Alle Arbeiten wurden an der Duke Center for In Vivo Microscopy, ein NIH / NIBIB durchgeführt nationalen Biomedizinische Technologie Resource Center (P41 EB015897) und NCI Small Animal Imaging Resource Program (U24 CA092656). Zusätzliche Unterstützung wurde von der NSF Graduate Research Fellowship (2003014921) zur Verfügung gestellt.

1. Montieren und Kalibrieren Ultraschallsystem <ol><li> Das Ultraschallsystem beginnt mit einem Element Ultraschallwandler mit einem Durchmesser breit genug, um die Maus Gehirn und eine Mittenfrequenz im Bereich von 2 MHz abdecken. Der Wandler wird durch eine 50-dB-Leistungsverstärker, der mit einem Signalgenerator, der die Ultraschall-Impulsfolge erzeugt verbunden angetrieben wird. </li><li> Um den akustischen Druck des Ultraschall-System zu kalibrieren, mit einem Hydrophon, die angelegte Spannung zu der resultierenden akustischen Druck beziehen. Setzen Sie den Schallkopf in einem Wassertank über dem Hydrophon. Anwenden einer einfachen Puls (z. B. ein 10-Zyklus Sinuskurve an dem Wandler die Häufigkeit, mit Impulsfolgefrequenz von 10 Hz) an den Wandler. Verwenden Sie ein 3-Achsen-Übersetzung Bühne, um die Peak-Ansprechen, die im Zentrum des Ultraschallstrahls an dem Wandler die natürliche Konzentration (etwa 60 mm für unsere 13 mm Durchmesser 2,15 MHz-Sonde) sein sollte, zu finden. </li><li> Machen Sie mehrere Messungen über einen klingeltee von Eingangsspannungen (zB 50-400 mV pp), um die Linearität des Systems zu überprüfen. Verwenden Sie eine einfache lineare Regression, die Beziehung zwischen Eingangsspannung und Schalldruck zu schätzen. In unserem System entsprach Eingangsspannungen von 258 und 167 mV pp-Spitze-negativen Schalldruck von 0,52 und 0,36 MPa. </li><li> Programm die Signalerzeuger, um ein Ultraschallimpuls Sequenz, bestehend aus Bursts von sinusförmigen Impulse am Ultraschall-Frequenz mit 50000 Zyklen pro Burst und einer Burst-Periode von 64 ms zu erzeugen. Basierend auf den Kalibriermessungen, stellen Sie die Pulsamplitude zu Peak-negativen akustischen Druck von 0,36 MPa in der Mitte des Wandlers den natürlichen Schwerpunkt zu generieren. </li></ol> 2. Bereiten Sie die Reagenzien <ol><li> Man löst Manganchloridtetrahydrat (MnCl 2 · 4H 2 O) in sterilem Wasser bei einer Konzentration von 100 mM (300 mosm) und Filter zu sterilisieren. </li><li> Produzieren Sie das Perflutren Lipid-Mikrosphären von &quot;activating &quot;die Ampulle in der vom Hersteller gelieferten Rührer für 45 s. Für einen Tag von Experimenten kann ein einzelnes Gefäß einmal am Beginn des Tages aktiviert und verwendet werden, ohne dass die Aktivierung für den Rest des Tages. </li><li> Unmittelbar vor der Mikrosphären-Verwaltung, beunruhigen Sie das Fläschchen mit der Hand für 1 Minute, um die Mikrosphären zu resuspendieren. Beim Herausziehen Mikrobläschen aus dem Fläschchen, injizieren Sie kein Zimmer Luft in die Flasche, da dies verschlechtert die restlichen Mikrobläschen. Lassen Sie das Fläschchen bis zum letzten Einsatz des Tages, und dann speichern Sie es im Kühlschrank aufbewahrt. Verwaltet auf diese Weise kann eine einzige Ampulle mehrere Tage dauern. Re-Aktivierung der gespeicherten Küvette in den Rührer, vor der ersten Verwendung an den folgenden Tagen. </li></ol> 3. Tierische Vorbereitung <ol><li> Betäuben die Tiere mit Isofluran, geliefert von Bugspitze. Der Nasenkegel Vorrichtung sollte so gestaltet werden, um den Kopf des Tieres genau und zuverlässig zu befestigen an der gleichen Position jedes Mal werden. Unsere Einrichtung 15 hält den Kopf in the &quot;Schädel-Flat&quot;-Position (dh die dorsalen Schädel Oberfläche ist horizontal) in der Paxinos Hirnatlas 16 verwendet. Daraufhin wird die Betäubung, eine Atemfrequenz von 85 bis 125 Atemzüge pro Minute aufrecht zu erhalten. Pflegen Sie die Körpertemperatur mit Hilfe eines Wärmelampe oder Blasluft. Schützen Sie die Augen mit Gleitmittel. </li><li> Entfernen Sie die Haare aus der Kopfhaut Maus mit Hilfe eines elektrischen Trimmer. </li><li> Legen Sie eine Schwanzvene Katheter und eine intraperitoneale (IP-) Katheter. Für das Überleben Studien, achten Sie darauf, geeignete sterile Technik zu verwenden; IP Katheterplatzierung in dem Video zu diesem Artikel gezeigt angemessen ist nur für Nicht-Überleben Experimente. </li><li> Nehmen Sie ggf. weitere Vorbereitungen für die neuronale Stimulation Experiment erforderlich. Für das Mapping von Vibrissen Stimulation des Laufes Feld Kortex, verwenden Sie ein Binokular und mikrochirurgischen Schere, um die Tasthaare so nah wie möglich an die Hautoberfläche ohne zu reizen oder die Follikel umgebenden Haut zu schneiden. </li><li> Ort Ultraschall-Gel auf dieKopfhaut, und senken Sie dann eine Wassersäule von einer dünnen Plastikfolie (z. B. eine 7,6 um Müll Müllsack) auf den Kopf enthielt. Erreichen Sie durch mit Wasser Spalte mit einem Wattestäbchen Wattestäbchen, Push-out alle Luftblasen, die in der Ultraschall-Gel verfangen. Positionieren Sie den Schallkopf in seiner natürlichen Brennweite (58 mm) direkt über das Gehirn der Maus in der Spalte von Wasser, und wischen Sie den Sensor mit der Fingerspitze, um eingeschlossene Luftblasen zu entfernen. </li></ol> 4. Blut-Hirnschranke Opening mit den Mikrobläschen und Ultra Sound (BOMUS) <ol><li> Wähle eine intraperitoneale Injektion von