Wir danken Dr. Kelly Stevens für erste Versuche des Protokolls, Dr. Michael Simons, Dr. Kip Hauch, und die Mitglieder der beiden ihre Labore für allgemeine Diskussionen. Diese Arbeit ist die Unterstützung durch Zuschüsse NIH HL087513 und P01 HL094374.

1. Vorbereitungen vor dem Start <ol><li> Füllen jeder Seite der Druck-Perfusion mit Vasodilator-Puffer (4 mg / l Papaverin + 1 g / l Adenosin in PBS) oder 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS, jeweils. </li><li> Bereiten Sie eine 1/2cc Insulinspritze (mit einer dauerhaft befestigten 29G ½ &quot;Nadel) durch Füllen mit 0,1 ml der 1:100 Heparin (5000 E Lager) und Biegen der Nadel auf ~ 120-Grad-Winkel mit der Fase auf. Haben die dasselbe mit einer 1 ml Spritze (mit einer 26G ½ &quot;Nadel) mit 0,3 ml gesättigter KCl-Lösung gefüllt. </li></ol> 2. Aussetzen des Herzens und Kanülierung der Aorta <ol><li> Betäuben die Maus mit Ihrer Narkose der Wahl. (Wir verwenden eine Überdosis eines Ketamin / Xylazin Mischung:. IP-Injektion von 130 mg / kg Ketamin und 8,8 mg / kg Xylazin in Kochsalzlösung) </li><li> Stecken Sie die narkotisierten Maus auf das Sezieren Tablett, ventralen Seite nach oben. Öffnen Sie die Bauchhöhle mit einem Einschnitt an der Mittellinie zurückziehen und die Hautum die Organe zu entlarven. Bewegen Sie den Darm zu einer Seite, um einen Bereich der hinteren Hohlvene (PVC) freizulegen. </li><li> Injizieren Sie Heparin-Lösung in das PVC. Wie Sie die Nadel zu extrahieren, decken Sie die Nadel Loch mit einem Wattestäbchen zu verhindern undicht und halten Sie ihn für einige Sekunden, bis die PVC-Wand Blutgerinnsel und Dichtungen. 2-3 Minuten warten für Heparin auf der ganzen Maus Umlauf zu zerstreuen. </li><li> Präparieren Sie das Zwerchfell und Brustkorb, so dass Sie das schlagende Herz zu beobachten. Langsam injizieren KCl-Lösung in der PVC bis das Herz Verhaftungen. </li><li> Löschen aller Organe unter der Membran und den Verbrauchsteuern der hintere Teil der Maus, so dass der Bereich der vorderen Membran intakt. Entfernen der Membran, wobei darauf geachtet, die PVC in der Nähe der Membran geschnitten, so dass die proximalen Abschnitt zum Herzen ist leicht in den nachfolgenden Schritten zu lokalisieren. </li><li> Suchen Sie das abgeschnittene Ende des Aorta. Setzen Sie einen langen Länge von 6-0 geflochtene Seidenfaden unter der Aorta wenige Millimeter vorderen herm das abgeschnittene Ende, so dass die Naht auf sich selbst zurück verdoppelt. Schneiden Sie diesen länger Naht in der Mitte so gibt es 2 Stück der Naht unter der Aorta sind. Legen Sie die Angiokatheter in das abgeschnittene Ende der Aorta (Abb. 1A, B) und binden jede Naht mit einem Doppel-Knoten, um die Angiokatheter in Position zu halten und verhindern, dass Rücken-Druck in der Aorta ein Auslaufen. </li></ol> 3. Perfusion und Microfil Injektion <ol><li> Schließen Sie das Angiokatheter dem Druck Perfusionsapparatur (Abb. 2) und beginnen Perfusion der Gefäße mit gefäßerweiternden Puffer (Abb. 1C) durch Pumpen des Perfusionsapparatur zu einem treibenden Druck von 100-110 mmHg. Überprüfen, dass Puffer wird durch Perfusion der Koronararterien, indem sichergestellt wird Flüssigkeit aus dem PVC austritt. Weiter für mindestens 3 Minuten oder bis die Perfusion Flüssigkeit aus der PVC-frei ist. (Mit den nächsten Schritten fortfahren, während Perfusion.) </li><li> Sezieren die Rippen und Stift zurück (oder entfernen) der Brustkorb um das Herz freizulegen. Einmal ausgesetzt, CA seinumsichtig nicht zu lassen das Herz austrocknen durch Quetschen Tropfen Puffer auf das Herz aus einem Puffer-getränkten Stück Gaze. Räumen Sie den Thymus, um den Aortenbogen aussetzen. Ligieren der drei wichtigsten Aortenäste mit 6-0 geflochtene Seidenfaden, um Flüssigkeit zu gewährleisten wird durch die Koronarien und nicht durch diesen größeren, mit geringem Widerstand Gefäße (Abb. 1D) umgeleitet. </li><li> Perfundieren das Herz mit Fixativ für 15 Minuten, dann mit Vasodilatation Puffer spülen für mindestens 2 Minuten. Unterdessen ligieren sowohl anterior Hohlvene zu Microfil austritt aus dem Herzen nach der Injektion (Abb. 1E) zu verhindern. Ort Nähte rund um die PVC-und der Aorta, aber nicht festziehen, bis sie nach dem Befüllen. </li><li> Bereiten Sie die Microfil (wie in der Tabelle der Reagenzien angegeben) und laden Sie sie in einer 1 ml Spritze. Füllen der Dissektion Tablett mit genügend Wasser, um den Katheter (um die Einführung von Luft zu verhindern, wenn von dem Infusionsschlauch Microfil Spritze) bestimmt. Trennen Sie die Perfusion apparatus aus dem Katheter und verbinden Sie das vorbereitete Microfil Spritze. </li><li> Spritzen Sie die Microfil in die Aorta bis gute Füllung der Koronararterien ist offensichtlich (Abb. 1F, 3A): Die Arterien werden zuerst zu füllen, und dann die Microfil wird &quot;Spill&quot; in die Kapillaren, wie die Gewebe spült mit der Farbe des Microfil. Wenn auf der venösen Seite, bewirkt, dass die hydrophobe Natur des Microfil es zunächst als eigenständige Sphären erscheinen, wie es von den kleineren Gefäßen austritt. Halten Sie die Microfil injizieren, bis eine kontinuierliche Spalte füllt die Adern. Vollständige Füllung wird offensichtlich sein, wenn die Microfil stetig in den Gefäßen, und es wird durch das PVC beendet. </li><li> Nach dem Füllen abgeschlossen ist, schnell ziehen die Fäden, die zuvor in der PVC und Aorta platziert wurden, um die elastischen Eigenschaften des Herzgewebes nicht mehr gequetscht die Microfil aus den Gefäßen zu verhindern. </li><li> Decken Sie das Herz mit feuchter Gaze (getränkt mit Wasser aus dem Sezieren Tablett) Zur Verhinderung seiner Austrocknung, und lassen Sie ihn für etwa 1 Stunde bei Raumtemperatur sitzen, bis der Microfil hat polymerisiert. Vermeiden Sie Druck von außen auf das Herz während der Polymerisation, wie das Anheben oder Drehen des Herzens in einem Versuch, einen frühen Blick auf die gefüllten Gefäße auf der Rückseite des Herzens zu bekommen. Dies kann Microfil von einigen Gefäßen gezielt in einer elastischen Bereich des Herzens, was Brüche in der Microfil. </li><li> Entfernen Sie das Herz und die Post-fix it in 4% PFA über Nacht bei 4 ° C. Dann in 70% Ethanol bei 4 ° C Das Herz Gefäßsystem ist nun bereit für μCT Bildgebung. