Diese Arbeit wurde vom National Cancer Institute Zuschüsse R01 CA120368, R01 CA109558 (KMT, RWH, FEG, BWP), RO1 CA132750 (MJ, BWP) und K25 CA138578 (FL) finanziert worden ist, und kanadischen Institutes of Health Research Postdoc-Stipendium ausgezeichnet (KMT ). Die Entwicklung der Fluoreszenz-Tomographie-System wurde teilweise durch die Advanced Research Technologies (Montreal, QC) gefördert.

1. Tierische Vorbereitung <ol><li> Anesthetize Nacktmaus (Charles River, Wilmington, MA) mit intraperitonealen Injektion von Ketamin-Xylazin (100 mg / kg: 10 mg / kg ip). </li><li> Bewegen Sie die Maus in stereotaktischen Rahmen, einen Einschnitt in die Kopfhaut auf der linken Seite des Schädels und unter Verwendung einer 18-Gauge-Nadel, erstellen Sie eine 1 mm-Durchmesser-Loch in den Schädel 2 mm von der Mittellinie und 2 mm hinter der Bregma. </li><li> Injizieren Sie 5 x 10 5 U251 humanen neuronalen Zellen des Glioblastoms (freundlicherweise von Dr. Mark Israel am Dartmouth College, Hanover, NH zur Verfügung gestellt) in 5 ul Phosphatpuffer-Lösung in der linken Gehirnhälfte in einer Tiefe von ca. 2 mm unterhalb der Oberfläche der Gehirn. Verwenden Sie einen Hamilton Mikro-Spritze 18 und ein stumpfes Ende 27-Gauge-Nadel für die Zelltransplantation und legen Sie die Spitze der Nadel 3 mm von der äußeren Oberfläche des Schädels und dann zurücktreten 1 mm, um eine Tasche für die Zellen zu schaffen. </li><li> Nahteinschnitt Website und lassen Sie wiederEntdeckung von der Operation. </li><li> Warten ~ 14 Tage, damit der Tumor zu wachsen, bevor Bildgebung. </li></ol> 2. Fluoreszenz-Tomographie-System Calibration <ol><li> Am Tag der Maus Imaging, zu initiieren und ermöglichen Laser und Lichtdetektoren zu Warm-up für ca. 20 Minuten, um Drifts in Empfindlichkeit des Systems zu vermeiden. </li><li> Legen Sie eine 100 °-durch-4 ° gentechnisch Linie Diffusor (Thorlabs, Newton, NJ) bei der direkten Zentrum der Bildgebung Gantry, senkrecht zu dem Anregungslaser: eine Pikosekunden-gepulsten 80-MHz-Multimode 635 nm Laserdiode (PicoQuant Photonics North America Inc., Westfield, MA). Stellen Sie den Winkel des Diffusors auf den Anteil des Signals von allen fünf Kanälen Licht Sammlung entdeckt zu maximieren. Eine vollständige Beschreibung der Bildgeometrie ist an anderer Stelle 11,14,15 zur Verfügung gestellt. </li><li> Zeigen OD 2 Neutralfilter (Thorlabs, Newton, New Jersey) vor allen Fluoreszenzdetektion Photomultipliern (PMT) und OD 1 Neutralfilter (Thorlabs, Newton, New Jersey) vor allen Transmission Erkennung PMTs. Sammeln Sie 100 zeitliche Pulsform Ausbreitung Profile (TPSF) des Lasers, die jeweils mit einem 1-s Integrationszeit. </li><li> Normalisieren jeder TPSF durch den Laser Referenz für korrekte zeitliche Drift in der Laserreferenzebene und Mittel über alle Iterationen für jeden Detektor. Diese gemittelten TPSFs sind die Detektor-spezifisches Instrument Antwortfunktionen (IRF) in dem optischen Bildrekonstruktion verwendet. </li></ol> 3. Imaging Protocol <ol><li> Anesthetize die Maus mit 2% Isofluran (1 L / min). </li><li> Inject 1 Nanomol IRDye 800CW-EGF und 1 Nanomol von Alexa Fluor 647 in 100 ul Phosphatpufferlösung, intraperitoneal, 12 h vor der Bebilderung zu epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor-Überexpression im Tumor zielen. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf die Glasfaser unterstützt der bildgebenden Bett, Arrangieren mit der Maus, so dass seine Nase noch in einem Kegel liefert Isofluran-Narkose. </li><li> EnSie sicher, dass die Maus in geeigneter Weise auf dem Bett angeordnet: Das bedeutet, dass, wenn das Bett in der Fluoreszenz-Tomographie-System befestigt ist die Maus in der ungefähren Mitte des bildgebenden Gantry ist. Diese Positionierung kann durch Drehen des Anregungs-Laser 180 ° um die Maus, dass der Brennpunkt des Lasers einen Punkt beleuchtet etwa auf der Mitte der Maus aus der Perspektive des Lasers bei allen Winkeln geführt werden. </li><li> Einmal positioniert, übertragen Sie sorgfältig die Bildgebung Bett und Maus an den MicroCT (eXplore Locus, GE Healthcare, London, ON) Scanner und anatomischen Informationen sammeln bei einer Auflösung von 93-isotropen um für den ganzen Kopf der Maus. </li><li> Visualisieren des CT-Bildes Stapel und wählen die Scheibe (n) mit der Fluoreszenz-Tomographie-System abgebildet werden. </li><li> Sorgfältig überweisen Sie den Imaging-Bett und Maus zurück in die Fluoreszenz-Tomographie-System. Wählen Sie die Anzahl der Positionen Quelle, um Daten über die Maus für jeden Bildgebung SLIC sammelne (32), die Integrationszeit für jeden TPSF Messung (1 s), die Anzahl der Iterationen für jede Quellenposition (10) und die Position und Anzahl der gewünschten Bildgebungsgebiet Scheiben aus dem CT-Bild Stapel von Schritt 3.6. Die Zahlen in Klammern sind typische Werte für die einzelnen bildgebenden Parameter Nachgeben ~ 5 Minuten der Datenerfassung pro Bilderzeugungsscheibe. </li><li> Legen Triple Notch-Filter (Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT) vor der Fluoreszenzdetektion PMTs, um jede Laserlicht erreicht die Fluoreszenz-Detektoren zu beschränken, und OD 2 Neutralfilter vor der Durchlässigkeit Detektion PMTs Sättigung zu vermeiden dieser Detektoren. </li><li> Führen Sie die Software zur Datenerfassung, Sammeln Fluoreszenz und Transmission TPSFs an jedem definierten Quelle-Detektor Position und für jede Anregungswellenlänge (635 nm und 755 nm, die