Die Autoren bedanken sich bei Michael Alifrangis und Ulla Abildtrup zur Genotypisierung von Parasiten und Christina Holm für hervorragende technische Unterstützung danken. Diese Arbeit wurde vom Howard Hughes Medical Institute (Zuschuss 55.005.511), The Lundbeck Foundation (R9-A840) und durch die Niels Bohr Foundation finanziert.

Ein. Generation von Frisch gewählte infizierten Erythrozyten Für diesen Test werden die besten Ergebnisse erhalten werden, wenn unter Verwendung von frisch ausgewählt Kulturen für Oberflächenexpression von PfEMP1 Protein. In diesem speziellen Experiment das 3D7 P. falciparum Linie gewählt wurde mittels spezifischer Antikörper wie zuvor 1 beschrieben. Tag 1 <ol><li> Ernte 200 ul verpackt Blutzellen aus einer P. falciparum Kultur enthaltend 2-5% Spätstadium IE durch Zentrifugation bei 800 × g für 8 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Resuspendieren das Blut Pellet in 2 ml 37 ° C warmes 0,75% Gelatine Lösung in einem 14 ml steriles Röhrchen und lassen für 15-20 min bei 37 ° C, um die nicht-infizierten und Ring-Stadium IE zu sedimentieren lassen. </li><li> Ernten die Late-Stage-IE, dh die obere Phase in ein neues 14 ml Tube und waschen zweimal mit 10 ml 37 ° C warmen RBC-wash Medien. </li><li> Verdünnen Sie 50 ul von spezifischen Anti-PfEMP1-Antikörpern in 2 ml 37 ° C warmen RBC-Waschmedium und Sterilfilter. </li><li> Mischen des gewaschenen Spätstadium IE mit der sterilisierten verdünnten Antiseren in einem 14 ml steriles Röhrchen und Inkubation 30 min bei 37 ° C unter vorsichtigem Rühren. </li><li> Spin-Down bei 800 xg für 8 min bei Raumtemperatur und waschen zweimal mit 10 ml 37 ° C warmen RBC-wash Medien. </li><li> Waschen 50 ul Dynabead Protein Eine Suspension zweimal mit RBC-wash Medien mit einem DynaMaq-15 Magnet. </li><li> Resuspendieren Dynabeads in 300 ul RBC-wash Medien und fügen Sie sie der gewaschenen späten Stadium IE. Inkubieren für 30 min bei 37 ° C unter vorsichtigem Rühren. </li><li> Übertragen des Rohres mit dem DynaMaq-15-Magnet. Lassen Sie für 1-2 min und entfernen Sie die gesamte Flüssigkeit. </li><li> Resuspendieren Dynabeads in 4-5 ml RBC-wash Medien. Übertragen Sie den Schlauch wieder auf den Magneten und lassen Sie es für 1-2 min, bevor Sie die gesamte Flüssigkeit. Wiederholen Sie den Waschschritt einmal. </li><li> Übertragen Sie die gewaschenen Perlen zu einem 25 cm 2 sterile culture fLASK mit 200 ul frisch verpackt roten Blutkörperchen. Fügen Sie 5-6 ml Albumax Medien in der Kultur. Bewahren Sie über Nacht bei 5% CO 2 bei 37 ° C. </li></ol> Tag 2 <ol start="12"><li> Entfernen Sie die Dynabeads aus der Kultur, wenn der ausgewählte IE hat die frischen roten Blutkörperchen durch die Übertragung all der Kultur auf eine 14 ml steriles Röhrchen reinvaded. Setzen Sie den Schlauch auf den DynaMaq-15 Magneten und lassen für 1-2 min. Dann gießen Sie die gesamte Flüssigkeit zurück zu einer Kulturflasche. </li><li> Kultur für so wenige Zyklen wie möglich, bis einer Parasitämie von 5-10% und Parasiten sind in der ringstage. </li><li> IE sollte durch FACS analysiert werden, um sicherzustellen, dass die richtige Oberfläche Phänotyp, dh Protein Expression von entweder PFD1235w and/orPF11_0008 wurde 1 erhalten. </li></ol> 2. Herstellung von Sonden Die Antisense-RNA-Sonden wurden aus den variablen Regionen der PFD1235w und dem PF11_0008 var erzeugt &lt;/ Em&gt; Gene aus P. falciparum 3D7 genomischer DNA. DNA wurde durch PCR amplifiziert und in den Vektor pSPT18 oder 19 für die Transkription, jeweils gemäß der Beschreibung des Herstellers (Roche). Die Sonden (580 Basenpaare (bp) und 590 bp in der Länge) wurden mit Digoxigenin (DIG) oder Biotin markiert unter Verwendung eines DIG-RNA-Markierungskits oder einer RNA-Markierung Biotin-Mischung sind. Wir bestätigten die Spezifität der Sonden sowohl durch Northern Blot-Analysen und einfacher Bezeichnung FISH-Analyse 1. 