschließen Sie diese sorgfältig und steckte es zurück ins Lager. </li><li> Entfernen Sie die Spritze mit der Mesophase aus dem Abgeben Arm des Roboters, demontieren und wäscht seine Teile einschließlich Dosiernadel und Ferrule, vorsichtig mit Methanol und trocken in Vorbereitung für den nächsten Einsatz. </li></ol> 3. In Meso Robot 2. Mosquito LCP Die Moskito LCP Roboter (Abbildung 4) eine ähnliche Ausgabevorrichtung Mesophase dem von Roboter 1 verwendet. Im Gegensatz zu Roboter 1, verzichtet er Fällungsmittel durch Einwegspitzen. Programmier-Software wird verwendet, um das Instrument für die Zusammenarbeit mit bestimmten Kristallisation Platten und precipitant-Blöcke, und die Benutzerfreundlichkeit definierter Volumina von Mesophase und Fällungsmittel in einer bestimmten Reihenfolge zu verzichten. Solche Details sind vom Hersteller bereitgestellt und wird hier nicht beschrieben werden. <ol><li> Bereiten Sie eine Hamilton-Spritze, komplett mit Nadel und gefüllt mit Protein-beladenen Mesophase, wie oben unter Robot 1 und in JoVE Artikel 1712 1 beschrieben. </li><li> Klemmen die Spritze in Position auf der Abgabevorrichtung Arm des Roboters. </li><li> Verwenden Sie das Deck montiert Lasersensor, um die X-und Y-Koordinaten der Nadel auf der Dosierspritze etablieren. Dies ist ein wichtiger Schritt erforderlich, um sicherzustellen, daß die Mesophase genau in der Mitte jeder Vertiefung auf der Platte verteilt. </li><li> Mit einem Tastendruck auf dem Bedienfeld, prime die Spritze Mesophase von der Nadel zu vertreiben. Entfernen extrudierten Mesophase von der Nadelspitze mit Gewebe in Vorbereitung für die Verwendung des Roboters zu Vertiefungen laden. </li><li> Vor dem Einsetzen der Kristallisation Platte auf dem Deck des Roboters feuchteen der Oberfläche der Plattform mit ein paar Tropfen Wasser zu helfen, halten Sie die Platte an Ort und Stelle durch Kapillarwirkung. </li><li> Entfernen Sie die Schutzkappe von der Abstandhalter auf dem Glas Bodenplatte und legen Sie es auf seiner Plattform fest gute Haftung zu gewährleisten. Mit den drei Bezugsmarkierungen auf der Plattform, um die drei Vertiefungen Ecke wodurch eine ordnungsgemäße Positionierung der Vertiefungen auf der Platte in Bezug auf die Abgabe Nadelspitze auszurichten. Das Instrument ist nun um einen befohlenen Abgabezyklus Kraft. </li><li> Der Zyklus beginnt mit einer zweiten Priming-Schritt, wo Mesophase auf eine kleine Glasplatte verzichtet wird sofort, bevor sie zu Brunnen mit frischem Mesophase laden. Die Roboter zunächst Lasten mit Mesophase eine vertikale Säule von 8 Vertiefungen auf der Platte und verwendet dann die Einweg-Tipps Fällmittellösung auf der Mesophase Bolus verzichten. Der Prozeß wird 11 Mal entlang der Länge der Platte wiederholt, bis alle Vertiefungen gefüllt werden. Der gesamte Prozess dauert etwa 5 min zu vervollständigen. </li><li> Entfernender gefüllte Platte von der Plattform des Roboters und versiegeln mit einem Deckglas, wie oben unter 1 beschriebenen Roboter. </li><li> Legen Sie die Platte, ordnungsgemäß beschriftet, in einer temperaturkontrollierten Umgebung für das Kristallwachstum. </li></ol> 4. In Meso Robot 3. Gryphon LCP Der Greif LCP Roboter (Abbildung 5) eine ähnliche Mesophase Abgabesystem zu dem oben beschriebenen für Roboter 1 und 2. Was sie von den anderen beiden ist, dass alle 96 Fällungsmittels Lösungen gleichzeitig ausgegeben werden. <ol><li> Bereiten Sie die Protein-beladenen Mesophase und laden Sie es in die Dosierspritze, wie oben beschrieben, unter Robots 1 und 2, und in JoVE Artikel 1712 ein. </li><li> Klemmen die Spritze in Position auf der Abgabevorrichtung Arm des Roboters. </li><li> Platzieren Sie die Fällungsmittellösung Block und Kristallisation Platte auf dem Deck des Roboters. </li><li> Laden Sie die 96-tip head mit Fällungsmittel Lösungen. Ein Benutzer-definierten Verzögerungszeit ist vorgesehen, um zu erleichtern Absaugen viskose Fällungsmittel. </li><li> Befiehl das Instrument an einen Ausgabezyklus geben. Der Zyklus beginnt mit dem Mesophase sequentiell in die 96 Vertiefungen in einem Prozess, der etwa 1 min in Anspruch nimmt verzichtet. Der 96-Spitzenkopf gibt dann alle 96 Fällungsmittel Lösungen auf einmal am Anfang der Mesophase Boli in der Kristallisation Brunnen. Die gesamte Platte Ladevorgang in 2 min beendet. </li><li> Die gefüllte Platte von der Plattform des Roboters und versiegeln mit einem Deckglas, wie oben unter 1 beschriebenen Roboter. </li><li> Legen Sie die Platte, ordnungsgemäß beschriftet, in einer temperaturkontrollierten Umgebung für das Kristallwachstum. