Es gibt viele, die zu dieser Arbeit beigetragen und die meisten sind aus dem Caffrey Membrane Strukturelle und funktionelle Biology Group, in Vergangenheit und Gegenwart Mitgliedern. Um alle erweitern wir unsere wärmsten Dank und Anerkennung. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse aus Science Foundation Ireland (07/IN.1/B1836), der National Institutes of Health (GM75915) und der University of Limerick unterstützt.

Ein wichtiger Schwerpunkt im Bereich der strukturellen und funktionellen Biologie ist die biologische Membran (Abbildung 1). Die Membran, die die Zelle und subzelluläre Organellen, wenn vorhanden umgibt, ist eine molekular dünne Struktur nur zwei Lipid-Moleküle auf und ist mit Proteinen besetzt. Struktur und Funktion zu beiden Lipid-und Protein aufgetragen sind von Interesse. Allerdings ist der Schwerpunkt dieses Artikels an Membranproteinen beschränkt. Ein besseres Verständnis davon, wie Membranproteine ​​Funktion auf molekularer Ebene ist aus zwei Gründen gesucht. Erstens gibt es die intellektuelle Befriedigung zu wissen, wie sie funktionieren. Zweitens, durch das Wissen, wie ein Protein funktioniert, gibt es immer die Aussicht, zu beheben, sollte es zu Fehlfunktionen oder zu verbessern oder sogar zu modifizieren für bestimmte Anwendungen. Drug-Design ist eine offensichtliche Ergebnis dieser Art von Arbeit. Ein Ansatz, um herauszufinden, wie ein Membranprotein auf molekularer Ebene funktioniert, ist, seine Struktur zu bestimmen. Dies beinhaltet die Gründung der Lage im 3-dimensionalen Raum aller Atome, oder zumindest alle Nicht-Wasserstoff-Atome, aus denen sich das Protein. Die Methode, die wir verwenden für diesen Zweck ist makromolekulare Röntgenkristallographie (MX). Abbildung 2 zeigt ein Beispiel für ein Membranprotein, dessen Struktur wurde anhand von MX. Eine Beugung Qualität Kristalle des Proteins erforderlich ist, um MX zu tun. Natürlich gibt es viele Schritte in die Strukturbestimmung mittels makromolekulare Kristallographie beteiligt. Dies ist in Abbildung 3 dargestellt. Typischerweise enthalten diese Identifizierung ein Membranprotein Ziel, und dann produziert, gereinigt und kristallisiert es. Diffraction Messungen werden auf den Kristall mit einem Heim-oder einem Synchrotron-Röntgenquelle durchgeführt. Die Beugung Daten verarbeitet werden, wodurch sich ein Elektronendichte, die dann mit ein molekulares Modell ausgestattet ist. Das Modell, wenn raffiniert, können verwendet werden, um die Wirkungsweise des Proteins zu erforschen und für die Struktur-based drug design. Der Schwerpunkt dieses Artikels ist zu zeigen, wie wir Beugung Qualität Kristalle von Membranproteinen mit Lipid-Mesophasen zu produzieren, die in meso-Methode sogenannten. Eine aktuelle Überprüfung des Verfahrens und sein Anwendungsbereich ist in Referenz 1 (Caffrey, 2009). Die Schritt-für-Schritt-Protokoll haben wir hier folgen wird, ist in Referenz 2 (Caffrey und Cherezov, 2009) beschrieben. Ein Flussdiagramm fasst die Schritte in und Zeit für den Aufbau eines in meso Membranprotein Kristallisation Studie erforderlich wird, ist in Abbildung 4 dargestellt. Dieser Artikel behandelt die Schritte durch gestrichelte rote Linien umschlossen. Teil 1: Vorbereiten der Kristallisation Plates <ol><li> Position eines silanisierten Objektträger auf der Werkbank. </li><li> Entfernen Sie die Schutzfolie abdecken, von einer Oberfläche aus einem Streifen aus gelochten Doppel-Stick Abstandshalter (im Handel erhältlich, siehe Tabelle der spezifischen Reagenzien und unten). </li><li> Legen Sie das Band, klebrigen Seite nach unten in Kontakt mit der Oberfläche der Folie. </li><li> Pressure-Siegel des Bandes, um die Folie mit einem Brayer oder Rolle. Aluminiumfolie kann zwischen dem Band und der Walze auf der Basis der Brunnen zu schützen platziert werden. </li><li> Entfernen Sie die zweite Papier Abdeckung von der Band auf ihrer oberen klebrige Oberfläche freizulegen. </li><li> Legen Sie individuelle silanisiert Deckgläser in unmittelbarer Nähe zu der Platte für die schnelle und effiziente Abdichtung von Brunnen, sobald der Ladevorgang abgeschlossen ist. </li></ol> Teil 2: Vorbereiten des Lipid Spritze <ol><li> Legen Sie die Lipid (oft Monoolein) in einem temperierten Block bei 45 ° C für 3 Minuten um es geschmolzen. </li><li> Während die Lipid schmilzt