Mangan Lösung bei einer Dosis von 0,5 mmol / kg IP. Verschließen Sie die intraperitonealen Katheter so das Mangan nicht fließt, aus, und warten Sie 10 Minuten, damit es zu verteilen (Abbildung 1). </li><li> Um die BBB zu öffnen, zu verwalten 30 ul Perflutren Lipid-Mikrosphären (aktiviert DEFINITY) über die Schwanzvene Katheter, und gleichzeitig, starten Sie die Ultraschall-Impulsfolge. Continue Beschallung für 3 Minuten. </li></ol> 5. Neuronale Stimulation <ol><li> Lassen Sie ca. 40 Minuten für Gehirn-Niveaus von Mn 2 +, der vor Beginn neuronale Stimulation zu stabilisieren. Auf diese Weise die dramatische Verbesserung Ausgangswert durch Mn 2 +-Diffusionsbereich durch die BHS aus dem feinen Differenz Verbesserung durch Stimulation unterschieden werden. Dann beginnt die Stimulation mit Ihrem Paradigma der Wahl (Abbildung 1). </li><li> Für Vibrissen Stimulation, schalten Sie das Isofluran und entfernen Sie die Bugspitze. Bewegen eines weichen Pinsel Künstlers manuell in einer kreisförmigen Bewegung (1-5 Hz) durch die Vibrissen Array in einem Abstand von etwa 2-5 mm von der Haut. Fahren Sie mit der Stimulation für 90 min. Das Mangan hat eine beruhigende Wirkung, die hemmungslose Stimulation des Tieres ermöglicht. Wenn das Tier wird unruhig, verwalten 5% Isofluran via Nasenkonus für ca. 15 Sekunden. </li></ol> 6. Magnetic Resonance Imaging <ol><li> Nach der Stimulation wieder aufnehmen Anästhesie über Bugspitze. Weiter Aufrechterhaltung der Körpertemperatur und der Titration der Isofluran-Ebene zu einer Atemfrequenz von 85 bis 125 Atemzüge pro Minute. </li><li> Platzieren Sie die Maus in einer MR-Bildgebung Spule und Transfer in das MRT-System. Erwerben Sie hochauflösende 3D-T 1-gewichteten MR-Bildern. Verwenden Sie z. B. eine 3D-Gradientenechobildern erinnerte Echo (SPGR) Sequenz mit folgenden Parametern: Wiederholung von 25 ms, Echozeit von 2 ms, Flip-Winkel von 30 Grad; Bandbreite von 15,63 kHz; Gesichtsfeld von 20 × 20 × 12 mm, Matrix von 128 × 128 × 60. </li></ol> 7. Bildanalyse <ol><li> Die Bildanalyse ist spezifisch für die Stimulationsparadigma verwendet. Für die Stimulation Vibrissen Experiment (Abbildung 2), importieren Sie die Bilder von mehreren Tieren in einen geeigneten Analyse-Umgebung. Wenn einige Tiere wurden auf der rechten Seite stimuliert, während andere auf der linken Seite, FL stimuliert wurdenIP manche so, dass alle Bilder wirksam sind &quot;left-stimulierte.&quot; Dann, um die stimulierten Seite jedes Gehirn seine kontralateralen unstimulierten miteinander zu vergleichen, eine dupliziert und gespiegelt links unstimulierten Bildsatzsignal erzeugt wird. Registrieren Sie sich alle Bilder zu einem gemeinsamen Raum und dann glätten sie mit einem 3 × 3 × 3 Pixel Gauß-Kern. </li><li> Exportieren Sie die Daten einer mathematischen Analyse-Umgebung, wie MATLAB. Optional maskieren irrelevant Anatomie in den Datensätzen. Intensity-normalisieren die Bilder durch die iterative Methode von Venot et al. 17,18. </li><li> Verwenden Sie ein gekoppeltes, Einzel-tailed t-Test für jedes Voxel des stimulierten Seiten jedes Gehirn auf die entsprechende kontralaterale Voxel vergleichen auf den unstimulierten Seiten jedes Gehirn. </li><li> Anzeigen des resultierenden p-Wert anzeigen, um Bereiche unterschiedlicher Aktivität (3) zu identifizieren. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse Die hier vorgestellte Methode hat zwei Fonds<html> amental Schritten: (1) BBB Eröffnung mit Mikrobläschen und Ultraschall (BOMUS) und (2) activation-induced Mangan-MRT (AIM MRI). Da der letztere Schritt hängt von der ehemaligen, ist es wichtig für eine erfolgreiche Umsetzung BOMUS überprüfen. Störung der Blut-Hirn-Schranke nach der Verabreichung einer T 1-verkürzenden Kontrastmittels (wie Mangan oder eine Gadolinium-basierte Agent) führt zu einer Erhöhung des Signal Hirnparenchym auf T 1-gewichteter Bildgebung, wann Gehirne verglichen, in denen BOMUS wurde nicht durchgeführt (Abbildung 4). Die Verteilung dieser Mangan-Erhöhung ist nicht völlig einheitlich, obwohl es ziemlich konsistent zwischen den Tieren ist. Die Verteilung gibt nicht nur Inhomogenität in BBB Öffnung, sondern auch die intrinsische ungleichmäßige Verteilung von Mn im Gehirn 19. Die räumliche und zeitliche Dynamik der BBB Eröffnung wurden weiter oben beschrieben 12. ENT &quot;&gt; Nachdem BOMUS erfolgreich umgesetzt wurde, ist der nächste Schritt zur Durchführung AIM MRI Viele experimentelle Paradigmen sind möglich;.. aber da gibt es viele potenzielle verwechselt, die Kontrollen und Analysen müssen sorgfältig entworfen werden Confounding Effekte beinhalten inhomogene BBB Eröffnung, inhomogenen Ansammlung von Mn im Gehirn, zeitliche Dynamik der Mn Diffusion und unspezifische neuronale Aktivität. In diesem Beispiel wurde die neuronale Antwort auf einseitige Stimulation der Vibrissen zugeordnet. Um den Inhomogenitäten und Mn Fluß, der nicht stimulierten Seite jedes Gehirn ausmachen wurde als interne Kontrolle verwendet. Um unspezifische neuronale Aktivität, die zwischen Tieren variieren könnte erklären, verwendet die Analyse statistischen Tests in Regionen, die immer wieder andere unter den Tieren (2) verantwortlich waren. Die Ergebnisse waren eine dreidimensionale Karte und ein Unterschied dreidimensionalen p-Wert Karte (Abbildung 3), die rechte Seite, von denen Regionen angegebenvon höheren Signal kontralateral zur stimulierten Tasthaare. Die linke Seite der Karte angezeigt, welche Regionen signifikant höheren Signal ipsilateral zur stimulierten Vibrissen hatte. Der p-Wert Karte identifiziert einen breiten Bereich erhöhter Signal kontralateral zur stimulierten Tasthaare, die mit dem Lauf-Feld der primären sensorischen Kortex, dessen Reaktion auf Vibrissen Stimulation wurde ausgiebig von 20,21 Elektrophysiologie und 2-Desoxyglucose Studien dokumentiert entsprach. Eine ausführlichere Diskussion dieser Ergebnisse wurde bereits 13 veröffentlicht. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4055/4055fig1.jpg" /> Abbildung 1. Protokoll Zeitplan für die funktionelle Bildgebung mit MRI BOMUS und AIM (Übernommen aus Howles et al. 13). <img alt="2" src="/files/ftp_upload/4055/4055fig2.jpg" /> Abbildung 2. Analysis Schema zur Identifizierung Regionen of unterschiedlicher Intensität zwischen den stimulierten und unstimulierten Seiten jedes Gehirn. Um den stimulierten Seite jedes Gehirn seine unstimulierten kontralateralen Seite zu vergleichen, dupliziert und gespiegelt ein links-unstimulierten Bildmenge wird erstellt. Diese Bilder werden registriert, filtriert, und normalisiert. Schließlich, am Test vergleicht die links-stimulierten und unstimulierten links-Bilder. Der t-Test wird &quot;gekoppelt&quot;, so dass die angeregte Seite jedes Gehirn nur der nicht stimulierten Seite desselben Gehirns. Der t-Test &quot;Single-tailed&quot;, so dass eine Seite der p-Wert anzeigen signifikant höheren Signal auf der stimulierten Seite des Gehirns anzeigt, während die andere Seite der p-Wert Karte zeigt einen signifikant höheren Signal auf Seite der unstimulierten Gehirn (Übernommen aus Howles et al. 13). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4055/4055fig3.jpg" /> 3. Ergebnisse der gepoolten Analyse von 7 Tieren an zwei verschiedenen axialen Positionen. T<html> er erste Spalte zeigt den Mittelwert aller registrierten Bilder ausgerichtet, so dass effektiv alle Mäuse hatten ihre linke Vibrissen stimuliert. Diese Bilder mit einer Farbe Karte, welche die durchschnittliche prozentuale Zunahme des Signals in jedem Voxel relativ zu der kontralateralen Hemisphäre überlagert, wie dies durch die Farbbalken. Farbige Bereiche auf der rechten Seite des Bildes zeigen, wo die Hemisphäre kontralateral zur Stimulation hatten höhere Signal. Farbige Regionen auf der linken Seite des Bildes zeigen, wo die Halbkugel ipsilateral zur Stimulation hatten höhere Signal. Die zweite Spalte zeigt die gleichen Bilder mit der p-Wert Karte, welche die statistische Signifikanz der Zunahme des Signals überlagert. Die dritte Spalte zeigt den gleichen p-Wert Karte auf den entsprechenden Zahlen aus dem Paxinos stereotaxische Atlas 16 mit den Fass Felder des sensorischen Kortex schattiert (Übernommen aus Howles et al. 13) überlagert. / 4055/4055fig4.jpg &quot;/&gt; 4. Räumliche Verteilung von Mn 2 + im Gehirn. Bilder wurden 170 min nach 0,5 mmol / kg IP MnCl 2 erworben von BOMUS-behandelten (n = 5) und Kontrolle (n = 4)-Mäusen. Nach der Normalisierung, Mittelwert und Standardabweichung berechnet Karten wurden (linkes Bild). Enhancement war in den BOMUS-behandelten Mäusen. Obwohl diese Verstärkung nicht über das Gehirn einheitliche, war es ziemlich konstant, außer in der Nähe der Ränder des Gehirns und Ventrikel. Mit Regions of Interest (ROI) um verschiedene Strukturen gezeichnet, wurde die mittlere SNR (+ 1 SD) in jeder Gruppe (rechtes Bild) berechnet. BOMUS-behandelten Tiere zeigten eine größere SNR, sondern auch größere Varianz zwischen Strukturen und zwischen Tieren (Übernommen aus Howles et al. 13). <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/4055/4055fig5.jpg" /> Abbildung 5. Um Gewebe Wirkungen von BOMUS zu untersuchen, wurden Gehirne von BOMUS-behandelten Mäusen fest, SEctioned bei 500 - um Intervalle, und gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin. Die mittlere Anzahl der roten Blutkörperchen Extravasate in jedem Abschnitt des Gehirns zu sehen ist für akustische Druck von 0,36 MPa (n = 3), 0,52 MPa (n = 4) und 5,0 MPa (n = 1). Fehlerbalken zeigen Standardfehler. Die zweite Platte zeigt ein Beispiel einer schweren roten Blutkörperchen Extravasation aus dem Gehirn ausgesetzt 5,0 MPa (Aus Howles et al. 12). <img alt="6" src="/files/ftp_upload/4055/4055fig6.jpg" /> Abbildung 6. Quantitative Verhaltenstests wurde verwendet, um Aktivität, Erregung, und Reaktionsfähigkeit vor der Narkose zu bewerten und 3 und 24 Stunden nach dem Erwachen aus der Narkose. Das Scoring-System, vorher beschriebenen 12, wurde auf der etablierten quantitativen Beurteilung Maus Verhaltensstörungen entwickeln, basierted von Irwin im Jahr 1968 22. Die durchschnittliche Verhalten (± SEM) des Gastes für die Kontrolle (n = 3) und BOMUS (0,36 MPa) behandelt wurden (n = 8) Tieren gezeigt. Bezogen auf die Pre-Narkose Grundlinie, zeigen alle Tiere eine Abnahme des Verhaltens der Gäste 3 Stunden nach der Narkose, aber sie weitgehend durch den nächsten Tag zu erholen. Zu jedem Zeitpunkt wurde kein Unterschied zwischen den beiden Gruppen zu sehen, was darauf hinweist, dass BOMUS nicht messbar beeinflussen das Verhalten von Tieren (Übernommen aus Howles et al. 12).