Alexa Fluor 647 und IRDye 800CW EGF-Tracer, bzw. zu erregen). Für jeden Satz von TPSFs gesammelt, überwachen und aufzeichnen die Laserintensitätmit einem Referenzwert PMT-Kanal. </li></ol> 4. Bildrekonstruktion <ol><li> Bestimmen Sie die äußere Oberfläche der Maus und die Lage der Imaging-Bett Haltestangen aus den CT-Bildern und erstellen Masken, die die Grenzen der Maus und die Imaging-Stangen separat behandelt. </li><li> Benutzen Sie die Maus-Maske, um eine Finite-Elemente-Netz des Tieres mit der Software NIRFAST 19 zu produzieren. </li><li> Lokalisieren der Quelle und der Detektor Positionen von der Fluoreszenz-Tomographie-System auf der Oberfläche des Netzes auf MicroCT und Fluoreszenz räumlichen Koordinaten-Registrierung 20 basierend. </li><li> Entfernen optischen Datenpunkte mit Quelle oder des Detektors Positionen, die mit dem Standort der Aufnahmebett Haltestäbe Interaktion assoziiert. </li><li> Normalisieren von Daten an jedem Quelle-Detektor Position von der Laser-Referenz gesammelt, für korrekte zeitliche Drift in der Laser-Referenz, und richtig für Filter-Empfindlichkeiten, die durch experimentelle Prüfung ermittelt wurden<html> zum Zeitpunkt des Kaufs 15. </li><li> Nehmen Sie das Geboren Verhältnis der Daten (Fluoreszenz, die durch Transmission geteilt) für jede Quelle-Detektor-Position und vermehren sich mit einem Forward-Modell Simulation der Transmission auf der Finite-Element-Tier-Mesh für eine einheitliche optische Eigenschaften. Dies geschieht, um Fehler mit der Source-Detektor-Gewebe Kupplung 21 zu mindern, um die Daten in der Modell 22 zu kalibrieren, und die Daten für andere Aspekte der Modell-Daten Fehlanpassung 23,24 einzustellen. </li><li> Konstruieren Sie einen Datenvektor des skalierten Differenz der Daten geboren Verhältnis bei beiden Wellenlängen gesammelt komponiert. Der Skalierungsfaktor wird gewählt, um EGFR verbindlich Gegensatz zu maximieren. Führen Zeitbereichs-Bildrekonstruktion mit der kalibrierten Daten unter Verwendung der Differenz TPSF für jeden Detektionskanal als eine Eingabe, und schaffen Fluoreszenz Karten des kontrastverstärkten gezielte Tracer 15. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse &quot;&gt; Ein Beispiel eines Fluoreszenz-Rekonstruktion mit einem Co-registrierten CT anatomische Bild aus dem Kopf einer Maus mit einem U251 orthotopen Gliom Tumor in 1b dargestellt überlagert. Der Masseschwerpunkt des Glioms von der fluoreszierenden Rekonstruktion (1b bestimmt ) war maximal 1 mm über dem Tumor Zentrum der Masse durch Kontrast-Verbesserung Magnetresonanz-Tomographie (Abbildung 1a) bestimmt. Die CT-und MRT-Bildern co-registriert wurden auf einer gegenseitigen Information-Transformation basiert. <img src="/files/ftp_upload/4050/4050fig1.jpg" alt="1" /> Abbildung 1. Kontrastverstärkte (Gadolinium) Magnet-Resonanz-Image der Maus Kopf (a). Die Maus wurde orthotop mit einem U251 menschliche Gliom-Zelllinie beimpft. Die Lage des Tumors, die mehr Kontrastmittel als das normale Gehirn absorbiert, kann in der linken Gehirnhälfte (rechts im Bild) zu sehen und durch den weißen Pfeil. Der Ausgangsort hatg Computertomographie-Bild (aus der gleichen Stelle auf dem Kopf Maus) ist in (b) mit den epidermalen Wachstumsfaktor gezielt Fluoreszenz abzüglich der ungezielte Fluoreszenz Rekonstruktion überlagert dargestellt. Die Einheiten der Fluoreszenz im umgekehrten mm und beziehen sich auf den Absorptionskoeffizienten des gebundenen Fluoreszenz durch gezielte ihre Quantenausbeute und durch seine Konzentration multipliziert.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Fluoreszenz-Tomographie (FT) ist ein sensibler, ionisierende Strahlung frei molekularen Bildgebungsverfahren auf sichtbaren und nahen infraroten Lichts Transport durch biologische Gewebe basieren. Die meisten der Interesse an FT hat sich auf sein Potenzial zur Wirkstoffforschung und-entwicklung in kleinen tierexperimentellen Modellen 1 und ein zentraler Bereich der Forschung war die Erforschung der Krebs-Biomarker-Expression und dem Ansprechen auf molekulare Therapien zu beschleunigen hat 26 konzentriert. Derzeit gibt es zwei konkurrierende Ansätze, um FT-System-Design. Die häufigste basiert auf gekühlten charge-coupled device (CCD) für die Fluoreszenzdetektion 4-9 bezogen. Dieser Entwurf stellt eine hohe Dichte von Messungen, die Maximierung Gewebeentnahmevorrichtung da jedes Pixel in der CCD-Kamera kann Licht, das einen eindeutigen Pfad gereist ist durch das Gewebe zu erfassen. Allerdings haben CCD-Kameras einen begrenzten Dynamikbereich und Ausleserauschen schränkt ihre ultimative Empfindlichkeit. Das zweite Design vermeidet die potenzielle Einschränkungen<html> gen der CCD-Kamera Detektion unter Verwendung hochempfindliche Single-Photon-Zähl-Technologie auf die Verwendung solcher Detektoren SEV-Röhren oder Avalanche-Photodioden 10-13 bezogen. Der Nachteil dieser empfindlichere Nachweismethoden ist, dass jeder Detektor kann nur sammeln Licht an einem einzigen Punkt, daher zu dichtem Gewebe Probenahme erreicht werden können, entweder viele Detektoren zu verwenden (was sehr teuer ist), oder viele Projektionen müssen abgebildet werden mit dem gleichen Detektor (das kann sehr zeitaufwändig sein). Während das optimale Niveau der Gewebeentnahme für Kleintier-FT noch nicht vereinbart worden ist, und darf nur von Fall zu Fall variieren, wird vereinbart, dass Single-Photon-Counting Instrumentierung besser geeignet ist, um