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Schiffe, die von einer Microfil perfundiert werden müssen kontinuierlichen, ununterbrochenen Microfil in den Gefäßen (3A). Das Ausmaß der Befüllung der Herzkranzgefäße können mit dem Auge beurteilt werden; Venen werden epikardial 18 befindet, und kann leicht beobachtet werden (Abb. 3A, Pfeilspitze); Arterien,die mehr intramyokardialen 18, sind auch über die Oberfläche des Herzens (3A, Pfeil) sichtbar. Kapillare Befüllung ist auch ersichtlich, wie Herz-Gewebe hat eine sehr hohe Dichte von Kapillaren, und daher, wenn die Kapillaren Füllung, das Herzgewebe mit der Farbe des Microfil (3A, Stern) zu spülen. Somit werden alle Gefäßnetze, die zu füllen nicht wahrnehmbar sein aufgrund des Fehlens der Microfil (3B, C). Brüche in der Microfil (Sternchen in Abb. 3B) erscheinen oft, weil die hydrophobe Natur des Microfil dazu führt das er in sich selbst zusammenziehen und verursachen &quot;Pausen&quot; im gefüllten Gefäße. Diese &quot;Pausen&quot; kann reduziert werden, wenn der Druck innerhalb der Gefäße durch die richtige Krawatte-offs der vaskulären Ausspeisepunkte aus dem Herzen aufrechterhalten wird. Andere Unterbrechungen können durch Luftblasen innerhalb der Mikrofiltration verursacht werden. Um das Eindringen von Luft zu verhindern, stellen Sie sicher das Angiokatheter vollständig in Wasser getaucht, wenn das Umschalten von der Durchblutung ap<html> paratus dem Microfil Spritze. Wenn eine Luftblase eingeführt wird, kann es oft einfach nur durch die Fortsetzung des Microfil Perfusion bis die Blase wurde durch und schob aus der Herzkranzgefäße entfernt werden. Vaskuläre Netzen kann nicht vollständig ausfüllt, wenn ein Teil der Strombahn blockiert (3B, Pfeil). Während Heparin hemmt die Bildung von Blutgerinnseln, kann gelegentlich noch Blockaden aufgrund von unvollständigen Heparin Perfusion vor dem Beginn des Verfahrens oder durch andere unbekannte Faktoren auftreten. Wenn eine Verstopfung auftritt, gibt es nach unserem Wissen kein Verfahren zum Lösen der Blockierung des vaskulären Füllung abzuschließen. Unvollständige Füllung kann auch auftreten, wenn zu wenig Druck während der Befüllung, die Microfil nicht in allen Gefäßbetten und Kapillarnetzwerke (3C) gezwungen werden verwendet wird. Umgekehrt kann zu viel Druck verursachen die Kapillaren zu platzen und extravasieren Microfil in das umgebende Gewebe (Abb. 3D). files/ftp_upload/3740/3740fig1.jpg &quot;alt =&quot; Bild 1 &quot;/&gt; Abbildung 1. Übersicht über die Perfusion Microfil Schema. (A) Die Aorta und die PVC etwa auf Höhe der Membran geschnitten. (B) Die aufsteigende Aorta ist mit einem Angiokatheter kanüliert. (C) Vasodilatation Puffer wird durch die Gefäße, durch den Druck Perfusionsapparatur (nicht abgebildet) angetrieben, während perfundiert (D) die drei wichtigsten abzweigt des Aortenbogens ligiert werden. (D) 4% PFA wird durch die Koronarien perfundiert, während die beiden vorderen Vena Cava ligiert werden. (F) mit einer Spritze wird durch die Koronararterien Microfil perfundiert, bis es wird beobachtet, Austritt aus der PVC. <img src="/files/ftp_upload/3740/3740fig2.jpg" alt="2"/> Abbildung 2. Perfusionsapparatur. Zwei Erlenmeyerkolben, die jeweils entweder mit Vasodilatation Puffer oder 4% PFA gefüllt ist, verbunden sind und unter Druck durch Rohre verbunden, um ihre Seitenarme. Das System ist unter Druck durch manuelles Pumpen derGlühlampe und ein Manometer einem der Kolben verbunden ist für die Überwachung und Aufrechterhaltung des Drucks zu ermöglichen. Kleine Rohre erstrecken sich durch Gummistopfen und nach unten in die Flüssigkeit in jeder Flasche. Der Druck der Eingabe von den Seitenarmen pumpt die Flüssigkeit aus jedem Kolben aus dieser kleineren Röhren. Die Rohre dann verschmelzen zu einem Hahn, die nur erlaubt, um von einer Flüssigkeit Kolben zu einem Zeitpunkt, zu fließen. <img src="/files/ftp_upload/3740/3740fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Probieren Sie Mikrogefüllte Herzen. (A) Schiffe, die gut gefüllt sind, haben nur wenige (wenn überhaupt) Brüche in der Microfil, und das Herzgewebe wird färbte die Farbe des Microfil aufgrund der gefüllten Kapillaren (Stern, und vergleichen Sie mit C) sein. Beide Arterien (Pfeil - Ramus interventricularis anterior) und Venen (Pfeilspitze - Left Koronarvene) sind sichtbar durch das Herz Oberfläche. (B) Ein Herz mit Brüchen in der Microfil (Sternchen) sowie Blockaden in einigen Gefäßen, die komplette Mic verhindertRofil Penetration. Die blockierten Schiffe bleiben rot (Pfeil), wie das Blut nicht erfolgte während der Perfusion Prozess gespült. (C) Ein Herz mit Schiffen, die unvollständig ausgefüllt wurden. Beachten Sie, das Gewebe nicht auf die gelbe Farbe des Microfil genommen, was auf die Microfil nicht in die Kapillaren eindringen. (D) ein Herz, in dem die Kapillaren Burst während der Befüllung, wodurch die Microfil in das umgebende Gewebe (Pfeil) auslaufen.