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Der Zweck dieses Video Artikel soll zeigen, wie Sie automatisch Kristallisation Studien mit einer viskosen, Membranprotein-beladenen Mesophase in Glas Sandwichpaneelenh 96-well Platten Kristallisation. Der Schwerpunkt liegt auf der Automatisierung durch den Einsatz von spezialisierten Roboter, die minimale manuelle Eingriffe erfordern. Reproduzierbarkeit und Präzision in Bezug auf Volumina von Mesophase und Fällungsmittel verzichtet und die Platzierung von sowohl innerhalb des Bohrlochs, werden erwartet, wenn ein Roboter verwendet wird. Dies sind aus der Sicht der wirksame Abschirmung von Bedingungen, Kristallogenese unterstützt wichtig. Sie sind auch kritisch für den nächsten Schritt in der Analyse Rohrleitung, die zu einem Kristallwachstum oft getan mit bildgebenden Geräten auswerten kann. Drop oder Bolus Ort ist der Schlüssel zum bildgebenden Verfahren und unregelmäßig und falsche Platzierung des Bolus in den Brunnen erfordert in der Regel Eingreifen des Benutzers zur Korrektur und braucht Zeit. Zum Zwecke der Darstellung sind Beispiele von ordnungsgemäß und nicht ordnungsgemäß eingelegt Platten in 6 gezeigt. <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> <html> Abbildung 1. Das Flussdiagramm fasst die Schritte bei der Herstellung, Ernte und Kryo-Kühlung in meso-grown-Kristallen Membranprotein beteiligt. Schritte durch die gestrichelte rote Linie umgeben sind der Schwerpunkt dieser JoVE Artikel. Roboter wurden verwendet, um Lösungen und Fällungsmittel Mesophase in den Schritten 29 bis 32 verzichtet werden. Von Reference 3. <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4000/4000fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Ein voll beladen und verschlossen 96-well Glas-Sandwich Kristallisationsplatte. Jede Vertiefung enthält 50 nl kubischen Phase und 1 ul Fällmittellösung. Aus Gründen der Übersichtlichkeit ist die kubische Phase mit dem Sudan Red angefärbt und die Fällmittellösung enthält Methylenblau. Von Reference 5. _upload/4000/4000fig3.jpg &quot;alt =&quot; Abbildung 3 &quot;/&gt; Abbildung 3. Die in meso Roboter (Robot 1). Der Roboter hat zwei Arme. Arm 1 verzichtet das Protein beladenen Lipid Mesophase. Arm 2 verzichtet Fällungsmittel Lösungen. Beim Befüllen bleibt der 96-Well-Platte in ihrer Position auf dem Deck des Roboters, die selbst stationär befestigt. Die beiden Arme bewegen Mesophase und Fällungsmittel Lösungen zu liefern. Von Reference 3. <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Die Mosquito LCP Roboter (Robot 2). Im Gegensatz zu Robot 1, dem Deck des Mosquito LCP, auf denen die 96-Well-Platte und der Fällmittellösung Block sitzen, bewegt sich horizontal während der Befüllung. <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Die Gryphon LCP Roboter (Robot 3). Während eineinzurichten, bewegt sich die Lipid-kubischen Phase Spender Protein-beladenen Mesophase auf die 96-Well-Platte zu liefern. Das Deck übersetzt dann horizontal, um die Platte unter dem Fällmittellösung Spitzenkopf positionieren. Alle 96 Fällungsmittel Lösungen werden gleichzeitig ausgegeben. Bild des Herstellers (bezogen <a href="http://www.artrobbins.com/" target="_blank">http://www.artrobbins.com/</a> ) und beschriftet. <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig6.jpg" alt="Abbildung 6" /> Abbildung 6. Ein voll beladen und verschlossen 96-well Glas-Sandwich Platte (A) und Brunnen richtig (B) und falsch (C, D) gefüllt mit dem in meso Roboter (Robot 1). Die Barcode-Etikett auf der Platte in A wird verwendet, um die Platte in der Platte Inkubator / Bildgebungsvorrichtung verfolgen. Einsatzplatten BD, Fällungsmittellösung und Mesophase markiert sind P und M sind. Die erwarteten &quot;Spiegelei auf einem pan &#39;Erscheinungsbild des Bohrlochs in B ist charakteristisch für eine ordnungsgemäß geladen und abgedichtet gut. In C, hat das Fällungsmittel in das Bohrloch unsachgemäß worden in einer außermittigen Position dispensiert und in Kontakt mit dem Abstandshalter kommen. In C wäre es auch ersichtlich, dass das Volumen der Mesophase kleiner als sie sein sollte. Ein Beispiel für unvollständige Beladung mit Fällungsmittellösung in D. Für Maßstab dargestellt ist, ist der Durchmesser aller Kavitäten 6 mm.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