3. Thin Smear und Fixierung der Parasiten Vor In-Situ-Hybridisierung Tag 1 Alle Schritte werden in einer RNase-freien Umgebung durchgeführt wird und alle Reagenzien sind RNase-frei oder mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) oder RNase Zap (Invitrogen) vorbehandelt. Die Objektträger und Deckgläser sollten mit Alkohol gereinigt werden, um restliche Fertigung Fett zu entfernen. Es ist wichtig, um das Protokoll ohne Pause zwischen den Schritten durchzuführenUm das Risiko einer Kontamination zu minimieren Nuklease. <ol><li> Machen Sie eine dünne Blutausstrich von der Norm Streumethode 3. Mit der 100x Öl Objektiv des Mikroskops, zählen die IE und berechnen den Anteil der IE in der Kultur. Prüfen, ob die Parasitenstadien in ungefährer Synchronität sind, in dem Ring und der frühen Stadien der Trophozoiten IE Zyklus. Dies sind die pre-Replikation, uni-nukleieren Stufen exprimieren var-mRNA und geeignet für einzelne Zelle FISH Transkriptionsassays dieses Typs. </li><li> Übertragen 50 ul des Parasiten Kultur bei einer Parasitämie von 5-10%, einem 1,5 ml RNase-freies Eppendorfröhrchen. Säule für 1 min bei 2.000 rpm bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie die Medien und 50 ul PBS pH 7,2 in DEPC-behandeltem Wasser. Man schüttelt das Rohr vorsichtig. Wiederholen Sie den Zentrifugalsedimentation Schritt zweimal, um die Zellen frei von Medien und Zelltrümmer zu waschen. </li><li> Machen Sie vier gute Qualität dünne Abstriche. Für jeden Abstrich machen ein Abstrich aufein Durchmesser von 11 mm sowie einer 4 gut Rutsche, dh vier Glasobjektträger insgesamt in einem RNase-free Haube (ein kritischer Schritt). Welle gleitet kurz in die Luft zu trocknen. Make drei zusätzliche Folien für Negativkontrollen-one Rutsche für einzelne Sonde Färbung für jede andere irrelevant Gen durch Verwendung einer spezifischen Sonde, ein weiterer Schieber für RNase-Behandlung und einer dritten Folie mit IE nicht Expression des Gens von Interesse. Lassen Sie die Folien auf der Bank für 10-20 min trocknen. </li><li> Befestigen Sie die dünnen Schichten durch Zugabe von 60 ul der Fixierung Lösung mit 4% Paraformaldehyd und 5% Eisessig in die Vertiefungen. Lassen Sie für 10 Minuten auf der Bank bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen der Objektträger in 2x SSPE-Puffer für 5 min unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur. Entfernen Sie kurz die überschüssige Flüssigkeit durch Berühren die Brunnen, welche die Zellen vorsichtig mit einem Papiertuch. </li><li> Bedecken Sie die Folien mit 0,01% Pepsin in 0,01 M HCl für 2 min bei 37 ° C (ein äußerst wichtiger Schritt). Waschen der Objektträger in 2x SSPE, 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Verdünnt das RNase-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 10 ug / ml. Bedecken Sie die negative Kontrolle Abstriche mit 60 ul der RNase-Lösung. Inkubieren für 30 min bei 37 ° C und dann waschen Sie die Folien in 2x SSPE für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Fahren Sie direkt mit der Hybridisierung. </li></ol> 4. Hybridisierung von RNA-Sonden auf Fixed Slides Tag 1 <ol><li> Bereiten Sie die Hybridisierung Kammer, wie ThermoStar 100 HC4 oder eine leere Pipettenspitzen-Kasten in einem sauberen Ofen geschoben, durch Bespritzen mit RNase Zap und Abwischen mit einem Papiertuch reinigen. Füllen der Kanäle der Hybridisierungskammer oder dem Boden der Schachtel mit DEPC-behandeltem Wasser, um sicherzustellen, daß die Schieber nicht austrocknet während der Hybridisierung. Schließen Sie die Kammer und Vorwärmung auf 48 ° C. </li><li> Verdünnt