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Reson. Med. 55, 858-864 (2006).</li><li>Wagner, S., Helisch, A., Ziegelhoeffer, T., Bachmann, G., Schaper, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+angiography+of+collateral+vessels+in+a+murine+femoral+artery+ligation+model.">Magnetic resonance angiography of collateral vessels in a murine femoral artery ligation model.</a> NMR in Biomedicine. 17, 21-27 (2004).</li><li>Cochet, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+MR+angiography+and+velocity+measurement+in+mice+coronary+arteries+at+9.4+T:+assessment+of+coronary+flow+velocity+reserve.">In vivo MR angiography and velocity measurement in mice coronary arteries at 9.4 T: assessment of coronary flow velocity reserve.</a> Radiology. , 254-441 (2010).</li></ol>

Die Mäuse wurden mit Methoden, die von der Institutional Animal Care und Use Committee der University of Washington und in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durch den US National Institutes of Health (NIH Publikation Nr. 85-23 veröffentlicht genehmigt behandelt, überarbeitet 1996).

Herzgewebe hat einen sehr hohen metabolischen Bedarf, und erfordert daher eine konstante Versorgung mit Nährstoffen und Sauerstoff aus dem Blut durch die Koronargefäße geliefert. Erkrankungen der Herzkranzgefäße, der koronaren Funktion aufgrund Gefäßstenose und Verstopfung zu verringern, kann das Gewebe Hypoxie und Ischämie führen, und setzen die betroffenen Patienten mit einem Risiko für Myokardinfarkt und zu irreparablen Schäden am Herzmuskel. Ein besseres Verständnis des erkrankten Zustand dieser Gefäße...