In diesem Video Artikel haben wir gezeigt, wie man einen Roboter verwenden, um automatisch in meso Kristallisation Studien in 96-well Glas-Sandwich-Platten mit einem Protein-beladenen Lipid Mesophase. Die Roboter in dieser Arbeit verwendet wurden konstruiert, um eine positive Verschiebung Glasspritze für eine genaue und reproduzierbare Abgabe von Nanoliter des viskosen und klebrigen Mesophase umfassen, wie ursprünglich 7 beschrieben. Genauigkeit und Präzision sind wichtige Merkmale eines Roboters. Allerdings sind diese Eigenschaften nur so gut wie der Grad und die Regelmäßigkeit, die Roboter-Performance ausgewertet und Kalibrierung durchgeführt wird. Es versteht sich von selbst, dass die Leistung des Roboters ausgewertet werden, während die einzelnen Platten eingestellt ist oben zeigt. Es ist nicht angemessen, davon auszugehen, dass der Roboter einwandfrei funktionieren und den Roboter zu verlassen, um unbeaufsichtigt laufen. Das aufmerksame und aufmerksame Fahrer sollte in einem pos seinition von einem Ton oder einem Auftritt, wenn etwas nicht richtig funktioniert und es sofort zu korrigieren beachten. Außerdem sollte jede Platte sorgfältig von Auge, sind für Gleichförmigkeit sowie Inhalt inspiziert, sobald die Platte verschlossen ist und bevor es auswärts zur Kristallisation gebracht Studien. Dieses sollte nur wenige Sekunden erforderlich durchzuführen und können durchgeführt werden, während die nächste Platte geladen wird. Bemerken, kann zum Beispiel, dass bestimmte Brunnen sind nicht richtig gefüllt unterstreichen die Tatsache, dass ein bestimmter Fällungsmittel Dosierspitze ist defekt. Lieferung von Mesophase gesehen sollte unregelmäßig sein, wäre die relevanten fehlerhaften Artikel müssen unverzüglich behoben werden. Indem man diese Probleme und macht die entsprechenden Anpassungen während der Einrichtung spart Zeit und Materialien, darunter wertvolle Lipid-und Membran-Protein. Wenn eine Kamera wird verwendet, um das Kristallwachstum zu verfolgen, können die Genauigkeit und Präzision auch während der Bildgebung überwacht werden. Zum Beispiel, systematische Probleme mit Tropfen oder BolusLage der von der Kamera zeigen, dass etwas nicht stimmt und dass Korrekturmaßnahmen irgendwo stromaufwärts in dem Protokoll benötigt wird. Im Interesse der zuverlässigen Leistung daher muss der Roboter in regelmäßigen Abständen kalibriert werden und je nach Bedarf. Kalibrierungen sollten Volumen von Fällungsmittel und Mesophase sowie Bolus und Fällungsmittel Platzierung in der auch geliefert. Offensichtlich sollte möglichst Kalibrierung erfolgt über Volumen und Materialien, die ähnlich zu denen, die in Studien in der Zeit durch die Qualitätskontrolle Übung fallenden Gebieten eingesetzt werden wird. Ebenso wichtig wie die Kalibrierung so auch in Lager eine ausreichende Versorgung mit Roboter Teile und Zubehör. Katastrophal und unerwarteten Ausfällen, Blockaden und Abstürze können und tun auftreten. In einem solchen Fall, mit einen Ersatz verfügbar Fällungsmittel Abgabespitze zum Beispiel könnte bedeuten, dass eine extrem wertvolle Membranprotein Zubereitung, wie es sollte verwendet wird undwird nicht verschwendet. Einige der Vorteile eines Roboters gehört die Tatsache, dass es im Wesentlichen kontinuierlich arbeiten und dass sie nicht aus oder &quot;klagen&quot; Müdigkeit leiden. Ein Roboter kann auch unter Bedingungen, die nicht als menschliche ausgerichtet wie im Dunkeln verwendet werden, unter gesteuerten Beleuchtung und Umgebungsbedingungen und bei extremen Temperaturen. Die Roboter in diesem Artikel gezeigt wurden alle unter Umgebungsbedingungen bei ~ 20 ° C eingesetzt Allerdings gibt es Proteine ​​und nicht-Projekte, die Umgebungstemperaturen gesteuerten Lichts 11,12 und eine oxidierende oder eine reduzierende Umgebung 13 erfordern. Alle diese Faktoren können arrangiert werden, mit relativer Leichtigkeit, wenn eine Kristallisation Roboters verwendet wird. In einer früheren JoVE Video Artikel haben wir gezeigt, wie Kristallisation Studien durch die in meso Verfahren bis manuell 1 gesetzt. Das Mindestvolumen von Mesophasen, die zuverlässig von Hand verzichtet werden begrenzt by die Sehschärfe und stetige Händigkeit der Person der Einrichtung der Studien. Nach unserer Erfahrung sind Volumina von Mesophase so niedrig wie 100 nl leicht zu handhaben. Wir wissen von einem Labor, wo die Standard-Lautstärke verzichtet manuell etwa 40 nl. Allerdings sind wesentlich kleiner Volumina möglich mit einem Roboter. Getrennt haben wir gezeigt, dass Mesophase Volumen so niedrig wie 550 Picoliter robotically 14 verzichtet werden kann. Aus dieser Arbeit war es klar, dass eine weitere Miniaturisierung durch Roboter möglich, die, wenn sie umgesetzt würde zu einer starken Reduzierung der Menge an wertvollen Membranprotein, die zur Durchführung einer Kristallisation Studie zu führen. In diesem Video Artikel wurden drei kommerziell erhältlichen Roboter verwendet, um High-Throughput-Membranprotein Kristallisation mit Lipid-Mesophasen zu demonstrieren. Die erste davon wurde in der MS &amp; FB Group basieren auf unseren Erfahrungen Einrichten Studien manuell, wie in JoVE 1712 1 beschriebenen entwickelt. Dies ist das Instrumentment wir haben die meisten Vertrautheit mit und der Großteil des Stroms Gegenstand auf seine Verwendung gewidmet. Die beiden anderen Roboter waren am Demonstration in der MS &amp; FB Group zum Zeitpunkt der Artikel geschrieben wurde, und die entsprechenden Aufnahmen wird hier im Interesse der Vollständigkeit halber aufgeführt. Alle drei Roboter verwenden sehr viel die gleiche Mesophase Dosiersystem, das wesentliche Merkmal von denen eine positive Verschiebung Glasspritze 5,7 ist. Sie unterscheiden sich am deutlichsten im Hinblick auf die Fällungsmittel Lieferung. Roboter 1 und 2 können gleichzeitig Fällungsmittel verzichten in 8 Vertiefungen eine einzelne Spalte auf einem Kristallisationsplatte zu einer Zeit. Im Gegensatz dazu verzichtet Robot 3 alle 96 Fällungsmittel Lösungen in einer einzigen Aktion. Robot 2 ist das einzige Instrument mit Einweg Fällungsmittel Abgabe Tipps. Es gibt Vorteile und Nachteile der verschiedenen Instrumente, die von der jeweiligen Anwendung abhängen zugeordnet, diese werden hier nicht erarbeitet werden. Es genügt zu sagen, dass alle drei Arbeiten und haben erzeugten Kristalle von mirmbrane Proteine ​​durch die in meso-Methode. Die nächsten Schritte in den gesamten Prozess der Strukturaufklärung von makromolekularen Kristallographie sind bis zur Ernte und Kryo-cool Kristalle aus Platten wie in diesem Video Artikel beschrieben zu setzen und speichern und verarbeiten Röntgenbeugung von ihnen. Diese Themen werden in separaten JoVE Artikel in dieser Serie 1,15 abgedeckt.