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S., Zheng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese:+Recent+advances+in+understanding+its+transport+and+neurotoxicity.">Manganese: Recent advances in understanding its transport and neurotoxicity.</a> Toxicol. Appl. Pharm. 221, 131-147 (2007).</li><li>Watanabe, T., Frahm, J., Michaelis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese-enhanced+MRI+of+the+mouse+auditory+pathway.">Manganese-enhanced MRI of the mouse auditory pathway.</a> Magnet. Reson. Med. 60, 210-212 (2008).</li><li>Yu, X., Wadghiri, Y. Z., Sanes, D. H., Turnbull, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+auditory+brain+mapping+in+mice+with+Mn-enhanced+MRI.">In vivo auditory brain mapping in mice with Mn-enhanced MRI.</a> Nat. Neurosci. 8, 961-968 (2005).</li><li>Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+mapping+of+sound-evoked+activity+in+the+mouse+auditory+midbrain+using+Mn-enhanced+MRI.">Statistical mapping of sound-evoked activity in the mouse auditory midbrain using Mn-enhanced MRI.</a> Neuroimage. 39, 223-230 (2008).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Hier wurde ein Verfahren zur nicht-invasiven Öffnen der BBB im gesamten Gehirn der Maus mit Ultraschall und Mikrobläschen (BOMUS) dargestellt. Mit dem BBB offen, Mn 2 + verabreicht wurde und activation-induced Mangan-MRT (AIM MRT) wurde auf Bild neuronale Reaktion auf kurzzeitige Stimulation in leicht sedierten Mäusen verwendet. Angemessene BBB Öffnung wurde mit einem Spitzenwert-negativen akustischen Druck von 0,36 MPa erreicht. Hinweis: Dies ist der Druck an der Kopfhaut Obe...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Hydrophon </td><td> Sonora Medical Systems, Longmont, CA </td><td> SN-251 S4 </td><td></td></tr><tr><td> Übersetzung Bühne </td><td> Newport Corporation, Irvine, CA </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ultraschallwandler </td><td> Olympus NDT, Inc., Waltham, MA </td><td> A306S-SU </td><td> Bewerten des Herstellers Testblatt, dass der Wandler begleitet, um die genaue Mittenfrequenz des jeweiligen Wandler, der von der Nennfrequenz im Katalog angegebenen abweichen können zu finden. (Z. B. betrug die nominale Frequenz von 2,25 MHz unsere Wandler, aber die tatsächliche Mittenfrequenz betrug 2,15 MHz.) </td></tr><tr><td> Vevo Imaging-Station </td><td> VisualSonics, Inc. Toronto, Kanada </td><td>; </td><td></td></tr><tr><td> 50 dB Verstärker </td><td> E &amp; I, Rochester, NY </td><td> Modell 240L </td><td></td></tr><tr><td> Der Signalgenerator </td><td> Agilent Technologies, Santa Clara, CA </td><td> Modell 33220A </td><td></td></tr><tr><td> MnCl 2 - (H2O) 4 </td><td> Sigma </td><td></td><td> Molekulargewicht variiert je nach Charge, Call Hersteller für die exakte Messung </td></tr><tr><td> Perflutren Lipid-Mikrosphären </td><td> Lantheus Medical Imaging, N. Billerica, MA </td><td> DEFINITY </td><td></td></tr><tr><td> Microsphere Rührwerk </td><td> Lantheus Medical Imaging, N. Billerica, MA </td><td> Vialmix </td><td></td></tr><tr><td> MR-Bildgebung Spule </td><td> M2M-Imaging Corp, Hillcrest, OH </td><td></td><td> 35 mm Durchmesser Quadratur Sende / Empfangs-Spule Volumen </td></tr><tr><td> MRT-System </td><td> GE Healthcare, Milwaukee, WI </td><td></td><td> GE EXCITE Konsole Betrieb eines 7-T horizontale Bohrung Magnet </td></tr><tr><td> Die Bildanalyse-Umgebung </td><td> Visage Imaging, San Diego, CA, The MathWorks, Natick MA </td><td> Amira MATLAB </td><td></td></tr></tbody></table>