die Empfindlichkeit Grenzen der FT in Bezug erkunden seiner Fähigkeit, geringen Konzentrationen molekularer Marker zu detektieren. In dieser Studie stellen wir eine Methodik für die Durchführung von FT mit Single-Photon-Counting-Erkennung Instrumentierung zu lokalisieren Tumoren in Mäusen. ENT &quot;&gt; Es gibt vier wichtige Schritte erforderlich, um robuste Datensätze mit zeitkorrelierten Single-Photon-Counting-FT zu produzieren. Die erste ist die Anwendung eines geeigneten und unkomplizierte Kalibrierung. In der vorgestellten Methodik werden die jeweiligen Sensibilitäten der einzelnen Detektionskanal entfielen durch Sammeln einer Baseline-Messung von Anregungslicht durch eine Leitung-Diffusor ausgebildet, um gleiche Anteile der Lichtmenge für jeden Detektor 15 zu richten übertragen. Ferner ist das detektierte Licht während eines Experiments kontinuierlich an den Laser Referenz kalibriert, sowohl in Bezug auf Intensität und Mittel .-Zeit, die im Laufe der Zeit schwanken kann, durch den Betrieb eines Lasers Referenzkanal 11,15 Die zweite kritische Schritt ist die genaue Erfassung und Co-Registration der anatomischen Bildgebung für geführte Fluoreszenz Rekonstruktionen Der FT-Daten allein bietet keine anatomische Information. daher, um ein Modell der leichten Transport zu schaffen, die verwendet werden, um die lo rekonstruierenKation Leuchtstofflampen in einer Probe aus der detektierten Fluoreszenz an der Oberfläche der Probe, muss die Anatomie der Probe in Bezug auf die FT-System genau bekannt sind. In unserem System wird die anatomische Information von einem Mikro-Computertomographie mit räumlichen Koordinaten, die räumlich sind mit denen des FT-System registriert 15,20 erworben. Der dritte kritische Schritt sorgen, daß sich eine optimale Belichtung (dh insgesamt Photonendetektion für jede Laserprojektionseinheit) in jedem Quelle-Detektor-Position eingesetzt wird. Dies ist aus zwei Gründen wichtig: erstens, um sicherzustellen, dass es ein ausreichendes Signal-Rausch-bei jeder Erfassung Position und der zweiten zu dem Detektor Sättigung, die die Detektion Geräte beschädigen könnten, zu vermeiden. Um eine optimale Belichtung bei jedem Detektor Position zu erreichen, eine automatische Belichtungssteuerung verwendet wird, die im wesentlichen trianguliert die optimale Belichtung von zwei, Low-Signal Forderungen 14. Das vierte kritischeSchritt der Methode verweist die gesammelten Fluoreszenzdaten auf die Menge der übertragenen Anregungslicht. Diese Referenzierung wird oft das Verhältnis Born genannt, und bietet viele Vorteile für die FT, mit dem im wesentlichen darauf eine Milderung der Modell-Daten Fehlanpassungsfehlern 23,24. Das vorgestellte System wurde entwickelt, um sowohl Fluoreszenz-und Durchlicht Anregungslicht gleichzeitig zu erkennen, indem jedes Jahr das Licht in jeden Detektionskanal in 2 separate Photovervielfacherröhren. Auf diese Weise vermeiden wir irgendwelche Auswirkungen von Bewegung auf die Richtigkeit der Born-Verhältnis. Mit einem robusten Datensatz es Hand, beinhaltet Bildrekonstruktion der Time-Domain-Daten Lösung des inversen Problems der Finite-Elemente-Netz mit dem Ausdruck: d = Jx wobei d ein Vektor mit N x M-Elemente für n Quelle-Detektor-Vorsprünge und m TPSF Zeitgatter, J ist ein n x m-mal-l Sensitivitätsmatrix (oder Jacobi), für l Knoten in dem Netz, und x der Vektor der Fluoreszenz optischen Eigenschaften in jedem Knoten, mit einer Größe L d die kalibrierten Daten während des Experiments und J gesammelt simuliert mit Hilfe der Finiten-Elemente-Lösung. in den Zeitbereich Diffusionsnaeherung der Fluoreszenz Transport 25. Die Zeit-Dimension von J ist auch mit dem Detektor spezielles Instrument Antwortfunktionen gefaltet. X ist eine Darstellung der Fluoreszenz Karte von Interesse ist und für die Verwendung eines Levenberg-Marqardt nichtnegative kleinsten Quadrate mit Tikhonov Regularisierung 15 gelöst. Die hier vorgestellten Methode, die beschreibt ein Verfahren zur Lokalisierung der Lage fluoreszenzmarkierten Tumoren in Mäusen mit hochsensiblen Photonenzählung Fluoreszenzdetektion, hat das Potential, die Grenzen der FT zu drücken. In einer früheren Studie, beschäftigt das Potenzial diesesAnsatz in larger-than-Mäusen Tiere Modelle, wie Ratten, sowie eine verbesserte Empfindlichkeit gegenüber bestehenden System-Designs in Maus-Größe Proben wurde 17 demonstriert. Die unmittelbare Anwendung dieses Ansatzes würde für die Überwachung der Biomarker-Expression in vivo in kleinen Tiertumormodellen zu der Wirksamkeit von Arzneimitteln in einem Hochdurchsatz-Mittel zu beurteilen. Die Fähigkeit des Systems zu erregen und erkennen Fluoreszenz bei verschiedenen Wellenlängen ermöglicht die gleichzeitige Erfassung mehrerer Fluoreszenzmarker. Zusätzliche fluoreszierende Marker ein Mittel zur Abfrage mehrerer Aspekte einer Pathologie, gleichzeitig, oder könnte verwendet werden, wie in dieser Studie werden, um weitere quantitative Bildgebung Ansätze wie Dual-Reporter Methoden zur Messung der in vivo-Bindung Potenzial, ein Marker der Rezeptordichte beschäftigen 26,27.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> IRDye 800CW-EGF </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 926-08446 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647, Succinimidylester </td><td> Life Technologies </td><td> A20106 </td><td> Reagiert mit Wasser, um nicht-spezifische Bindung zu minimieren </td></tr></tbody></table>