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> 1 ml-Spritzen </td><td> <a href="http://www.bd.com/" target="_blank">Becton Dickinson</a> </td><td> BD-309.602 </td><td></td></tr><tr><td> 1/2cc Insulin Spritzen mit fest 29G ½ &quot;Nadeln </td><td> <a href="http://www.bd.com/" target="_blank">Becton Dickinson</a> </td><td> BD-309.306 </td><td></td></tr><tr><td> 2 &quot;x 2&quot; Gaze-Pads </td><td> Med101store.com </td><td> SKU 2208 </td><td></td></tr><tr><td> 24G ¾ &quot;Angiocath IV-Katheter </td><td> <a href="http://www.bd.com/" target="_blank">Becton Dickinson</a> </td><td> BD-381.112 </td><td></td></tr><tr><td> 26G ½ &quot;Gauge-Nadeln </td><td>Lank &quot;&gt; Becton Dickinson </td><td> BD-305.111 </td><td></td></tr><tr><td> Adenosin </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">Sigma</a> </td><td> A9251 </td><td> 1 g / l in PBS für Vasodilatation Puffer (mit Papaverin) </td></tr><tr><td> Graefe Pinzette abgewinkelt </td><td> <a href="http://www.finescience.com/" target="_blank">Fine Science Tools</a> </td><td> 11052-10 </td><td></td></tr><tr><td> Wattestäbchen: 6 &quot;nicht-sterilen </td><td> <a href="http://www.cardinal.com/" target="_blank">Cardinal Health</a> </td><td> C15055-006 </td><td></td></tr><tr><td> Gebogene Chirurgische Schere </td><td> <a href="http://www.finescience.com/" target="_blank">Fine Science Tools</a> </td><td> 14085-09 </td><td></td></tr><tr><td> Dissecting Stereoskop und Lichtquelle </td><td> <a href="http://www.nikon.com/" target="_blank">Nikon</a> </td><td> NA </td><td> NA </td></tr><tr><td> Dissecting Tray, 11,5 x 7,5 cm </td><td> <a href="http://www.coleparmer.com/" target="_blank">Cole-Parmer</a> </td><td> YO-10915-12 </td><td> Gefüllt mit Teer für Pinning Sie die Maustaste </td></tr><tr><td> Feine einer gebogenen Pinzette </td><td> <a href="http://www.aesculapusa.com/" target="_blank">Aesculap</a> </td><td> FD281R </td><td> Brauchen Sie zwei </td></tr><tr><td> Heparin, 5000 U / ml Lager </td><td> <a href="http://www.apppharma.com/" target="_blank">APP Pharmaceuticals LLC</a> </td><td> NDC 63323-047-10 </td><td> 1:100-Verdünnung in Wasser </td></tr><tr><td> KCl </td><td> <a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">Fischer</a> </td><td> P217 </td><td> Gesättigte Lösung in H2O </td></tr><tr><td> Ketamin (Ketaset), 100 mg / ml Stammlösung </td><td> Fort Dodge, Overland Park, KS, USA </td><td> NDC 0856-2013-01 </td><td> Gemischt als 130 mg / kg Körpergewicht, mit Xylazin in 0,9% sAline </td></tr><tr><td> Microfil </td><td> <a href="http://www.flowtech-inc.com/" target="_blank">Flow Tech</a> </td><td> MV-122 (gelb). Andere Optionen sind ebenfalls erhältlich. </td><td> Mischen 1:1 nach Gewicht, mit 10 Vol.% Härtungsmittel. Bereiten Sie unmittelbar vor der Injektion und Wirbel zu gewährleisten, ist es gut gemischt </td></tr><tr><td> Nicht sterile Nahtmaterial: 6-0, geflochtene Seide </td><td> <a href="http://www.harvardapparatus.com/" target="_blank">Harvard Apparatus</a> </td><td> 723287 </td><td></td></tr><tr><td> Papaverin </td><td> <a href="http://www.americanregent.com/" target="_blank">American Regent Inc.</a> </td><td> NDC 0517-4010-01 </td><td> 4 mg / l in PBS für Vasodilatation Buffer (mit Adenosin) </td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">Sigma</a> </td><td> P6148 </td><td> Vorbereitet als 4% ige Lösung </td></tr><tr><td> Vorrichtung Perfusion </td><td></td><td></td><td> Siehe Abbildung 2 </td></tr><tr><td> Frühlings-Schere </td><td> <a href="http://www.finescience.com/" target="_blank">Fine Science Tools</a> </td><td> 15018-10 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazin (Anased), 20 mg / gl Lager </td><td> <a href="http://www.lloydlab.com/" target="_blank">Lloyd Labs</a> </td><td> NADA # 139-236 </td><td> Gemischt als 8,8 mg / kg Körpergewicht, mit Ketamin in 0,9% iger Kochsalzlösung </td></tr></tbody></table>

retrograde perfusion and filling of mouse coronary vasculature as preparation for micro computed tomography imaging