<table border="1"><tbody><tr><td> Namen Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Komponenten </td></tr><tr><td> Brayer (Rolle) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 50820937 </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Gasdichte Spritzen </td><td> Hamilton </td><td> 81030 </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Deckgläschen </td><td> Marienfeld </td><td> 01029990911 </td><td> Wegwerf- </td></tr><tr><td> Glasplatten </td><td> Marienfeld </td><td> 1527127092 </td><td> Wegwerf- </td></tr><tr><td> Gryphon LCP Robot </td><td> Art Robbins </td><td> NA </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> In meso-Roboter </td><td> Anachem / Gilson </td><td> NA </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Lab Notebook </td><td> Verschiedene </td><td> NA </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Mosquito LCP Robot </td><td> TTP Labtech </td><td> NA </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Perforierte Doppel-stick Abstandshalterband </td><td> Saunders Corporation (gelocht) </td><td> maßgeschneiderte </td><td> Wegwerf- </td></tr><tr><td> Fällungsmittel Lösungen </td><td> Verschiedene </td><td> Verschiedene </td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Gereinigtes Wasser </td><td> Millipore </td><td> NA </td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Regen-X </td><td> Shell Car Care </td><td> 80199200 </td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Spritzenansätze </td><td> Hamilton </td><td> 7770-020 (gauge 22) </td><td> Werkzeug </td></tr><tr><td> Tissues </td><td> Verschiedene </td><td> Verschiedene </td><td> Wegwerf- </td></tr><tr><td> Wasserflasche </td><td> verschiedene </td><td> NA </td><td> Reagens </td></tr></tbody></table>