den Sonden in der Hybridisierungslösung bis zu einer Endkonzentration von 12 ng / ul. Denaturieren die Sonde Lösung bei 65 ° C für 5 min in einem Heizblock. Sofort auf Eis kühlen. </li><li> Kurz an der Luft trocknen die Folien nach der 2x SSPE waschen. Entfernen Sie vorsichtig die überschüssige Flüssigkeit rund um den Brunnen mit einem Papiertuch. </li><li> Öffnen Sie die Hybridisierung Kammer und legen Sie die Folien in der Kammer. Anwendung einer oder beide Sonden in einem Gesamtvolumen von 60 ul pro Vertiefung. Sorgfältig decken die Flüssigkeitstropfen mit einem RNase-free Deckglas mit einer sterilen Pinzette. </li><li> Schließen Sie die Kammer und hybridisieren die Folien bei 48 ° C für mindestens 16 Stunden über Nacht. </li></ol> 5. Antikörper Konjugation und Fluoreszenz Amplification Tag 2 Die folgenden Schritte werden auf der TSA Plus-Fluoreszenz Palette System von Perkin Elmer basiert. Alle Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt. <ol><li> Waschen Sie die Slides 3 mal in TNT-Puffer für 5 min unter leichtem Schütteln. </li><li> Blockieren Sie den Brunnen in 150 ul TNB-Puffer für 30 min. </li><li> Verdünnt das HRP-konjugiertem α-DIG Antikörpers in TNB-Puffer in einem Verhältnis von 1:100 und das HRP-konjugiertem α-Biotin-Antikörper in TNB-Puffer, in einem Verhältnis von 1:500. Entfernen Sie überschüssiges TNB-Puffer von den Dias mit einem Papiertuch. Bei der Erfassung zwei Transkripte gleichzeitig können beide Antikörper auf einmal zu gehen. Tragen Sie eine Gesamtmenge von 100 ul des Antikörper-TNB-Lösung pro Well und vorsichtig mit einem Deckglas abdecken. Inkubieren Sie die Objektträger für 2 Stunden. </li><li> Entfernen Sie die Deckgläser vorsichtig. Waschen der Objektträger in TNT-Puffer 3-mal für 5 min. </li><li> Verdünnt das FITC-Fluorophor in der Tyramid Amplifikationsreagens in einem Verhältnis von 1:500 und anzuwenden 100 ul der Lösung in jede Vertiefung. Bedecken Sie die Wells mit Deckgläsern und inkubieren für 12 min. </li><li> Entfernen Sie den Deckel rutscht sorgfältig waschen und die Folien 3 mal für 5 min in TNT-Puffer durch vorsichtiges Schütteln. </li><li> Verdünnt das Cyan3-Fluorophors in der Tyramid Amplifikationsreagens in einem Verhältnis von 1:500. Fügen Sie 100 ul proauch dieser Lösung. Bedecken Sie die Wells mit Deckgläsern und inkubieren für 12 min. </li><li> Entfernen Sie den Deckel rutscht vorsichtig und dann spülen Sie die Folien schnell durch Eintauchen in TNT-Puffer. </li><li> Waschen Sie die Slides 3 mal mit TNT-Puffer für 5 min. </li><li> Eintauchen der Objektträger schnell in DEPC-behandeltem Wasser. </li><li> Lassen Sie die Folien an der Luft trocknen. Montieren Sie die Folien mit Anti-Fade Reagenz DAPI. Verschließen Sie die Ecken der Deckgläser mit Nagellack. </li><li> Die Folien sind nun bereit für die Mikroskopie. Halten Sie die Folien mit Aluminiumfolie und bei 4 ° C abgedeckt, wenn das Experiment abgeschlossen am nächsten Tag ist. Eine vollständige Abdichtung der Seiten der Folien kann werden 24 Stunden nach dem Aufbringen des Anti-Fade-Reagens durchgeführt wird. Dadurch können die Folien für abgebildet werden bis zu einer Woche nachdem das Protokoll abgeschlossen ist. </li></ol> 6. Visualisierung der hybridisierten Sonden <ol><li> Schalten Sie das Mikroskop. Ein Standard Immunfluoreszenzmikroskop ist sufficient für diese Art von Experiment, aber wenn Sie Zugang zu einem konfokalen Mikroskop haben, können Sie dieses auch verwenden, für 3D-Bilder oder Videos von Ihrem gefärbten Zellen zu erhalten. Lassen Mikroskop zum Aufwärmen für 15-30 min. Schalten Sie den Computer und die Software. </li><li> Prüfen Sie die Qualität der Färbung auf der Immunfluoreszenzmikroskop. Wählen Sie einen Ort mit ein paar Parasiten. </li><li> Passen Sie die Verstärkung jedes Laser manuell. Passen Sie die Pixel zu 4-6 m -1 s -1 und die Schritte zu 512 x 512 Pixel wohnen. </li><li> Nehmen Sie ein Testbild mit Frame Lambda. Stellen Sie die Laserverstärkung. </li><li> Nehmen Sie ein Minimum von 20 gute Bilder von fluoreszierenden Einzelzellen. Mindestens 2-5 Bilder eines Feldes mit 5-20 Parasiten notwendig sind, um eine faire Überblick über den Prozentsatz an positiven Parasiten erhalten. </li></ol>