Visualisierung des Gefäßsystems wird immer wichtiger für das Verständnis von vielen verschiedenen Krankheitsstadien. Während verschiedene Techniken zum Abbilden Gefäßsystem vorhanden sind, sind einige fähig, die Blutgefäße als Ganzes zu visualisieren, während sich bis zu einer Auflösung, die den kleineren Gefäßen 1,2 umfasst. Außerdem zerstören viele Gefäßsystem Gusstechniken das umliegende Gewebe, wodurch eine weitere Analyse der Probe 5.3. Eine Methode, die diese Probleme umgeht ist Mikro-Computertomographie (μCT). μCT Bildgebung kann bei einer Auflösung &lt;10 Mikron zu scannen, ist in der Lage, 3D-Rekonstruktionen des Gefäßnetz, und verlässt das Gewebe intakt für die anschließende Analyse (zB Histologie und Morphometrie) 11.06. Allerdings erfordert Bildgebung Schiffe, die von Ex-vivo-Methoden μCT dass die Gefäße mit einem röntgendichten Verbindung gefüllt werden. Als solche ist die genaue Darstellung des Gefäßsystems durch μCT Bildgebung erzeugt abhängigzuverlässige und vollständige Füllung der Gefäße. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Technik zum Füllen Maus Herzkranzgefäße in Vorbereitung auf μCT Bildgebung. Zwei vorherrschenden Techniken existieren zum Füllen der Koronargefäße: in vivo über Kanülierung und retrograde Perfusion der Aorta (oder eine Abzweigung des Aortenbogens) 12-14, oder ex vivo über eine Langendorff-Perfusion System 15-17. Hier beschreiben wir eine In-vivo-Methode, die Aorten-Kanülierung wurde speziell entwickelt, um sicherzustellen, Füllung aller Schiffe. Wir verwenden eine niedrige Viskosität radiopake Verbindung als Microfil die durch die kleinsten Gefäße versorgen kann, um alle Kapillaren sowie sowohl die arteriellen und venösen Seiten des vaskulären Netzes zu füllen. Schiffe werden mit Puffer mit einem unter Druck Perfusionssystem perfundiert und dann mit Microfil gefüllt. Um sicherzustellen, dass Microfil füllt die kleinen Gefäße höheren Widerstand, ligieren wir die großen Äste emanating aus der Aorta, die die Microfil lenkt in die Koronarien. Sobald die Befüllung abgeschlossen, um die elastischen Eigenschaften des Herzgewebes nicht mehr gequetscht Microfil von einigen Gefäßen zu verhindern, unterbinden wir zugänglich vaskulärer Ausgänge unmittelbar nach dem Füllen. Daher wird unsere Technik zur vollständigen Füllung und maximale Retention des Füllmittels optimiert und ermöglicht die Visualisierung des gesamten koronaren vaskulären Netzwerk - Arterien, Kapillaren und Venen gleichermaßen.

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Retrograde Perfusion and Filling of Mouse Coronary Vasculature as Preparation for Micro Computed Tomography Imaging

Visualisierung der Herzkranzgefäße ist entscheidend für die Erweiterung der Kenntnisse über Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Hier beschreiben wir ein Verfahren zum Perfundieren murinen Koronargefäße mit einem röntgendichten Silikonkautschuk (Microfil), in Vorbereitung für die Mikro-Computertomographie (μCT) Bildgebung.

Retrograde Perfusion und Abfüllung von Maus Koronargefäße als Vorbereitung für die Mikro-Computertomographie Imaging

Visualization of the vasculature is becoming increasingly important for understanding many different disease states. While several techniques exist for ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

32.3K Aufrufe.  University of Washington. Visualisierung der Herzkranzgefäße ist entscheidend für die Erweiterung der Kenntnisse über Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Hier beschreiben wir ein Verfahren zum Perfundieren murinen Koronargefäße mit einem röntgendichten Silikonkautschuk (Microfil), in Vorbereitung für die Mikro-Computertomographie (μCT) Bildgebung.

Serie: Retrograde Perfusion and Filling of Mouse Coronary Vasculature as Preparation for Micro Computed Tomography Imaging

Segmentation and Measurement of Fat Volumes in Murine Obesity Models Using X-ray Computed Tomography

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are associated with obesity, though the precise underlying mechanisms that contribute to the disease are currently being delineated.2,3 Several small animal models of obesity have been developed and are employed in a variety of studies.4 A critical component to these experiments involves the collection of regional and/or total animal fat content data under varied conditions.
Traditional experimental methods available for measuring fat content in small animal models of obesity include invasive (e.g. ex vivo measurement of fat deposits) and non-invasive (e.g. Dual Energy X-ray Absorptiometry (DEXA), or Magnetic Resonance (MR)) protocols, each of which presents relative trade-offs. Current invasive methods for measuring fat content may provide details for organ and region specific fat distribution, but sacrificing the subjects will preclude longitudinal assessments. Conversely, current non-invasive strategies provide limited details for organ and region specific fat distribution, but enable valuable longitudinal assessment. With the advent of dedicated small animal X-ray computed tomography (CT) systems and customized analytical procedures, both organ and region specific analysis of fat distribution and longitudinal profiling may be possible. Recent reports have validated the use of CT for in vivo longitudinal imaging of adiposity in living mice.5,6 Here we provide a modified method that allows for fat/total volume measurement, analysis and visualization utilizing the Carestream Molecular Imaging Albira CT system in conjunction with PMOD and Volview software packages.

Fat content analysis is routinely conducted in studies utilizing murine obesity models. Emerging methods in small animal CT imaging and analysis are providing for longitudinal detail rich fat content analysis. Here we detail step by step procedures for performing small animal CT imaging, analysis, and visualization.

Segmentierung und Messung von FAT-Volumes in Murine Obesity Modellen mithilfe von Röntgen-Computertomographie

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are ...