functional neuroimaging using ultrasonic blood-brain barrier disruption and manganese-enhanced mri

Obwohl Mäuse sind das dominierende Modellsystem für die Erforschung der genetischen und molekularen Grundlagen der Neurowissenschaften, funktionelle Bildgebung bei Mäusen bleibt technisch anspruchsvoll. Ein Ansatz, activation-induced Mangan-MRT (AIM MRI), wurde erfolgreich auf die neuronale Aktivität bei Nagern 1-5 zuordnen können. In AIM MRT, Mn 2 + wirkt ein Calcium analoge und reichert sich in Neuronen depolarisiert 6,7. Da Mn 2 + verkürzt die T 1 Gewebe Eigentum, werden Bereiche erhöhter neuronaler Aktivität in der MRT zu verbessern. Ferner, Mn 2 + löscht langsam von den aktivierten Bereichen, daher Stimulation kann außerhalb des Magneten durchgeführt vor der Bebilderung werden, was eine höhere Flexibilität experimentellen. Da jedoch die Mn 2 + nicht leicht die Blut-Hirn-Schranke (BHS), die Notwendigkeit, öffnen Sie die BBB hat die Verwendung von AIM MRT begrenzt, vor allem bei Mäusen. Ein Werkzeug zum Öffnen des BBB ist ultrasound. Obwohl möglicherweise Schaden entstehen, wenn Ultraschall in Kombination mit gasgefüllten Mikroblasen (dh Ultraschall-Kontrastmitteln) verabreicht wird, ist der Schalldruck für BBB Öffnung erforderlich deutlich niedriger. Diese Kombination von Ultraschall und Mikrobläschen können verwendet werden, um zuverlässig öffnen Sie die BBB, ohne dass Gewebeschäden 8-11 werden. Hier wird ein Verfahren zum Durchführen AIM MRT durch Einsatz von Mikrobläschen und Ultraschall, um die BBB zu öffnen dargestellt. Nach einer intravenösen Injektion von Perflutren Mikrobläschen ist eine unscharf gepulsten Ultraschalls an den Kopf rasiert Maus für 3 Minuten angewendet werden. Der Einfachheit halber verweisen wir auf diese Technik von BBB Opening mit den Mikrobläschen und Ultraschall als BOMUS 12. Mit BOMUS die BBB über beiden Hemisphären zu öffnen, wird Mangan auf das gesamte Gehirn der Maus verabreicht. Nach experimenteller Stimulation der leicht sedierten Mäusen ist AIM MRI verwendet, um die neuronalen Reaktionen zuordnen. Zudiesen Ansatz zu demonstrieren, sind hierin BOMUS und AIM MRI verwendet werden, um einseitige mechanische Stimulation der Tasthaare in leicht sediert Mäuse 13 Karte. Weil BOMUS können die BBB über beiden Hemisphären zu öffnen, wird der unstimulierten Seite des Gehirns verwendet, um für eine unspezifische Stimulation Hintergrund steuern. Das resultierende 3D-Aktivierung Karte stimmt gut mit den veröffentlichten Darstellungen der Vibrissen Regionen des Feldes Barrel Cortex 14. Das Ultraschall-Öffnung der BHS ist schnell, nicht-invasive und reversible, und so ist dieser Ansatz geeignet für High-Throughput-und / oder Längsschnittstudien in wach-Mäusen.