computed tomography-guided time-domain diffuse fluorescence tomography in small animals for localization of cancer biomarkers

Kleintier-Fluoreszenz molekulare Bildgebung (FMI) kann ein mächtiges Werkzeug für die präklinische Wirkstoffforschung und-entwicklung Studien 1 sein. Jedoch Lichtabsorption durch Gewebe Chromophore (zB Hämoglobin, Wasser, Lipide, Melanin) typischerweise begrenzt optischen Signalausbreitung durch Dicken größer als ein paar Millimeter 2. Im Vergleich zu anderen sichtbaren Wellenlängen, Gewebeabsorption für rote und nahes Infrarot (NIR-) Lichtabsorption dramatisch abnimmt und nicht-elastische Streuung wird die dominante Licht-Gewebe-Wechselwirkung Mechanismus. Die relativ neue Entwicklung von fluoreszierenden Mittel, und absorbieren Licht im nahen IR-Bereich (600-1000 nm), hat die Entwicklung von Bildverarbeitung und Lichtausbreitung Modelle von ganzen Körper dreidimensionalen Bildgebung in Kleintieren 3 kann erreicht angetrieben. Trotz großer Fortschritte in diesem Bereich bleibt die schlecht gestellte Natur der diffuse Fluoreszenz-Tomographie eine deutlicheProblem für die Stabilität, Kontrast Erholung und räumliche Auflösung der Bildrekonstruktionstechniken und die optimale Herangehensweise an FMI bei Kleintieren muss noch vereinbart werden. Die Mehrheit der Forschungsgruppen haben in charge-coupled device (CCD)-basierte Systeme, die reichlich vorhandenen Gewebe-Sampling aber suboptimal Empfindlichkeit 4-9 liefern investiert, während unsere Gruppe und ein paar andere Systeme auf Basis von 10-13 sehr hohe Empfindlichkeit Detektoren verfolgt haben , dass zu diesem Zeitpunkt erlauben dichtem Gewebe Probenahme nur auf Kosten der niedrigen Bildgebung Durchsatz erreicht werden. Hier zeigen wir die Methodik für die Anwendung Single-Photon-Detection-Technologie in einem Fluoreszenz-Tomographie-System zu lokalisieren, eine krebsartige Hirnverletzung in einem Mausmodell. Die Fluoreszenz-Tomographie (FT)-System verwendet Einzelphotonenzählung mit Photomultiplier (PMT) und informative Zeitbereich Lichterfassungseinrichtung in einem berührungslosen Konformation 11. Dies ermöglicht eine gleichzeitige colwahl der übertragenen Anregung und Emission, und beinhaltet eine automatische Belichtungssteuerung Fluoreszenzanregung 14, Laser-Referenzierung, und Co-Registrierung mit einem kleinen Tier Computertomographie (MicroCT) System 15. Eine Nacktmaus-Modell wurde für die Bildgebung verwendet. Das Tier wurde mit einem orthotop menschliche Gliom-Zelllinie (U251) in der linken Gehirnhälfte geimpft und bebildert 2 Wochen später. Der Tumor wurde durch Einspritzen eines Fluoreszenz-Tracer fluoreszieren, IRDye 800CW-EGF (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) gezielt auf epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor, ein Zellmembranprotein bekannt, in der U251 Tumorzelllinie überexprimiert und vielen anderen Krebsarten 18. Eine zweite, ungezielte fluoreszierender Tracer, Alexa Fluor 647 (Life Technologies, Grand Island, NY) wurde ebenfalls zur Rechenschaft für Nicht-Rezeptor-vermittelte Effekte injiziert auf die Aufnahme der gezielten Tracer, ein Mittel zur Quantifizierung der Bindung des Tracers und Rezeptor-Verfügbarkeit / Dichte liefern 27. Eine CT-gesteuerte, time-Domäne-Algorithmus wurde verwendet, um den Standort der beiden fluoreszierenden Tracern (dh die Lage des Tumors) im Gehirn der Maus und ihre Fähigkeit zur Lokalisation des Tumors durch Kontrastmittel-Kernspintomographie wurde bestätigt, zu rekonstruieren. Obwohl für die Fluoreszenz-Bildgebung in einem Gliom Mausmodell gezeigt, kann die Methode in diesem Video vorgestellt, um verschiedene Tumor-Modellen in verschiedenen kleinen Tiermodellen potenziell bis zu der Größe einer Ratte 17 verlängert.