Forschung

Medizin

Osmotic Drug Delivery to Ischemic Hindlimbs and Perfusion of Vasculature with Microfil for Micro-Computed Tomography Imaging

Preclinical research in animal models of peripheral arterial disease plays a vital role in testing the efficacy of therapeutic agents designed to stimulate microcirculation. The choice of delivery method for these agents is important because the route of administration profoundly affects the bioactivity and efficacy of these agents1,2. In this article, we demonstrate how to locally administer a substance in ischemic hindlimbs by using a catheterized osmotic pump. This pump can deliver a fixed volume of aqueous solution continuously for an allotted period of time. We also present our mouse model of unilateral hindlimb ischemia induced by ligation of the common femoral artery proximal to the origin of profunda femoris and epigastrica arteries in the left hindlimb. Lastly, we describe the in vivo cannulation and ligation of the infrarenal abdominal aorta and perfusion of the hindlimb vasculature with Microfil, a silicone radiopaque casting agent. Microfil can perfuse and fill the entire vascular bed (arterial and venous), and because we have ligated the major vascular conduit for exit, the agent can be retained in the vasculature for future ex vivo imaging with the use of small specimen micro-CT3.

We show here the in vivo insertion of an osmotic pump for constant local drug delivery and the creation of hindlimb ischemia in a mouse model. Moreover, the hindlimb vasculature is perfused with Microfil, a silicone radiopaque agent, to prepare for micro-computed tomography (micro-CT) imaging.

Osmotic Drug Delivery zu ischämischen Hinterbeine und Perfusion von Blutgefäßen mit Microfil für Mikro-Computertomographie

Preclinical research in animal models of peripheral arterial disease plays a vital role in testing the efficacy of therapeutic agents designed to ...

Assessment of Viability of Human Fat Injection into Nude Mice with Micro-Computed Tomography

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft tissue filler as it is readily available, easily obtained, inexpensive, and inherently biocompatible.1 However, despite its burgeoning popularity, fat grafting is hampered by unpredictable results and variable graft survival, with published retention rates ranging anywhere from 10-80%. 1-3
To facilitate investigations on fat grafting, we have therefore developed an animal model that allows for real-time analysis of injected fat volume retention. Briefly, a small cut is made in the scalp of a CD-1 nude mouse and 200-400 &#181;l&#160;of processed lipoaspirate is placed over the skull. The scalp is chosen as the recipient site because of its absence of native subcutaneous fat, and because of the excellent background contrast provided by the calvarium, which aids in the analysis process. Micro-computed tomography (micro-CT) is used to scan the graft at baseline and every two weeks thereafter. The CT images are reconstructed, and an imaging software is used to quantify graft volumes.
Traditionally, techniques to assess fat graft volume have necessitated euthanizing the study animal to provide just a single assessment of graft weight and volume by physical measurement ex vivo. Biochemical and histological comparisons have likewise required the study animal to be euthanized. This described imaging technique offers the advantage of visualizing and objectively quantifying volume at multiple time points after initial grafting without having to sacrifice the study animal. The technique is limited by the size of the graft able to be injected as larger grafts risk skin and fat necrosis. This method has utility for all studies evaluating fat graft viability and volume retention. It is particularly well-suited to providing a visual representation of fat grafts and following changes in volume over time.

Fat grafting is an essential technique for reconstructing soft tissue deficits. However, it remains an unpredictable procedure characterized by variable graft survival. Our goal was to devise a mouse model that utilizes a novel imaging method to compare volume retention between differing techniques of fat graft preparation and delivery.

Beurteilung der Lebensfähigkeit der Menschen Fat Injektion in Nacktmäusen mit Micro-Computertomographie

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft ...

Using Micro-computed Tomography for the Assessment of Tumor Development and Follow-up of Response to Treatment in a Mouse Model of Lung Cancer

Lung cancer is the most lethal cancer in the world. Intensive research is ongoing worldwide to identify new therapies for lung cancer. Several mouse models of lung cancer are being used to study the mechanism of cancer development and to experiment with various therapeutic strategies. However, the absence of a real-time technique to identify the development of tumor nodules in mice lungs and to monitor the changes in their size in response to various experimental and therapeutic interventions hampers the ability to obtain an accurate description of the course of the disease and its timely response to treatments. In this study, a method using a micro-computed tomography (CT) scanner for the detection of the development of lung tumors in a mouse model of lung adenocarcinoma is described. Next, we show that monthly follow-up with micro-CT can identify dynamic changes in the lung tumor, such as the appearance of additional nodules, increase in the size of previously detected nodules, and decrease in the size or complete resolution of nodules in response to treatment. Finally, the accuracy of this real-time assessment method was confirmed with end-point histological quantification. This technique paves the way for planning and conducting more complex experiments on lung cancer animal models, and it enables us to better understand the mechanisms of carcinogenesis and the effects of different treatment modalities while saving time and resources.

We describe a method for the detection of tumor nodule development in the lungs of an adenocarcinoma mouse model using micro-computed tomography and its use for monitoring changes in nodule size over time and in response to treatment. The accuracy of the assessment was confirmed with end-point histological quantification.

Mit Micro-Computertomographie-zur Beurteilung der Tumorentwicklung und Follow-up der Reaktion auf die Behandlung in einem Maus-Modell von Lungenkrebs

Lung cancer is the most lethal cancer in the world. Intensive research is ongoing worldwide to identify new therapies for lung cancer. Several mouse ...