use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases

Struktur-Funktions-Studien von Membranproteinen stark von mit verfügbaren hochauflösenden 3-D-Strukturen von der Art durch makromolekulare Röntgenkristallographie (MX) profitieren. Ein wesentlicher Bestandteil der MX ist eine stetige Versorgung mit idealerweise Beugung Qualität Kristalle. Die im meso oder lipidische kubischer Phase (LCP) Verfahren zur Kristallisation von Membranproteinen ist eine von mehreren verfügbaren Methoden zur Kristallisation von Membranproteinen. Es nutzt eine bikontinuierliche Mesophase, in dem Kristalle wachsen. Als Methode wurde es hatte einige spektakuläre Erfolge zu spät und hat viel Aufmerksamkeit mit vielen Forschungsgruppen nun mit daran interessiert. Eine der Herausforderungen mit der Methode ist, dass das Hosting Mesophase extrem zähflüssig und klebrig, erinnert an einen dicken Zahnpasta ist. So Abgabe manuell in reproduzierbarer Weise in kleinen Mengen in die Kristallisation Brunnen erfordert Geschick, Geduld und eine ruhige Hand. Ein Protokoll dafür just, die in der Membran Structural &amp; Functional Biology (MS &amp; FB) Gruppe 1-3 entwickelt wurde. JoVE Video Artikel beschreibt die Methode zur Verfügung 1,4. Der manuelle Ansatz für die Gründung von meso Studien hat deutliche Vorteile mit speziellen Anwendungen, wie Kristall-Optimierung und Derivatisierung. Es ist jedoch davon, dass ein niedriger Durchsatz Verfahren leiden. Hier zeigen wir ein Protokoll für die Durchführung in meso Kristallisation Studien Roboter. Ein Roboter bietet die Vorteile von Geschwindigkeit, Genauigkeit, Präzision, Miniaturisierung und in der Lage ist, kontinuierlich zu arbeiten für längere Zeiträume unter was als feindlichen Bedingungen wie im Dunkeln angesehen werden, in einer reduzierenden Atmosphäre oder bei niedrigen oder hohen Temperaturen. Ein in meso Roboter, wenn sie richtig eingesetzt, können erheblich zur Verbesserung der Produktivität von Membranprotein Struktur und Funktion der Forschung durch die Erleichterung Kristallisation, die eine der langsamen Schritten in der esGesamtstruktur Bestimmung Pipeline. In diesem Video Artikel zeigen wir die Verwendung von drei handelsüblichen Roboter, die den viskosen und klebrigen Mesophase integralen in meso Kristallogenese verzichten kann. Der erste Roboter wurde in der MS &amp; FB Group 5,6 entwickelt. Die anderen beiden sind seit kurzem verfügbar und werden hier der Vollständigkeit halber aufgeführt. Eine Übersicht über das Protokoll in diesem Artikel behandelt wird in Abbildung 1 dargestellt. Alle Manipulationen bei Raumtemperatur (~ 20 ° C) unter Umgebungsbedingungen durchgeführt.