vorzubereiten zwei 100-ul gasdichten Hamilton-Spritzen für den Einsatz in der Lipid-Protein-Mischschritt. Entfernen Sie die Teflon Zwinge aus der Spritze, dass die Protein-Lösung enthält. Legen Sie die Spritze, dass die Lipid-halten wird daneben (Verlassen ihrer Hülse in place). </li><li> Verbinden Sie die Kupplung (siehe Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte unterhalb und Referenz 3 (Cheng et al., 1998)) an das Lipid Spritze. Handfest anziehen Koppler mit der Spritze, aber nicht zu fest anziehen. Entfernen Sie den Kolben aus dem Lauf der Lipid-Spritze. </li><li> Beachten Sie, dass die Lipid muss geschmolzenen bevor Sie fortfahren. Setzen Sie die Pipette auf 30 ul und langsam nehmen etwa 30 ul des geschmolzenen Lipids. Langsam liefern, wie viel von dem geschmolzenen Lipid, wie Sie können in das offene Ende der Spritze dabei nicht um Luftspalte einzuführen. </li><li> Setzen Sie die Kolben in den Zylinder in Kontakt mit dem geschmolzenen Lipid-und langsam voran den Kolben bis das Fass mit der Spritze senkrecht gehalten wie in dem Video gezeigt. Luftblasen, die versehentlich gefangen werden können, sollten in den Prozess steigen und freigegeben werden. </li><li> Sorgfältig bestimmen das Volumen des Lipid in der Spritze durch das Lesen der Markierungen auf der Spritze. </li><li> Schieben Sie die ferrmodul auf die Nadel sich von der Kupplung. Verwenden Sie den Kolben, um das geschmolzene Lipid bis das Fass und langsam und behutsam in die Nadel in den Mittelpunkt des Kopplers Kraft. </li></ol> Teil 3: Vorbereitung der Protein Spritze <ol><li> Die Protein-Lösung sollte bei 14.000 g für 5 bis 10 Minuten bei 4 ° C gesponnen, um große Aggregate vor der Einrichtung Kristallisation Studien zu entfernen. Entfernen Sie die Protein-Lösung aus dem Eis und lassen Sie es bei Raumtemperatur äquilibriert. </li><li> Berechnen Sie das Volumen der Proteinlösung zu verwenden, um die kubische Phase bei Form oder fast voll Feuchtigkeit. Für Monoolein bei 20 ° C, volle Hydratation mit Wasser tritt bei knapp 40% Wasser (Masse) wie im Phasendiagramm 5 (Abbildung 5). </li><li> Mit einer 25 oder 50 ul Hamilton-Spritze nehmen die benötigte Menge an Protein-Lösung. Übertragen Sie die Lösung auf die Teflon Spitze des Kolbens im Zylinder des Proteins Spritze kümmern, um Luftblasen zu vermeiden. </li><li> Vorsichtig ziehen Sie die Nadel und messen das Volumen der Proteinlösung in die Spritze. Es sollte dem Wert entsprechen, der im vorherigen Schritt geliefert. </li><li> Langsam Zoll die Protein-Lösung bis das Fass, um am Ende bündig mit seinem offenen Ende. </li><li> Schrauben Sie die Spritze Protein in das offene Ende des Kopplers an der Lipid-Spritze. Es ist wichtig, dass das Gerät nicht übermäßig angezogen werden. Zu festes Anziehen der versammelten Mischvorrichtung in dieser Phase führt zur Beschädigung der Ferrulen und führen zu Undichtigkeiten. Under-Verschärfung wird auch undicht führen. </li></ol> Teil 4: Mischen Protein-Lösung und Lipid: Making the Mesophase <ol><li> Um Wirkung Mischen, vorher den Kolben auf die Protein-Seite des montierten Rührwerk an seine Grenzen, mit dem Daumen oder Zeigefinger fahren die Protein-Lösung aus dem Protein Spritze, durch den Koppler und in die Lipid-Spritze. </li><li> Der Kolben auf den Lipid-Seite wird nun verwendet, um den Inhalt der Lipid-Spritze wieder Fahrt durch den Koppler und in das Protein Spritze. </li><li> Der Prozess wird mehrmals wiederholt, gelegentlich hundert Stellen oder mehr erforderlich sind, um eine homogene Mesophase zu erzeugen. Zu Beginn der Vermischung, die Bewegung von Material hin und her durch den Koppler kann uneben und manchmal ist zusätzliche Kraft benötigt, um Wirkung Vermischung. Initial Mischen ist in der Regel durch die Entwicklung einer uneinheitlichen Trübung in der Probe begleitet. Als Homogenisierung weiterkommt, wird die Textur einheitlich und charakteristisch für die viskosen kubische Phase, wie auch das optische Erscheinungsbild der aufstrebenden kubische Mesophase. </li><li> Wenn die Bedingungen angemessen und die kubische Phase bildet, sollte die Dispersion erscheinen optisch transparent in die Spritze. Daher sollten die Markierungen auf der Spritze gut lesbar durch die Mesophase in den Lauf. </li><li> Sehr leichte Abkühlung der Probe während der Mischung, indem Sie