Combined Near-infrared Fluorescent Imaging and Micro-computed Tomography for Directly Visualizing Cerebral Thromboemboli

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of stroke than relying on indirect measurements, and will be a potent and robust vascular research tool. We use an optical imaging approach that labels thrombi with a molecular imaging thrombus marker&#160;&#8212; a Cy5.5 near-infrared fluorescent (NIRF) probe that is covalently linked to the fibrin strands of the thrombus by the fibrin-crosslinking enzymatic action of activated coagulation factor XIIIa during the process of clot maturation. A micro-computed tomography (microCT)-based approach uses thrombus-seeking gold nanoparticles (AuNPs) functionalized to target the major component of the clot: fibrin. This paper describes a detailed protocol for the combined in vivo microCT and ex vivo NIRF imaging of thromboemboli in a mouse model of embolic stroke. We show that in vivo microCT and fibrin-targeted glycol-chitosan AuNPs (fib-GC-AuNPs) can be used for visualizing both in situ thrombi and cerebral embolic thrombi. We also describe the use of in vivo microCT-based direct thrombus imaging to serially monitor the therapeutic effects of tissue plasminogen activator-mediated thrombolysis. After the last imaging session, we demonstrate by ex vivo NIRF imaging the extent and the distribution of residual thromboemboli in the brain. Finally, we describe quantitative image analyses of microCT and NIRF imaging data. The combined technique of direct thrombus imaging allows two independent methods of thrombus visualization to be compared: the area of thrombus-related fluorescent signal on ex vivo NIRF imaging vs. the volume of hyperdense microCT thrombi in vivo.

This protocol describes the application of combined near-infrared fluorescent (NIRF) imaging and micro-computed tomography (microCT) for visualizing cerebral thromboemboli. This technique allows the quantification of thrombus burden and evolution. The NIRF imaging technique visualizes fluorescently labeled thrombus in excised brain, while the microCT technique visualizes thrombus inside living animals using gold-nanoparticles.

Kombinierte Near-Infrarot-Fluoreszenz-Bildgebung und Mikrocomputertomographie für Direkt Visualizing Cerebral Thromboembolie

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of ...

Identifying Coronary Artery Calcification on Non-gated Computed Tomography Scans

Coronary artery calcification (CAC) provides an objective measure of coronary artery disease and can readily be identified on non-gated computed tomography (CT) scans with a high correlation with gated cardiac CT scans. This standardized protocol takes a step-wise approach to not only optimizing an image for the identification of calcification but also to distinguishing CAC from other common causes of calcification in the cardiac silhouette. Recognition of CAC on non-gated CT scans helps to identify a very powerful prognostic factor that can influence therapeutic interventions or downstream diagnostic testing without requiring a gated cardiac scan. These non-gated CT scans are often acquired as part of the routine care of the patient, and this data is readily available without another dose of&#160;ionizing radiation. This protocol allows for the precise and accurate extraction of this data for the purposes of retrospective data analysis in clinical research studies, but also in the clinical evaluation and management of patients.

Here, we present a protocol to reliably and systematically identify coronary artery calcification (CAC) on non-gated computed tomography (CT) scans of the chest or abdomen. CAC provides an objective measure of coronary artery disease for both research and clinical purposes.

Identifizierung von koronarer Verkalkungen auf berechnet Tomographie Scans nicht eingezäunt

Coronary artery calcification (CAC) provides an objective measure of coronary artery disease and can readily be identified on non-gated computed ...

Continuous Blood Sampling in Small Animal Positron Emission Tomography/Computed Tomography Enables the Measurement of the Arterial Input Function

For quantitative analysis and bio-kinetic modeling of positron emission tomography/computed tomography (PET/CT) data, the determination of the temporal blood time-activity concentration also known as arterial input function (AIF) is a key point, especially for the characterization of animal disease models and the introduction of newly developed radiotracers. The knowledge of radiotracer availability in the blood helps to interpret PET/CT-derived data of tissue activity. For this purpose, online blood sampling during the PET/CT imaging is advisable to measure the AIF. In contrast to manual blood sampling and image-derived approaches, continuous online blood sampling has several advantages. Besides the minimized blood loss, there is an improved resolution and a superior accuracy for the blood activity measurement. However, the major drawback of online blood sampling is the costly and time-consuming preparation to catheterize the femoral vessels of the animal. Here, we describe an easy and complete workflow for catheterization and continuous blood sampling during small animal PET/CT imaging and compared it to manual blood sampling and an image-derived approach. Using this highly-standardized workflow, the determination of the fluorodeoxyglucose ([18F]FDG) AIF is demonstrated. Further, this procedure can be applied to any radiotracer in combination with different animal models to create fundamental knowledge of tracer kinetic and model characteristics. This allows a more precise evaluation of the behavior of pharmaceuticals, both for diagnostic and therapeutic approaches in the preclinical research of oncological, neurodegenerative and myocardial diseases.

Here a protocol for continuous blood sampling during PET/CT imaging of rats to measure the arterial input function (AIF) is described. The catheterization, the calibration and setup of the system and the data analysis of the blood radioactivity are demonstrated. The generated data provide input parameters for subsequent bio-kinetic modeling.

Kontinuierliche Blutentnahme in der Kleintier-Positronen-Emissionstomographie/Computertomographie ermöglicht die Messung der arteriellen Eingabefunktion

For quantitative analysis and bio-kinetic modeling of positron emission tomography/computed tomography (PET/CT) data, the determination of the temporal ...