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Computed Tomography-guided Time-domain Diffuse Fluorescence Tomography in Small Animals for Localization of Cancer Biomarkers

Diffuse Fluoreszenz-Tomographie bietet eine relativ kostengünstige und potenziell hoher gesamten Ansatz für präklinische<em&gt; In-vivo-</em&gt; Tumordarstellung. Die Methodik der optischen Datenerfassung, Kalibrierung und Bildrekonstruktion für eine Computertomographie-geführte berührungslosen Zeitbereichs-System unter Verwendung von fluoreszierenden Ausrichtung der Tumorbiomarker epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor in einem Maus-Gliom-Modell dargestellt.

Computertomographie-gesteuerte Time-Domain diffuse Fluoreszenz-Tomographie in der Kleintiere für die Lokalisierung von Krebs-Biomarker

Small animal fluorescence molecular imaging (FMI) can be a powerful tool for preclinical drug discovery and development studies1. However, light ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

12.2K Aufrufe.  Dartmouth College. Diffuse Fluoreszenz-Tomographie bietet eine relativ kostengünstige und potenziell hoher gesamten Ansatz für präklinische In-vivo- Tumordarstellung. Die Methodik der optischen Datenerfassung, Kalibrierung und Bildrekonstruktion für eine Computertomographie-geführte berührungslosen Zeitbereichs-System unter Verwendung von fluoreszierenden Ausrichtung der Tumorbiomarker epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor in einem Maus-Gliom-Modell dargestellt.

Serie: Computed Tomography-guided Time-domain Diffuse Fluorescence Tomography in Small Animals for Localization of Cancer Biomarkers

Retrograde Perfusion and Filling of Mouse Coronary Vasculature as Preparation for Micro Computed Tomography Imaging

Visualization of the vasculature is becoming increasingly important for understanding many different disease states. While several techniques exist for imaging vasculature, few are able to visualize the vascular network as a whole while extending to a resolution that includes the smaller vessels1,2. Additionally, many vascular casting techniques destroy the surrounding tissue, preventing further analysis of the sample3-5. One method which circumvents these issues is micro-Computed Tomography (&mu;CT). &mu;CT imaging can scan at resolutions &lt;10 microns, is capable of producing 3D reconstructions of the vascular network, and leaves the tissue intact for subsequent analysis (e.g., histology and morphometry)6-11. However, imaging vessels by ex vivo &mu;CT methods requires that the vessels be filled with a radiopaque compound. As such, the accurate representation of vasculature produced by &mu;CT imaging is contingent upon reliable and complete filling of the vessels. In this protocol, we describe a technique for filling mouse coronary vessels in preparation for &mu;CT imaging.
Two predominate techniques exist for filling the coronary vasculature: in vivo via cannulation and retrograde perfusion of the aorta (or a branch off the aortic arch) 12-14, or ex vivo via a Langendorff perfusion system 15-17. Here we describe an in vivo aortic cannulation method which has been specifically designed to ensure filling of all vessels. We use a low viscosity radiopaque compound called Microfil which can perfuse through the smallest vessels to fill all the capillaries, as well as both the arterial and venous sides of the vascular network. Vessels are perfused with buffer using a pressurized perfusion system, and then filled with Microfil. To ensure that Microfil fills the small higher resistance vessels, we ligate the large branches emanating from the aorta, which diverts the Microfil into the coronaries. Once filling is complete, to prevent the elastic nature of cardiac tissue from squeezing Microfil out of some vessels, we ligate accessible major vascular exit points immediately after filling. Therefore, our technique is optimized for complete filling and maximum retention of the filling agent, enabling visualization of the complete coronary vascular network &#x2013; arteries, capillaries, and veins alike.