die Spritze Mischer für eine kurze Zeit auf Eis beschleunigen kann Homogenisierung und der Erreichung der Transparenz. Allerdings ist es wichtig, nicht auf die Probe overcool. </li><li> Es ist darauf zu vermeiden, sehr kräftiges Mischen werden, da dies kann dazu führen, Probentemperatur steigt durch Reibungswärme Heizung 3. </li></ol> Teil 5: Das Laden der Dispenser <ol><li> Entfernen Sie die Nadel und der Kolben aus einer 10-ul Hamilton-Spritze. Verlassen Sie die Teflon Klemmring statt. </li><li> Entfernen Sie die Überwurfmutter aus dem Spender mit Hilfe einer kleinen Münze. </li><li> Mit der Ratsche Arm vollständig zurückgezogen, legen Sie die Spritze - ohne Kolben und Nadel - durch den Haltering des Spenders. </li><li> Ersetzen Sie die Überwurfmutter, Dichtung zugewandte Seite der Spritze, und schrauben Sie ihn in dicht am offenen Ende der Spritze. Es sollte darauf geachtet werden, die Spritze richtig im Haltering und dass der Lauf ist parallel mit der Ratsche Arm zentriert werden. Beide können mit bloßem Auge beurteilt werden. Diese beiden Anforderungen sind entscheidend, um ein Auslaufen zu vermeiden. </li><li> Pass des Kolbens durch die Greif-Ring mit dem Greifer Mutter abgeschraubt ein paar Umdrehungen und führen Sie den Kolben in das offene Ende der Spritze. Drücken Sie die Ratsche Arm voll. Bewegen Sie den Kolben in den Lauf und überprüfen Sie, dass es frei und wahr reist in den Lauf. Es kann helfen, die Schraube an der Führungsschiene lösen, um den Kolben frei bewegen zu erleichtern. Stellen Sie sicher, dass es funktioniert. Drücken Sie den Kolben bis zur Teflon Spitze deckt sich mit der Null-ul Teilstrich auf dem Lauf. Wenn die Schraube an der Führungsschiene gelockert wurde, ziehen Sie es und überprüfen Sie, dass der Kolben frei bewegt. </li><li> Bewegen Sie den Kolben auf der einen Seite der versammelten Mischanlage zur Null-ul Teilstrich der Mesophase zu den anderen Spritze und den Koppler übertragen. </li><li> Trennen Sie die leere Spritze (mit Aderendhülse in place) von der Mischanlage und sofort eine Verbindung der geladenen Spritze - mit dem Koppler einettached - die Gewinde Beendigung des 10-ul Dosierspritze. Der Grad der Dichtigkeit, mit der Kupplung geschieht, ist entscheidend, wie bereits erwähnt. </li><li> Laden Sie die Dosierspritze durch Drücken Sie den Kolben der 100-ul Spritze so, dass die Mesophase Transfers durch den Koppler. </li><li> Sichern Sie sich eine kurze, flache Spitze Nadel auf den Stahl Beendigung der Dosierspritze und vorsichtig ziehen Sie sie fest. </li><li> Spannen Sie den Kolben, um die Ratsche Arm durch Anziehen der Mutter in die Zahnscheibe. Es sollte darauf geachtet, nicht über-die Mutter anziehen, da dies Partitur und verformen den Kolben macht sie unbrauchbar werden. Es ist wichtig, dass die Reise Angebot bereitgestellt, um die Ratsche Arm im gespannten Zustand nicht mehr als einen Zentimeter, wie im Video gezeigt, begrenzt werden. Darüber hinaus wird der Kolben haben eine Tendenz, Schnalle und Lieferung kann scheitern. </li><li> Drücken Sie die Ratsche Trommel mehrmals, um die Kolben in den Lauf vor, und füllt das Hohlraumvolumen der Nadel und dem Laden der Nadel. Dieser Schritt sollte wiederholt werden (bis zu zehn Mal), bis eine kontinuierliche Kette von der Mesophase ergibt sich aus der Spitze der Nadel werden. </li><li> Kristallisation Studien sollten sofort beginnen, da einige Proteine ​​instabil in der kubischen Phase ohne Zusatz von Fällungsmittel sind. </li></ol> Teil 6: Einrichten Kristallisation Plates <ol><li> Legen Sie ein Multi-Well-Platte Kristallisation und Deckglas auf einer Fläche erhöht ein paar Zentimeter über der Werkbank für eine einfache Beladung. Optimal Kontrast und bessere Sichtbarkeit erreicht werden, wenn die Oberfläche ist etwas dunkel. </li><li> Homogenisieren Fällungsmittel Lösungen und uncap die Fläschchen. Stellen Sie die Fällungsmittel Verzicht Pipette 1 ul. </li><li> Mit der Dosierspritze vertikal in einer Hand gehalten, verwenden Sie die freie Hand, um die Nadelspitze in der Mitte und direkt oberhalb der Basis der auch die Nummer 1 Position. Drücken Sie die Taste auf der Repetierpipette zu einem Bolus von Mesophase auf die Glasoberfläche zu vertreiben. Das Bolusvolumen ist 200 nL, wenn die Standard-Repetierpipette mit einem 10-ul Spritze verwendet