Tissue Preparation Techniques for Contrast-Enhanced Micro Computed Tomography Imaging of Large Mammalian Cardiac Models with Chronic Disease

Structural remodeling is a common consequence of chronic pathological stresses imposed on the heart. Understanding the architectural and compositional properties of diseased tissue is critical to determine their interactions with arrhythmic behavior. Microscale tissue remodeling, below the clinical resolution, is emerging as an important source of lethal arrhythmia, with high prevalence in young adults. Challenges remain in obtaining high imaging contrast at sufficient microscale resolution for preclinical models, such as large mammalian whole hearts. Moreover, tissue composition-selective contrast enhancement for three-dimensional high-resolution imaging is still lacking. Non-destructive imaging using micro-computed tomography shows promise for high-resolution imaging. The objective was to alleviate sufferance from X-ray over attenuation in large biological samples. Hearts were extracted from healthy pigs (N = 2), and sheep (N = 2) with either induced chronic myocardial infarction and fibrotic scar formation or induced chronic atrial fibrillation. Excised hearts were perfused with: a saline solution supplemented with a calcium ion quenching agent and a vasodilator, ethanol in serial dehydration, and hexamethyldisilizane under vacuum. The latter reinforced the heart structure during air-drying for 1 week. Collagen-dominant tissue was selectively bound by an X-ray contrast-enhancing agent, phosphomolybdic acid. Tissue conformation was stable in air, permitting long-duration microcomputed tomography acquisitions to obtain high-resolution (isotropic 20.7 &#181;m) images. Optimal contrast agent loading by diffusion showed selective contrast enhancement of the epithelial layer and sub-endocardial Purkinje fibers in healthy pig ventricles. Atrial fibrillation (AF) hearts showed enhanced contrast accumulation in the posterior walls and appendages of the atria, attributed to greater collagen content. Myocardial infarction hearts showed increased contrast selectively in regions of cardiac fibrosis, which enabled the identification of interweaving surviving myocardial muscle fibers. Contrast-enhanced air-dried tissue preparations enabled microscale imaging of the intact large mammalian heart and selective contrast enhancement of underlying disease constituents.

Here, we present a protocol to obtain high resolution micro computed tomography images of healthy and pathological large mammalian whole hearts with collagen-selective contrast enhancement.

Gewebepräparationstechniken für die kontrastverstärkte Mikro-Computertomographie-Bildgebung von Herzmodellen großer Säugetiere mit chronischen Erkrankungen

Structural remodeling is a common consequence of chronic pathological stresses imposed on the heart. Understanding the architectural and compositional ...

DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis

The liver is the biggest internal organ in humans and mice, and high auto-fluorescence presents a significant challenge for assessing the three-dimensional (3D) architecture of the organ at the whole-organ level. Liver architecture is characterized by multiple branching lumenized structures, which can be filled with resin, including vascular and biliary trees, establishing a highly stereotyped pattern in the otherwise hepatocyte-rich parenchyma. This protocol describes the pipeline for performing double resin casting micro-computed tomography, or &#34;DUCT&#34;. DUCT entails injecting the portal vein and common bile duct with two different radiopaque synthetic resins, followed by tissue fixation. Quality control by clearing one lobe, or the entire liver, with an optical clearing agent, allows for pre-screening of suitably injected samples. In the second part of the DUCT pipeline, a lobe or the whole liver can be used for micro-computed tomography (microCT) scanning, (semi-)automated segmentation, and 3D rendering of the portal venous and biliary networks. MicroCT results in 3D coordinate data for the two resins allowing for qualitative as well as quantitative analysis of the two systems and their spatial relationship. DUCT can be applied to postnatal and adult mouse liver and can be further extended to other tubular networks, for example, vascular networks and airways in the lungs.

Double resin casting micro-computed tomography, or DUCT, enables visualization, digitalization, and segmentation of two tubular systems simultaneously to facilitate 3D analysis of organ architecture. DUCT combines ex vivo injection of two radiopaque resins followed by micro-computed tomography scanning and segmentation of the tomographic data.

DUCT: Doppelharzguss mit anschließender Mikro-Computertomographie zur 3D-Leberanalyse

The liver is the biggest internal organ in humans and mice, and high auto-fluorescence presents a significant challenge for assessing the ...

Sample Preparation for Computed Tomography-based Three-dimensional Visualization of Murine Hind-limb Vessels

Blood vessels are complex networks with tree-like structures, and vascular networks are essential for maintaining both circulation and maintaining organ function. Clarifying the mechanism of blood vessel formation is therefore extremely useful for elucidating developmental processes and pathological mechanisms. Murine hind-limb vessels are often used as a model for physiological and pathological angiogenesis. Evaluation is mainly performed via a two-dimensional method using tissue sections. However, methods for evaluating three-dimensional (3D) vascular morphology are particularly limited. This paper introduces a method for visualizing murine hind-limbs using computed tomography (CT). Radiation-opaque resin is injected through the descending aorta, and whole vessels are filled with dye. By adjusting the time of dye injection, arterial-specific filling is also possible, and samples can be obtained with any micro-X-ray CT device. This contrast method provides a basic technique for the 3D evaluation of murine blood vessels in the lower extremities. Furthermore, this method can be used to visualize all blood vessels below the diaphragm and evaluate blood vessels in the abdominal organs.

Here, we describe a visualization and quantification method for murine hind-limb vessels using micro-X-ray computed tomography.

Probenvorbereitung für computertomographisch basierte dreidimensionale Visualisierung von Murinen Hintergliedmaßengefäßen

Blood vessels are complex networks with tree-like structures, and vascular networks are essential for maintaining both circulation and maintaining organ ...