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	<li>Joergensen, L., Bengtsson, D. C., Bengtsson, A., Ronander, E., Berger, S. S., Turner, L., Dalgaard, M. B., Cham, G. K., Victor, M. E., Lavstsen, T., Theander, T. G., Arnot, D. E., Jensen, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+co-expression+of+two+different+PfEMP1+antigens+on+single+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+facilitates+binding+to+ICAM1+and+PECAM1.">Surface co-expression of two different PfEMP1 antigens on single Plasmodium falciparum-infected erythrocytes facilitates binding to ICAM1 and PECAM1.</a> PLoS Pathog. 2, 1001083 (2010).</li><li>Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+two+mRNA+species+at+single-cell+resolution+by+double-fluorescence+in+situ+hybridization.">Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization.</a> Nat. Protoc. 3, 1370-1379 (2008).</li><li>Cheeseborough, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> District Laboratory Practice in Tropical Countries. , (2006).</li><li>Brolin, K. J., Ribacke, U., Nilsson, S., Ankarklev, J., Moll, K., Wahlgren, M., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+transcription+of+duplicated+var2csa+gene+copies+in+individual+Plasmodium+falciparum+parasites.">Simultaneous transcription of duplicated var2csa gene copies in individual Plasmodium falciparum parasites.</a> Genome Biol. 10, R117 (2009).</li><li>Epp, C., Li, F., Howitt, C. A., Chookajorn, T., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+associated+sense+and+antisense+noncoding+RNAs+are+transcribed+from+the+var+gene+family+of+virulence+genes+of+the+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum.">Chromatin associated sense and antisense noncoding RNAs are transcribed from the var gene family of virulence genes of the malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> RNA. 15, 116-127 (2009).</li><li>Freitas-Junior, L. H., Hernandez-Rivas, R., Ralph, S. A., Montiel-Condado, D., Ruvalcaba-Salazar, O. K., Rojas-Meza, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+heterochromatin+propagation+and+histone+acetylation+control+mutually+exclusive+expression+of+antigenic+variation+genes+in+malaria+parasites.">Telomeric heterochromatin propagation and histone acetylation control mutually exclusive expression of antigenic variation genes in malaria parasites.</a> Cell. 121, 25-36 (2005).</li><li>Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locked+nucleic+acid-based+in+situ+detection+of+microRNAs+in+mouse+tissue+sections.">Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections.</a> Nature Protoc. 2, 1508-1514 (2007).</li><li>Li, F., Sonbuchner, L., Kyes, S. A., Epp, C., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+non-coding+RNA+are+transcribed+from+the+centromeres+of+Plasmodium+falciparum+and+are+associated+with+centromeric+chromatin.">Nuclear non-coding RNA are transcribed from the centromeres of Plasmodium falciparum and are associated with centromeric chromatin.</a> J. Biol. Chem. 283, 5692-5698 (2008).</li><li>Thompson, J., Sinden, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+Pbs21+mRNA+during+sexual+development+of+Plasmodium+berghei.">In situ detection of Pbs21 mRNA during sexual development of Plasmodium berghei.