wird. Die Spitze der Nadel sollte nicht mehr als ein paar hundert Mikrometer über dem Basiszinssatz der gut sein, um eine ordnungsgemäße Lieferung zu gewährleisten. </li><li> Nach 4 benachbarten Vertiefungen sind mit Mesophase, Platz 1 ul Fällungslösung übereinander Mesophase Bolus mit einem 2-ul-Pipette und Standard-Einweg-Tips geladen. </li><li> So schnell wie möglich, legen Sie ein Deckglas direkt über die gefüllten Brunnen, um sie gleichmäßig zu bedecken. Zur Durchführung einer Wasser-Dichtheit, verwenden Sie einen Spachtel, um Druck auf das Deckglas, wo es in Kontakt mit den freiliegenden klebrigen Oberfläche der Abstandshalter gelten. </li><li> Die Mesophase und Fällungsmittel Verzicht Vorgang kann wiederholt werden, bis alle Vertiefungen auf der Platte geladen werden und versiegelt werden. </li><li> Beschriften Sie die Platte eindeutig für Tracking-Zwecke. Lichtempfindliche Proteine ​​sind in der Regel durch das Einwickeln der Platten in Alu-Folie, bevor Sie sie in der Inkubationskammer behandelt. </li><li> Legen Sie die Platten in einer temperierten Kammer, in der Regel bei 20 ° C. </li><li> In regelmäßigen Abständen, inspizieren die Brunnen für das Kristallwachstum mit einem Polarisationsmikroskop mit einem 10 oder 20-fach Objektiv. Der Zeitplan in Labor des Autors verwendet wird, wie folgt: Tag 0, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 30 und 60 post-setup. Überprüfen Sie sorgfältig die Mesophase Bolus Einstellung der Tiefenschärfe im 0,14-mm-dicke Probe. Die Untersuchung sollte sowohl in normalem Licht und zwischen gekreuzten Polarisatoren durchgeführt werden. </li></ol> Teil 7: Repräsentative Ergebnisse Das Aussehen der entstandenen Kristalle werden mit der Eigenfarbe des Membranproteins variieren, die Polarisation des Lichtes für die Inspektion (oder deren Fehlen) und die Art und Qualität der Beleuchtung verwendet. Abbildung 6 zeigt mehrere mögliche Kristall Auftritte. Natürlich farbige Membranproteine ​​wachsenden in meso, wenn sie mit normalem Licht betrachtet werden können, wie sie in Abbildung 6 (Panels b und d) aussehen. Farblose Membranprotein Kristalle wachsen in der kubischen Phase, wenn sie mit normalem Licht betrachtet werden können, wie sie in Abbildung 6 (Systemsteuerung e) aussehen. Schließlich können farblose Membran-Protein-Kristalle wachsen in meso, wenn sie mit polarisiertem Licht betrachtet, wie in Abbildung 6 (Abb. A und C) zu suchen. Die nächsten Schritte in den Gesamtprozess der Strukturbestimmung sind bis zur Ernte und Kryo-Kühlung der Kristalle und die Erfassung und Auswertung Röntgenbeugung von ihnen. Diese Themen werden in separaten JoVE Artikel abgedeckt werden. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung einer biologischen Membran, welche die Lipid-Doppelschicht in und auf denen es eine Vielzahl von Proteinen entfernt. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Die Strukturder Vitamin-B 12 Transport-Protein, BtuB, gelöst mit MX und Kristalle durch die in meso-Methode 6 in diesem Artikel dargestellt JoVE gewachsen. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Die Struktur-Funktions-Zyklus zeigt viele der Schritte bei der Beschaffung und Nutzung von vollständigen Informationen über die Struktur eines Proteins beteiligt. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Das Flussdiagramm fasst die Schritte bei der Herstellung von Membran-Protein-Kristalle von der in meso-Methode einbezogen. Nur die Schritte durch die gestrichelte rote Linie umgeben sind in diesem JoVE Artikel behandelt. Von Reference 2. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Eine vereinfachte Temperatur-Zusammensetzung Phasendiagramm für die Lipid-(Monoolein) / Wasser-System. Kristallisation Studien sind bis auf 20 ° C, wo die Lipid mit Wasser gesättigt bei 40% Feuchtigkeit. Die detaillierte Phasendiagramm ist in Referenz 5 zur Verfügung. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig6.jpg" alt="Abbildung 6" /> Abbildung 6. Kristalle von Membranproteinen wächst in der Lipid-Mesophase. (A) Vitamin B 12 den Transport von Proteinen, BtuB 6, (b) Lichtsammelkomplex II 7, (c) das Adhäsin / Invasin OpcA 8, (d) Bakteriorhodopsin 9, (e) ein Kohlenhydrat-Transporter von Pseudomonas. Bilder, die mit normalem Licht (b, d, e) und zwischen gekreuzten Polarisatoren (a, c) aufgezeichnet.