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Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Eine Technik ist für die breite Öffnung der Blut-Hirn-Schranke in der Maus mit Mikrobläschen und Ultraschall beschrieben. Mit dieser Technik können Mangan, um Gehirn der Maus verabreicht werden. Da Mangan ist ein MRT-Kontrastmittel, die in Neuronen depolarisiert ansammelt, erlaubt dieser Ansatz eine Bildgebung neuronaler Aktivität.

Funktionelle Bildgebung mit Ultraschall-Blut-Hirnschranke Störung und Mangan-MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

functional-neuroimaging-using-ultrasonic-blood-brain-barrier

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.9K Aufrufe.  Stanford University. Eine Technik ist für die breite Öffnung der Blut-Hirn-Schranke in der Maus mit Mikrobläschen und Ultraschall beschrieben. Mit dieser Technik können Mangan, um Gehirn der Maus verabreicht werden. Da Mangan ist ein MRT-Kontrastmittel, die in Neuronen depolarisiert ansammelt, erlaubt dieser Ansatz eine Bildgebung neuronaler Aktivität.

Serie: Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Measuring the Subjective Value of Risky and Ambiguous Options using Experimental Economics and Functional MRI Methods

Most of the choices we make have uncertain consequences. In some cases the probabilities for different possible outcomes are precisely known, a condition termed "risky". In other cases when probabilities cannot be estimated, this is a condition described as "ambiguous". While most people are averse to both risk and ambiguity1,2, the degree of those aversions vary substantially across individuals, such that the subjective value of the same risky or ambiguous option can be very different for different individuals. We combine functional MRI (fMRI) with an experimental economics-based method3 to assess the neural representation of the subjective values of risky and ambiguous options4. This technique can be now used to study these neural representations in different populations, such as different age groups and different patient populations.
In our experiment, subjects make consequential choices between two alternatives while their neural activation is tracked using fMRI. On each trial subjects choose between lotteries that vary in their monetary amount and in either the probability of winning that amount or the ambiguity level associated with winning. Our parametric design allows us to use each individual's choice behavior to estimate their attitudes towards risk and ambiguity, and thus to estimate the subjective values that each option held for them. Another important feature of the design is that the outcome of the chosen lottery is not revealed during the experiment, so that no learning can take place, and thus the ambiguous options remain ambiguous and risk attitudes are stable. Instead, at the end of the scanning session one or few trials are randomly selected and played for real money. Since subjects do not know beforehand which trials will be selected, they must treat each and every trial as if it and it alone was the one trial on which they will be paid. This design ensures that we can estimate the true subjective value of each option to each subject. We then look for areas in the brain whose activation is correlated with the subjective value of risky options and for areas whose activation is correlated with the subjective value of ambiguous options.

Using functional MRI and behavioral methods to determine the neural representation of the subjective value of risky and ambiguous options in the human brain.

Messung des subjektiven Wert des Risky und mehrdeutig Optionen mit Experimental Economics and Functional MRI Methoden

Most of the choices we make have uncertain consequences. In some cases the probabilities for different possible outcomes are precisely known, a condition ...