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 68, 189-196 (1994).</li><li>Thompson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+RNA+in+blood-+and+mosquito-stage+malaria+parasites.">In situ detection of RNA in blood- and mosquito-stage malaria parasites.</a> Methods Mole Med. 72, 225-235 (2002).</li><li>Arnot, D. E., Ronander, E., Bengtsson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progression+of+the+intra-erythrocytic+cell+cycle+of+Plasmodium+falciparum+and+the+role+of+the+centriolar+plaques+in+asynchronous+mitotic+division+during+schizogony.">The progression of the intra-erythrocytic cell cycle of Plasmodium falciparum and the role of the centriolar plaques in asynchronous mitotic division during schizogony.</a> Int. J. Parasitol. 41, 71-80 (2011).</li><li>Osborne, C. S., Chakalova, L., Brown, K. E., Carter, D., Horton, A., Debrand, E., Goyenechea, B., Mitchell, J. A., Lopes, S., Reik, W., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+genes+dynamically+colocalize+to+shared+sites+of+ongoing+transcription.">Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription.</a> Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

FISH-Analyse RNA im Gegensatz zu Verfahren, wie Northern Blot und RT-PCR, erlaubt die Diskriminierung von spezifischen mRNA-Transkripte in der einzelnen Zelle. Dies macht es möglich, zwischen transkriptionell aktiven und inaktiven Zellen zu unterscheiden, in diesem Beispiel, P. parasitischen Protozoen falciparum in menschlichen roten Blutzellen. Solche whole-cell Beobachtungen sind oft notwendig und kann zu entwirren wichtige und neuartige transkriptionellen Mustern ein. <p class="jove_...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Essigsäure </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> 338.826-100ml </td><td></td></tr><tr><td> Albumax Medien: RPMI 1640 Glutamin-Lösung </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 500 ml RPMI 1640 5 ml Glutamin-Lösung </td></tr><tr><td> Albumax Medien: Gentamycinsulfat Albumax-Lösung </td><td> Lonza </td><td> BE02-012E </td><td> 2,5 ml Gentamicinsulfat 50 ml Albumax-Lösung </td></tr><tr><td> Albumax-Lösung: Hypoxanthine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9377 </td><td> 0,8 g Hypoxanthine </td></tr><tr><td> Albumax-Lösung: AlbuMAX II </td><td> Ichnvitrogen </td><td> 11021-037 </td><td> 200 g Albumax </td></tr><tr><td> Albumax-Lösung: RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 4 Liter RPMI 1640 Auflösen mit Magneten an max. 50 ° C. Filtern sterilisieren und bei -20 ° C in Aliquots. </td></tr><tr><td> Amberlite </td><td> Sigma </td><td> A5710-110G </td><td> Resin zu Formamid entionisieren. </td></tr><tr><td> Anti-Biotin Ziege pAb Peroxidase Konjugat </td><td> Calbiochem </td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Dig-Antikörper </td><td> Novus Biologicals </td><td> NB100-41330 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Fade Reagenz mit DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td> Die Montage media hat für 24 h vor dem Versiegeln die Folie vollständig zu heilen. </td></tr><tr><td> Biotin RNA Labeling Mix </td><td&gt; Roche </td><td> 11685597910 </td><td></td></tr><tr><td> Kamera digital </td><td> Nikon digitale Anblick DC-F11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deckgläser </td><td> Menzel-glaser </td><td> 631-1570 </td><td></td></tr><tr><td> Kulturflasche 25 cm 2 Nunclon Oberfläche </td><td> Nunc </td><td> 156340 </td><td></td></tr><tr><td> DEPC </td><td> Fluka / Sigma </td><td> 32.490-100ml </td><td> 1 ml DEPC in 1000 ml deinonized Wasser. Schreibe einen Rührstab und rühren für 12 Stunden. Autoklaven für 30 min. </td></tr><tr><td> Digitalkamera </td><td> Nikon