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	<li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination.+Use+of+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins for structure determination. Use of lipidic mesophases.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).</li><li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallising+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases.">Crystallising membrane proteins in lipidic mesophases.</a> Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).</li><li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples.">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast,+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins.">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li><li>Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phase+diagram+of+the+monoolein/water+system:+metastability+and+equilibrium+aspects.">The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects.</a> Biomaterials. 21, 223-234 (2000).</li><li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+meso+structure+of+the+cobalamin+transporter,+BtuB,+at+1.95+A+resolution.">In meso structure of the cobalamin transporter, BtuB, at 1.95 A resolution.</a> J. Mol. Biol. 364, 716-734 (2006).</li><li>Cherezov, V., Clogston, J., Papiz, M. Z., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Room+to+move:+crystallizing+membrane+proteins+in+swollen+lipidic+mesophases.">Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases.</a> J. Mol. Biol. 357, 1605-1618 (2006).</li><li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+meso+crystal+structure+and+docking+simulations+suggest+an+alternative+proteoglycan+binding+site+in+the+OpcA+outer+membrane+adhesin.">In meso crystal structure and docking simulations suggest an alternative proteoglycan binding site in the OpcA outer membrane adhesin.</a> Proteins. 71, 24-34 (2008).</li><li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases.">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60, 1795-1807 (2004).</li></ol>