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Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Hierin wird eine Roboter-Ansatz zur Hochdurchsatz-Kristallisation von Membranproteinen in lipidische Mesophasen zur Verwendung in Strukturbestimmung mittels makromolekularen Röntgenkristallographie beschrieben. Drei Roboter in der Lage Umgang mit dem viskosen und klebrigen Protein-beladenen Mesophase integraler Bestandteil der Methode eingeführt werden.

Einsatz eines Roboters für High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

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Research

JoVE Journal

Biology

17.4K Aufrufe.  Trinity College Dublin. Hierin wird eine Roboter-Ansatz zur Hochdurchsatz-Kristallisation von Membranproteinen in lipidische Mesophasen zur Verwendung in Strukturbestimmung mittels makromolekularen Röntgenkristallographie beschrieben. Drei Roboter in der Lage Umgang mit dem viskosen und klebrigen Protein-beladenen Mesophase integraler Bestandteil der Methode eingeführt werden.

Serie: Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Crystallizing Membranproteinen zur Strukturaufklärung mittels Lipidische Mesophasen

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Forschung

Biologie

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

Die Beurteilung Zweidimensionale Kristallisation Trials of Small Membranproteinen für Strukturbiologie Studien Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The availability of atomic resolution structures provides a deep and unique understanding of protein function, and helps to unravel the inner workings of the living cell. To date, 86% of the Protein Data Bank (rcsb-PDB) entries are macromolecular structures that were determined using X-ray crystallography.
To obtain crystals suitable for crystallographic studies, the macromolecule (e.g. protein, nucleic acid, protein-protein complex or protein-nucleic acid complex) must be purified to homogeneity, or as close as possible to homogeneity. The homogeneity of the preparation is a key factor in obtaining crystals that diffract to high resolution (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Crystallization requires bringing the macromolecule to supersaturation. The sample should therefore be concentrated to the highest possible concentration without causing aggregation or precipitation of the macromolecule (usually 2-50 mg/ mL). Introducing the sample to precipitating agent can promote the nucleation of protein crystals in the solution, which can result in large three-dimensional crystals growing from the solution. There are two main techniques to obtain crystals: vapor diffusion and batch crystallization. In vapor diffusion, a drop containing a mixture of precipitant and protein solutions is sealed in a chamber with pure precipitant. Water vapor then diffuses out of the drop until the osmolarity of the drop and the precipitant are equal (Figure 1A). The dehydration of the drop causes a slow concentration of both protein and precipitant until equilibrium is achieved, ideally in the crystal nucleation zone of the phase diagram. The batch method relies on bringing the protein directly into the nucleation zone by mixing protein with the appropriate amount of precipitant (Figure 1B). This method is usually performed under a paraffin/mineral oil mixture to prevent the diffusion of water out of the drop.
Here we will demonstrate two kinds of experimental setup for vapor diffusion, hanging drop and sitting drop, in addition to batch crystallization under oil.

The 3-D structure of a molecule provides a unique understanding of how the molecule functions. The principal method for structure determination at near-atomic resolution is X-ray crystallography. Here, we demonstrate the current methods for obtaining three-dimensional crystals of any given macromolecule that are suitable for structure determination by X-ray crystallography.

Proteinkristallisation für X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Die Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen mit dem Lipidische Bicellen Methode

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Ernte-und Cryo-Kühlung Kristalle von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen zur Strukturaufklärung von Makromolekulare Kristallographie Grown

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

High-throughput Reinigung von Affinity-markierter rekombinanter Proteine

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

Biochemische und High Throughput Mikroskopische Beurteilung der Fettmasse in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

Ein High-Throughput-Verfahren zur Messung der glomerulären Filtrationsrate in Conscious Mäuse

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

Hochdurchsatz-Mikroinjektionen von Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...