Forschung

Neurowissenschaften

Optogenetic Functional MRI

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI), which is a novel technique that combines the relatively high spatial resolution of high-field fMRI with the precision of optogenetic stimulation. Fiber optics that enable delivery of specific wavelengths of light deep into the brain in vivo are implanted into regions of interest in order to specifically stimulate targeted cell types that have been genetically induced to express light-sensitive trans-membrane conductance channels, called opsins. fMRI is used to provide a non-invasive method of determining the brain's global dynamic response to optogenetic stimulation of specific neural circuits through measurement of the blood-oxygen-level-dependent (BOLD) signal, which provides an indirect measurement of neuronal activity. This protocol describes the construction of fiber optic implants, the implantation surgeries, the imaging with photostimulation and the data analysis required to successfully perform ofMRI. In summary, the precise stimulation and whole-brain monitoring ability of ofMRI are crucial factors in making ofMRI a powerful tool for the study of the connectomics of the brain in both healthy and diseased states.

This protocol describes the steps and data analysis required to successfully perform optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI). ofMRI is a novel technique that combines high-field fMRI readout with optogenetic stimulation, allowing for cell type-specific mapping of functional neural circuits and their dynamics across the whole living brain.

Optogenetische Functional MRI

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. Transcytosis across the BBB regulates the delivery of hormones, metabolites, and therapeutic antibodies to the brain parenchyma. Here, we present a protocol that combines immunofluorescence of free-floating sections with laser scanning confocal microscopy and image analysis to visualize subcellular organelles within endothelial cells at the BBB. Combining this data-set with 3D image analysis software allows for the semi-automated segmentation and quantification of capillary volume and surface area, as well as the number and intensity of intracellular organelles at the BBB. The detection of mouse endogenous immunoglobulin (IgG) within intracellular vesicles and their quantification at the BBB is used to illustrate the method. This protocol can potentially be applied to the investigation of the mechanisms controlling BBB transcytosis of different molecules in vivo.

Here we present a microscopy-based protocol for high-resolution imaging and a three-dimensional reconstruction of the mouse neurovascular unit and blood-brain barrier using brain free-floating sections. This method allows for the visualization, analysis, and quantification of intracellular organelles at the BBB.

Hochauflösende konfokale Bildgebung der Blut - Hirn-Schranke: Bildgebung, 3D-Rekonstruktion und Quantifizierung der Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

Eine In Vivo Blut - Hirn-Schranke Permeabilität Assay bei Mäusen mit Gewebekulturen beschriftet Tracer

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

Eine In-Vivo -Bewertung der Störung der Blut - Hirn-Schranke in einem Rattenmodell des ischämischen Schlaganfalls

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

Neuroimaging Field Methods Using Functional Near Infrared Spectroscopy (NIRS) Neuroimaging to Study Global Child Development: Rural Sub-Saharan Africa

Portable neuroimaging approaches provide new advances to the study of brain function and brain development with previously inaccessible populations and in remote locations. This paper shows the development of field functional Near Infrared Spectroscopy (fNIRS) imaging to the study of child language, reading, and cognitive development in a rural village setting of C&#244;te d&#39;Ivoire. Innovation in methods and the development of culturally appropriate neuroimaging protocols allow&#160;a first-time look into the brain&#39;s development and children&#39;s learning outcomes in understudied environments. This paper demonstrates protocols for transporting and setting up a mobile laboratory, discusses considerations for field versus laboratory neuroimaging, and presents a guide for developing neuroimaging consent procedures and building meaningful long-term collaborations with local government and science partners. Portable neuroimaging methods can be used to study complex child development contexts, including the impact of significant poverty and adversity on brain development. The protocol presented here has been developed for use in C&#244;te d&#39;Ivoire, the world&#39;s primary source of cocoa, and where reports of child labor in the cocoa sector are common. Yet, little is known about the impact of child labor on brain development and learning. Field neuroimaging methods have the potential to yield new insights into such urgent issues, and the development of children globally.

Neuroimaging Field Methods Using Functional Near Infrared Spectroscopy NIRS Neuroimaging to Study Global Child Development: Rural Sub-Saharan Africa

Portable neuroimaging approaches (functional Near Infrared Spectroscopy) provide advances to the study of the brain in previously inaccessible regions; here, rural C&#244;te d&#39;Ivoire. Innovation in methods and development of culturally-appropriate neuroimaging protocols permits novel study of the brain&#39;s development and children&#39;s learning outcomes in environments with significant poverty and adversity.

Neuroimaging Feldmethoden mit funktionalen in der Nähe von Infrarot-Spektroskopie (NIRS) Neuroimaging, globale Kindesentwicklung zu studieren: ländliche Subsahara-Afrika

Portable neuroimaging approaches provide new advances to the study of brain function and brain development with previously inaccessible populations and in ...

A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic delivery including precise localization to a target brain region and reduction of off target side effects. However, stereotaxic surgery is highly invasive which limits its translational efficacy, requires long recovery times, and provides challenges when targeting multiple brain regions. Focused ultrasound (FUS) can be used in combination with circulating microbubbles to transiently open the blood brain barrier (BBB) in millimeter sized regions. This allows intracranial localization of systemically delivered agents that cannot normally cross the BBB. This technique provides a noninvasive alternative to stereotaxic surgery. However, to date this technique has yet to be widely adopted in neuroscience laboratories due to the limited access to equipment and standardized methods. The overall goal of this protocol is to provide a benchtop approach to FUS BBB opening (BBBO) that is affordable and reproducible and can therefore be easily adopted by any laboratory.