Visualization of the coronary vessels is critical to advancing our understanding of cardiovascular diseases. Here we describe a method for perfusing murine coronary vasculature with a radiopaque silicone rubber (Microfil), in preparation for micro-Computed Tomography (&mu;CT) imaging.

Retrograde Perfusion und Abfüllung von Maus Koronargefäße als Vorbereitung für die Mikro-Computertomographie Imaging

Visualization of the vasculature is becoming increasingly important for understanding many different disease states. While several techniques exist for ...

Forschung

Medizin

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

Multimodale Bildgebung von Angiogenese in einem Nude Rattenmodell der Brustkrebs Knochenmetastasen mittels Magnetresonanztomographie, volumetrische Computertomographie und Ultraschall

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Assessment of Viability of Human Fat Injection into Nude Mice with Micro-Computed Tomography

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft tissue filler as it is readily available, easily obtained, inexpensive, and inherently biocompatible.1 However, despite its burgeoning popularity, fat grafting is hampered by unpredictable results and variable graft survival, with published retention rates ranging anywhere from 10-80%. 1-3
To facilitate investigations on fat grafting, we have therefore developed an animal model that allows for real-time analysis of injected fat volume retention. Briefly, a small cut is made in the scalp of a CD-1 nude mouse and 200-400 &#181;l&#160;of processed lipoaspirate is placed over the skull. The scalp is chosen as the recipient site because of its absence of native subcutaneous fat, and because of the excellent background contrast provided by the calvarium, which aids in the analysis process. Micro-computed tomography (micro-CT) is used to scan the graft at baseline and every two weeks thereafter. The CT images are reconstructed, and an imaging software is used to quantify graft volumes.
Traditionally, techniques to assess fat graft volume have necessitated euthanizing the study animal to provide just a single assessment of graft weight and volume by physical measurement ex vivo. Biochemical and histological comparisons have likewise required the study animal to be euthanized. This described imaging technique offers the advantage of visualizing and objectively quantifying volume at multiple time points after initial grafting without having to sacrifice the study animal. The technique is limited by the size of the graft able to be injected as larger grafts risk skin and fat necrosis. This method has utility for all studies evaluating fat graft viability and volume retention. It is particularly well-suited to providing a visual representation of fat grafts and following changes in volume over time.

Fat grafting is an essential technique for reconstructing soft tissue deficits. However, it remains an unpredictable procedure characterized by variable graft survival. Our goal was to devise a mouse model that utilizes a novel imaging method to compare volume retention between differing techniques of fat graft preparation and delivery.

Beurteilung der Lebensfähigkeit der Menschen Fat Injektion in Nacktmäusen mit Micro-Computertomographie

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft ...

Using Micro-computed Tomography for the Assessment of Tumor Development and Follow-up of Response to Treatment in a Mouse Model of Lung Cancer

Lung cancer is the most lethal cancer in the world. Intensive research is ongoing worldwide to identify new therapies for lung cancer. Several mouse models of lung cancer are being used to study the mechanism of cancer development and to experiment with various therapeutic strategies. However, the absence of a real-time technique to identify the development of tumor nodules in mice lungs and to monitor the changes in their size in response to various experimental and therapeutic interventions hampers the ability to obtain an accurate description of the course of the disease and its timely response to treatments. In this study, a method using a micro-computed tomography (CT) scanner for the detection of the development of lung tumors in a mouse model of lung adenocarcinoma is described. Next, we show that monthly follow-up with micro-CT can identify dynamic changes in the lung tumor, such as the appearance of additional nodules, increase in the size of previously detected nodules, and decrease in the size or complete resolution of nodules in response to treatment. Finally, the accuracy of this real-time assessment method was confirmed with end-point histological quantification. This technique paves the way for planning and conducting more complex experiments on lung cancer animal models, and it enables us to better understand the mechanisms of carcinogenesis and the effects of different treatment modalities while saving time and resources.

We describe a method for the detection of tumor nodule development in the lungs of an adenocarcinoma mouse model using micro-computed tomography and its use for monitoring changes in nodule size over time and in response to treatment. The accuracy of the assessment was confirmed with end-point histological quantification.

Mit Micro-Computertomographie-zur Beurteilung der Tumorentwicklung und Follow-up der Reaktion auf die Behandlung in einem Maus-Modell von Lungenkrebs

Lung cancer is the most lethal cancer in the world. Intensive research is ongoing worldwide to identify new therapies for lung cancer. Several mouse ...