Die kubische Phase ist eine heikle und dynamisches Umfeld, das drastisch ändern kann mit der Änderung einer Reihe von Variablen. Es ist nicht möglich, eine Beschreibung der Einrichtung in meso Kristallisation Studien in den manuellen Modus, dass alle potentiellen Fallstricke beschreibt geben. Allerdings können viele Schwierigkeiten durch das Praktizieren der Technik, bevor es zu teuren Protein-Lösungen und durch Mäßigung in Druck, der auf Spritzen beim Mischen vermieden werden. Richtig gemacht, die in meso-Methode kann Kristalle von einer Vielzahl von Proteinen liefern, ist deren Zahl steigt ständig. Die Beschreibung hier der Aufbau in meso Kristallisation Studien stützen sich auf den manuellen Modus fokussiert. Der Prozess kann, und oft wird geändert, um automatisierte Setup der Kristallisation Platten in diesen Fällen, dass gross angelegte Screening-Kristallisation erfordern erleichtern.

* Ausführliche Informationen für die Bearbeitung Ihrer eigenen Narrow Bore-Koppler sind in Referenz 3 vorgesehen.

crystallizing membrane proteins for structure determination using lipidic mesophases

Ein detailliertes Protokoll zur Kristallisation von Membranproteinen durch Lipid-Mesophasen beschrieben. Diese Methode hat verschiedentlich schon als Lipid-kubischen Phase oder in meso-Methode bezeichnet. Die Methode hat sich gezeigt, dass sehr vielseitig, dass es verwendet wurde, um röntgenkristallographische Strukturen von prokaryotischen und eukaryotischen Proteine, Eiweiße, monomere, Homo-und Hetero-Multimere, chromophorhaltige und Chromophor-frei sind zu lösen, und alpha -Helix und beta-barrel-Proteine. Jüngste Erfolge mit in meso Kristallisation sind die Menschen entwickelt, beta2-adrenerge und Adenosin A2a G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. Protokolle sind für die Wiederherstellung der Membranprotein in den Monoolein-basierte Mesophase, und für den Aufbau Kristallisationen in den manuellen Modus vorgestellt. Weitere Schritte in den gesamten Prozess, wie Kristall-Ernte werden in Zukunft Video-Artikel angesprochen werden. Die benötigte Zeit, um das Protein-beladenen Mesophase vorzubereiten und die Einrichtung einer Kristallisation Platte manuell über eine Stunde.

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Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Hierin ist das Verfahren in der Caffrey Membrane Strukturelle und funktionelle Biology Group manuell einrichten Kristallisation Studien von Membranproteinen in lipidic Mesophasen implementiert beschrieben.

Crystallizing Membranproteinen zur Strukturaufklärung mittels Lipidische Mesophasen

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

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29.8K Aufrufe.  Trinity College Dublin. Hierin ist das Verfahren in der Caffrey Membrane Strukturelle und funktionelle Biology Group manuell einrichten Kristallisation Studien von Membranproteinen in lipidic Mesophasen implementiert beschrieben.

Serie: Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

Die Bedeutung der richtigen Protein-Konzentration für Kinetik und Affinity Bestimmung in Struktur-Funktions-Analyse

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Forschung

Biologie

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Die Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren und Proteinen Mit dem Micro-Volumen Bio-spec Nano-Spektralphotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen mit dem Lipidische Bicellen Methode

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

Einsatz eines Roboters für High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Ernte-und Cryo-Kühlung Kristalle von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen zur Strukturaufklärung von Makromolekulare Kristallographie Grown

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

Handy-Tracking Mit Photoconvertible Proteine ​​während der Zebrafisch-Entwicklung

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed "high-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension", or SHAPE, allows prediction of RNA secondary structure with single nucleotide resolution. This approach utilizes chemical probing agents that preferentially acylate single stranded or flexible regions of RNA in aqueous solution. Sites of chemical modification are detected by reverse transcription of the modified RNA, and the products of this reaction are fractionated by automated capillary electrophoresis (CE). Since reverse transcriptase pauses at those RNA nucleotides modified by the SHAPE reagents, the resulting cDNA library indirectly maps those ribonucleotides that are single stranded in the context of the folded RNA. Using ShapeFinder software, the electropherograms produced by automated CE are processed and converted into nucleotide reactivity tables that are themselves converted into pseudo-energy constraints used in the RNAStructure (v5.3) prediction algorithm. The two-dimensional RNA structures obtained by combining SHAPE probing with in silico RNA secondary structure prediction have been found to be far more accurate than structures obtained using either method alone.

High-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) utilizes a novel chemical probing technology, reverse transcription, capillary electrophoresis and secondary structure prediction software to determine the structures of RNAs from several hundred to several thousand nucleotides at single nucleotide resolution.

RNA Secondary Structure Prediction Mit High-Throughput-SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Intravitalmikroskopie zur Imaging subzellulärer Strukturen in lebenden Mäusen Ausdruck Fluoreszierende Proteine

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...