Focused ultrasound with microbubble agents can open the blood brain barrier focally and transiently. This technique has been used to deliver a wide range of agents across the blood brain barrier. This article provides a detailed protocol for the localized delivery to the rodent brain with or without MRI guidance.

Ein Benchtop-Ansatz zur standortspezifischen Blut-Hirn-Barriere-Öffnung mit fokussiertem Ultraschall in einem Rattenmodell

Stereotaxic surgery is the gold standard for localized drug and gene delivery to the rodent brain. This technique has many advantages over systemic ...

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a combination of focused ultrasound (FUS) induced blood-brain barrier opening (FUS-BBBO), gene delivery with adeno-associated viral (AAV) vectors, and activation of cellular signaling with engineered, chemogenetic, protein receptors and their cognate ligands. With ATAC, it is possible to transduce both large and small brain regions with millimeter precision using a single noninvasive ultrasound application. This transduction can later allow for a long-term, noninvasive, device-free neuromodulation in freely moving animals using a drug. Since FUS-BBBO, AAVs, and chemogenetics have been used in multiple animals, ATAC should also be scalable for the use in other animal species. This paper expands upon a previously published protocol and outlines how to optimize the gene delivery with FUS-BBBO to small brain regions with MRI-guidance but without a need for a complicated MRI-compatible FUS device. The protocol, also, describes the design of mouse targeting and restraint components that can be 3D-printed by any lab and can be easily modified for different species or custom equipment. To aid reproducibility, the protocol describes in detail how the microbubbles, AAVs, and venipuncture were used in ATAC development. Finally, an example data is shown to guide the preliminary investigations of studies utilizing ATAC.

This protocol delineates steps necessary for the gene delivery through focused ultrasound blood brain barrier (BBB) opening, evaluation of the resulting gene expression, and measurement of neuromodulation activity of chemogenetic receptors through histological tests.

Fokussierte ultraschallinduzierte Öffnung der Blut-Hirn-Schranke zur gezielten Behandlung von Hirnstrukturen und zur Beurteilung der chemogenetischen Neuromodulation

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a ...

Role of Diffusion MRI Tractography in Endoscopic Endonasal Skull Base Surgery

Endoscopic endonasal surgery has gained a prominent role in the management of complex skull base tumors. It allows the resection of a large group of benign and malignant lesions through a natural anatomical extra-cranial pathway, represented by the nasal cavities, avoiding brain retraction and neurovascular manipulation. This is reflected by the patients' prompt clinical recovery and the low risk of permanent neurological sequelae, representing the main caveat of conventional skull base surgery. This surgery must be tailored to each specific case, considering its features and relationship with surrounding neural structures, mostly based on preoperative neuroimaging. Advanced MRI techniques, such as tractography, have been rarely adopted in skull base surgery due to technical issues: lengthy and complicated processes to generate reliable reconstructions for inclusion in the neuronavigation system. 
This paper aims to present the protocol implemented in the institution and highlights the synergistic collaboration and teamwork between neurosurgeons and the neuroimaging team (neurologists, neuroradiologists, neuropsychologists, physicists, and bioengineers) with the final goal of selecting the optimal treatment for each patient, improving the surgical results and pursuing the advancement of personalized medicine in this field.

We present a protocol to integrate diffusion MRI tractography in patient work-up to endoscopic endonasal surgery for a skull base tumor. The methods for adopting these neuroimaging studies in the pre- and intra-operative phases are described.

Rolle der Diffusions-MRT-Traktographie in der endoskopischen endonasalen Schädelbasischirurgie

Endoscopic endonasal surgery has gained a prominent role in the management of complex skull base tumors. It allows the resection of a large group of ...

Messung des transendothelialen Widerstands zur Beurteilung der Integrität der Zellbarriere

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating the interaction between restricted transit of harmful substances, nutrient absorption, and metabolite clearance in the brain, the BBB is essential in preserving central nervous system homeostasis. Building in vitro models of the BBB is a valuable tool for exploring the pathophysiology of neurological disorders and creating pharmacological treatments. This study describes a procedure for creating an in vitro monolayer BBB cell model by seeding bEnd.3 cells into the upper chamber of a 24-well plate. To assess the integrity of cell barrier function, the conventional epithelial cell voltmeter was used to record the transmembrane electrical resistance of normal cells and CoCl2-induced hypoxic cells in real-time. We anticipate that the above experiments will provide effective ideas for the creation of in vitro models of BBB and drugs to treat disorders of central nervous system diseases.

Autor im Rampenlicht: Anwendungen der TEER-Detektion zur Beurteilung der Integrität der Zellbarriere 

This protocol describes a dependable and efficient in vitro model of the brain blood barrier. The method uses mouse cerebral vascular endothelial cells bEnd.3 and measures transmembrane electrical resistance.

Aufzeichnung der funktionellen Barriereintegrität auf bEnd.3 vaskulären Endothelzellen mittels transendothelialer elektrischer Widerstandsdetektion

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...