Combined Near-infrared Fluorescent Imaging and Micro-computed Tomography for Directly Visualizing Cerebral Thromboemboli

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of stroke than relying on indirect measurements, and will be a potent and robust vascular research tool. We use an optical imaging approach that labels thrombi with a molecular imaging thrombus marker&#160;&#8212; a Cy5.5 near-infrared fluorescent (NIRF) probe that is covalently linked to the fibrin strands of the thrombus by the fibrin-crosslinking enzymatic action of activated coagulation factor XIIIa during the process of clot maturation. A micro-computed tomography (microCT)-based approach uses thrombus-seeking gold nanoparticles (AuNPs) functionalized to target the major component of the clot: fibrin. This paper describes a detailed protocol for the combined in vivo microCT and ex vivo NIRF imaging of thromboemboli in a mouse model of embolic stroke. We show that in vivo microCT and fibrin-targeted glycol-chitosan AuNPs (fib-GC-AuNPs) can be used for visualizing both in situ thrombi and cerebral embolic thrombi. We also describe the use of in vivo microCT-based direct thrombus imaging to serially monitor the therapeutic effects of tissue plasminogen activator-mediated thrombolysis. After the last imaging session, we demonstrate by ex vivo NIRF imaging the extent and the distribution of residual thromboemboli in the brain. Finally, we describe quantitative image analyses of microCT and NIRF imaging data. The combined technique of direct thrombus imaging allows two independent methods of thrombus visualization to be compared: the area of thrombus-related fluorescent signal on ex vivo NIRF imaging vs. the volume of hyperdense microCT thrombi in vivo.

This protocol describes the application of combined near-infrared fluorescent (NIRF) imaging and micro-computed tomography (microCT) for visualizing cerebral thromboemboli. This technique allows the quantification of thrombus burden and evolution. The NIRF imaging technique visualizes fluorescently labeled thrombus in excised brain, while the microCT technique visualizes thrombus inside living animals using gold-nanoparticles.

Kombinierte Near-Infrarot-Fluoreszenz-Bildgebung und Mikrocomputertomographie für Direkt Visualizing Cerebral Thromboembolie

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of ...

Disposable Dosators for Pulmonary Insufflation of Therapeutic Agents to Small Animals

Development of new therapeutic products requires efficacy testing in an animal model. The pulmonary route of administration can be utilized to deliver drugs locally and systemically. Evaluation of dry powder aerosols necessitates an efficient dispersion mechanism to maintain high concentrations in an exposure chamber or for direct endotracheal administration. While solutions exist to expose animals by passive inhalation to dry powder aerosols, most require masses of powder in large excess of the dose delivered. This precludes conducting early feasibility studies as insufficient drug is available at the research or early development stage to support the dose delivery requirements for conventional aerosol delivery systems. When designing an aerosol drug product, aerodynamic performance can relate directly to delivery efficiency and efficacy. Dispersion of powder into an aerosol requires energy input sufficient to overcome interparticulate forces, and particle engineering approaches can substantially improve aerosol performance. We have developed a dispersion system (dosator) which can aerosolize engineered dry powder aerosols efficiently for the purpose of direct pulmonary insufflation, dispersion into an exposure system or generation for analytical purposes.

During development of drugs for pulmonary delivery, it is necessary to evaluate pharmacokinetics and efficacy in an animal model. We present a method to build a disposable aerosol dispersion system from of-the-shelf components that can be used to administer intrapulmonary dry powder aerosol to rodents.

Einweg-Dosierer für Lungen Insufflation von therapeutischen Wirkstoffen zu Kleintieren

Development of new therapeutic products requires efficacy testing in an animal model. The pulmonary route of administration can be utilized to deliver ...

Cone Beam Intraoperative Computed Tomography-based Image Guidance for Minimally Invasive Transforaminal Interbody Fusion

Transforaminal lumbar interbody fusion (TLIF) is commonly used for the treatment of spinal stenosis, degenerative disc disease, and spondylolisthesis. Minimally invasive surgery (MIS) approaches have been applied to this technique with an associated decrease in estimated blood loss (EBL), length of hospital stay, and infection rates, while preserving outcomes with traditional open surgery. Previous MIS TLIF techniques involve significant fluoroscopy that subjects the patient, surgeon, and operating room staff to non-trivial levels of radiation exposure, particularly for complex multi-level procedures. We present a technique that utilizes an intraoperative computed tomography (CT) scan to aid in placement of pedicle screws, followed by traditional fluoroscopy for confirmation of cage placement. Patients are positioned in the standard fashion and a reference arc is placed in the posterior superior iliac spine (PSIS) followed by intraoperative CT scan. This allows for image-guidance-based placement of pedicle screws through a one-inch skin incision on each side. Unlike traditional MIS-TLIF that requires significant fluoroscopic imaging during this stage, the operation can now be performed without any additional radiation exposure to the patient or operating room staff. After completion of the facetectomy and discectomy, final TLIF cage placement is confirmed with fluoroscopy. This technique has the potential to decrease operative time and minimize total radiation exposure.

The purpose of this article is to provide image-guidance for minimally invasive transforaminal interbody fusion.

Kegelstrahl Intraoperative Computertomographie-basierte Bildführung für minimalinvasive transforaminale Interbody-Fusion

Transforaminal lumbar interbody fusion (TLIF) is commonly used for the treatment of spinal stenosis, degenerative disc disease, and spondylolisthesis. ...

Identifying Coronary Artery Calcification on Non-gated Computed Tomography Scans

Coronary artery calcification (CAC) provides an objective measure of coronary artery disease and can readily be identified on non-gated computed tomography (CT) scans with a high correlation with gated cardiac CT scans. This standardized protocol takes a step-wise approach to not only optimizing an image for the identification of calcification but also to distinguishing CAC from other common causes of calcification in the cardiac silhouette. Recognition of CAC on non-gated CT scans helps to identify a very powerful prognostic factor that can influence therapeutic interventions or downstream diagnostic testing without requiring a gated cardiac scan. These non-gated CT scans are often acquired as part of the routine care of the patient, and this data is readily available without another dose of&#160;ionizing radiation. This protocol allows for the precise and accurate extraction of this data for the purposes of retrospective data analysis in clinical research studies, but also in the clinical evaluation and management of patients.

Here, we present a protocol to reliably and systematically identify coronary artery calcification (CAC) on non-gated computed tomography (CT) scans of the chest or abdomen. CAC provides an objective measure of coronary artery disease for both research and clinical purposes.

Identifizierung von koronarer Verkalkungen auf berechnet Tomographie Scans nicht eingezäunt

Coronary artery calcification (CAC) provides an objective measure of coronary artery disease and can readily be identified on non-gated computed ...

Continuous Blood Sampling in Small Animal Positron Emission Tomography/Computed Tomography Enables the Measurement of the Arterial Input Function

For quantitative analysis and bio-kinetic modeling of positron emission tomography/computed tomography (PET/CT) data, the determination of the temporal blood time-activity concentration also known as arterial input function (AIF) is a key point, especially for the characterization of animal disease models and the introduction of newly developed radiotracers. The knowledge of radiotracer availability in the blood helps to interpret PET/CT-derived data of tissue activity. For this purpose, online blood sampling during the PET/CT imaging is advisable to measure the AIF. In contrast to manual blood sampling and image-derived approaches, continuous online blood sampling has several advantages. Besides the minimized blood loss, there is an improved resolution and a superior accuracy for the blood activity measurement. However, the major drawback of online blood sampling is the costly and time-consuming preparation to catheterize the femoral vessels of the animal. Here, we describe an easy and complete workflow for catheterization and continuous blood sampling during small animal PET/CT imaging and compared it to manual blood sampling and an image-derived approach. Using this highly-standardized workflow, the determination of the fluorodeoxyglucose ([18F]FDG) AIF is demonstrated. Further, this procedure can be applied to any radiotracer in combination with different animal models to create fundamental knowledge of tracer kinetic and model characteristics. This allows a more precise evaluation of the behavior of pharmaceuticals, both for diagnostic and therapeutic approaches in the preclinical research of oncological, neurodegenerative and myocardial diseases.

Here a protocol for continuous blood sampling during PET/CT imaging of rats to measure the arterial input function (AIF) is described. The catheterization, the calibration and setup of the system and the data analysis of the blood radioactivity are demonstrated. The generated data provide input parameters for subsequent bio-kinetic modeling.

Kontinuierliche Blutentnahme in der Kleintier-Positronen-Emissionstomographie/Computertomographie ermöglicht die Messung der arteriellen Eingabefunktion

For quantitative analysis and bio-kinetic modeling of positron emission tomography/computed tomography (PET/CT) data, the determination of the temporal ...

Four-Dimensional Computed Tomography-Guided Valve Sizing for Transcatheter Pulmonary Valve Replacement

The measurements of the right ventricle (RV) and pulmonary artery (PA), for selecting the optimal prosthesis size for transcatheter pulmonary valve replacement (TPVR), vary considerably. Three-dimensional (3D) computed tomography (CT) imaging for device size prediction is insufficient to assess the displacement of the right ventricular outflow tract (RVOT) and PA, which could increase the risk of stent misplacement and paravalvular leak. The aim of this study is to provide a dynamic model to visualize and quantify the anatomy of the RVOT to PA over the entire cardiac cycle by four-dimensional (4D) cardiac CT reconstruction to obtain an accurate quantitative evaluation of the required valve size. In this pilot study, cardiac CT from sheep J was chosen to illustrate the procedures. 3D cardiac CT was imported into 3D reconstruction software to build a 4D sequence which was divided into eleven frames over the cardiac cycle to visualize the deformation of the heart. Diameter, cross-sectional area, and circumference of five imaging planes at the main PA, sinotubular junction, sinus, basal plane of the pulmonary valve (BPV), and RVOT were measured at each frame in 4D straightened models prior to valve implantation to predict the valve size. Meanwhile, dynamic changes in the RV volume were also measured to evaluate right ventricular ejection fraction (RVEF). 3D measurements at the end of the diastole were obtained for comparison with the 4D measurements. In sheep J, 4D CT measurements from the straightened model resulted in the same choice of valve size for TPVR (30 mm) as 3D measurements. The RVEF of sheep J from pre-CT was 62.1 %. In contrast with 3D CT, the straightened 4D reconstruction model not only enabled accurate prediction for valve size selection for TPVR but also provided an ideal virtual reality, thus presenting a promising method for TPVR and the innovation of TPVR devices.

This study assessed a new methodology with a straightened model generated from the four-dimensional cardiac computed tomography sequence to obtain the desired measurements for valve sizing in the application of transcatheter pulmonary valve replacement.

Vierdimensionale computertomographiegeführte Ventildimensionierung für den Austausch von Transkatheter-Pulmonalventilen

The measurements of the right ventricle (RV) and pulmonary artery (PA), for selecting the optimal prosthesis size for transcatheter pulmonary valve ...