digitale Anblick DC-F11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dynabeads Protein A </td><td> Invitrogen </td><td> 10002D </td><td></td></tr><tr><td> DynaMaq-15 Magnet </td><td> Invitrogen </td><td> 123-01D </td><td></td></tr><tr><td> Formamid bioultra 99% </td><td> Fluka/ Sigma </td><td> 47.671-1l-F </td><td> Deionisiertes Formamid: 5 g Ionenaustauscherharz pro 100 ml Formamid. Stir 30 min. Anschließend wird durch Whatman-Papier. </td></tr><tr><td> . Gelatine 0 75% ige Lösung: Gelatine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2500 </td><td> 3,75 g Gelatine in 500 ml RPMI 1640. Wärme auf 56 ° C zu lösen. Filtern sterilisieren, wenn 56 ° C. Lagerung bei -20 ° C in Aliquots. </td></tr><tr><td> . Gelatine 0 75% ige Lösung: RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 3,75 g Gelatine in 500 ml RPMI 1640. Wärme auf 56 ° C zu lösen. Filtern sterilisieren, wenn 56 ° C. Lagerung bei -20 ° C in Aliquots. </td></tr><tr><td> Glutamin-Lösung: L-Glutamin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G3126 </td><td> 14,6 g L Glutamin in 500 ml 0,9% NaCl. Auflösen, Filter sterilize und bei -20 ° C in Aliquots. </td></tr><tr><td> Glutamin-Lösung: HCl </td><td> Sigma </td><td> H1758 </td><td> 14,6 g L Glutamin in 500 ml 0,9% NaCl. Auflösen, filtern sterilisieren und bei -20 ° C in Aliquots. </td></tr><tr><td> Hybridisierungslösung: Formamid Bio Ultra 99% SSC 20x </td><td> Fluka / Sigma </td><td> 47.671-1l-F </td><td> Insgesamt 20 ml, halten gefroren bei -20 ° C in Aliquots 10 ml entionisiertem Formamid </td></tr><tr><td> Hybridisierungslösung: Denhardts 50x Konzentrat </td><td> Sigma </td><td> D2532 </td><td> 5ml 20 × SSC </td></tr><tr><td> Hybridisierungslösung: Hefe tRNARoche Blockierungsreagenz </td><td> Sigma </td><td> R-6750 </td><td> 2 ml 50x Denhardt 250 ul 20 mg pro ml Hefe tRNA </td></tr><tr><td><sTrong&gt; Hybridisierungslösung: Lachs-Sperma-DNA </td><td> Fluka / Sigma </td><td> 31.149-106GF </td><td> 0.4g Roche Blockierungsreagenz 1 ml von 10 mg pro ml Lachssperma-DNA (Critical: denaturieren Lachs spermDNA bei 96 ° C für 5 min vor Zugabe zu der Hybridisierungslösung) </td></tr><tr><td> Hybridizer ThermoStar 100 HC4 </td><td> Quantifoil Instruments GmbH </td><td> 1004-0011 </td><td> Kann durch Hybridisierung Backofen und RNase-frei Hybridisierung Kammern mit DEPC-Wasser aufgefüllt ersetzt werden. </td></tr><tr><td> Immersionsöl UV transparent fluoreszenzfrei </td><td> Sigma </td><td> 10.976-1EA </td><td></td></tr><tr><td> Immunfluoreszenz oder Konfokalmikroskop </td><td> Nikon D-Eclipse TE2000C </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nagellack </td><td> Erhältlich in der Apotheke </td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBS 20x: NaCl KCl Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O KH 2 PO 4 DEPC deionisiertem H 2 O </td><td></td><td></td><td> Ajust pH auf 7,4 160 g 4 g 23 g 4 g 1 l </td></tr><tr><td> Paraformaldehyd 4% </td><td> Fluka / Chemika </td><td> 76240 </td><td> 4 g PFA in 80 ml PBS / DEPC. Wärme auf 65 ° C, bis die PFA auflöst. 20 ml PBS, dass die Lösung abkühlen. Den pH-Wert auf 7,4. Filtern. Store in Aliquots bei -20 ° C. </td></tr><tr><td> Paraformaldehyd 4% / Acid Essigsäure 5% </td><td></td><td></td><td> 950 ul Paraformaldehyd + 50 ul Essigsäure </td></tr><tr><td> Pepsin </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> P7000 </td><td></td></tr><tr><td> Peroxidase-konjugiertes anti-Biotin </td><td> Calbiochem </td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td> RBC-wash Medien: RPMI 1640 Glutamin-Lösung </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 500 ml RPMI 1640-Lösung 5 ml Glutamin </td></tr><tr><td> RBC-wash Medien: Gentamycin-Sulfat </td><td> Lonza </td><td> BE02-012E </td><td> 2,5 ml Gentamicinsulfat </td></tr><tr><td> RNase </td><td> Sigma / Aldrich </td><td></td><td> Machen Sie eine 10 mg / ml Stammlösung. </td></tr><tr><td> RNase freies 1,5 ml Tube </td><td> Ambion </td><td> AM12450 </td><td></td></tr><tr><td> RNase Zap </td><td> Ambion </td><td> AM9780 </td><td></td></tr><tr><td> Gleitet 4 Vertiefungen 11mm </td><td> Thermo Scientific </td><td> MENZXER306W </td><td></td></tr><tr><td> SSC 20x: NaCl </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> S9625 </td><td> 3 M NaCl (175 g / l) 0,3 M Na 3-Citrat x H 2 O (88 g / l) auf pH 7,0 einstellen mit 1M HCl </td></tr><tr><td> SSC 20x: Natriumcitrat Dihydrat </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> W302600 </td><td> 3 M NaCl (175 g / l) 0,3 M Na 3-Citrat x H 2 O (88 g / l) auf pH 7,0 einstellen mit 1M HCl </td></tr><tr><td> SSPE 20x: NaCl </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> S9625 </td><td> 175,3 g NaCl </td></tr><tr><td> SSPE 20x: NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> S0751 </td><td> 27,6 g NaH 2 PO 4. </td></tr><tr><td> SSPE 20x: 4 EDTA-Pulver </td><td></td><td></td><td> 9,4 g EDTA-Pulver Fügen DEPC Wasser, pH-Einstellung 7,4. Autospaltete für 20 min </td></tr><tr><td> TNB-Puffer: TNT-Puffer </td><td></td><td></td><td> 10 ml TNT-Puffer </td></tr><tr><td> TNB-Puffer: Blockierungsreagenz </td><td></td><td></td><td> 0.05g Blockierungsreagenz Um das Blockierungsreagenz aufzulösen, erhitzen der Lösung auf 60 ° C für eine Stunde unter Rühren. Lagerung bei -20 ° C. (Abgeleitet von der Firma Perkin Elmer TSA-Protokoll.) </td></tr><tr><td> TNT-Puffer: Tris / HCl </td><td> Sigma </td><td> T1503 </td><td> 1 M Tris / HCl, pH 8,0 </td></tr><tr><td> TNT-Puffer: NaCl </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S9625 </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> TNT Puffer: Tween20 </td><td> Sigma </td><td> 93773 </td><td> 5 M NaCl 30 ml 1 ml DEPC dH 2 O869 Ml PH-Wert auf 7,5 bei Raumtemperatur. (Abgeleitet von der Firma Perkin Elmer TSA-Protokoll.) </td></tr><tr><td> TSA sowie Cyanine3 / Fluorescein-System </td><td> Perkin Elmer </td><td> NEL753000IKT </td><td> Lesen Sie das Protokoll aus der TSA Plus-Fluoreszenz Palette Systems sorgfältig durch, bevor das Experiment. </td></tr><tr><td> Tubes 14 ml sterile </td><td> Almeco - CM LAB Aps </td><td> 91016 </td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of single-cell gene transcription by rna fluorescent in situ hybridization (fish)

Adhäsion von Plasmodium falciparum infizierten Erythrozyten (IE) für die menschliche endotheliale Rezeptoren bei Malaria-Infektionen durch Expression PfEMP1 Protein-Varianten durch die Gene kodiert var vermittelt. Die haploiden P. falciparum Genoms beherbergt etwa 60 verschiedene Gene var von denen nur eine geglaubt hat, die pro Zelle zu einem Zeitpunkt während des Blut Stadium der Infektion transkribiert. Wie solche gegenseitig ausschließenden Regulierung der Gentranskription var erreicht ist unklar, da die Identifizierung einzelner Gene oder var Untergruppen von var Gene mit verschiedenen Rezeptoren und die Folge der unterschiedlichen Bindung auf das klinische Ergebnis von P. zugeordneten falciparum-Infektionen. Vor kurzem hat die gegenseitig ausschließende Transkription Paradigma in Zweifel durch Transkription Assays auf Basis einzelner P. aufgerufen falciparum transcript Identifikation in einzelnen infektiert erythrozytären Zellen unter Verwendung von RNA Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) von var Gentranskription durch den Parasiten im einzelnen Kerne von P. falciparum IE 1. Wir beschreiben hier ein ausführliches Protokoll zur Durchführung des RNA-FISH-Methodik zur Analyse von var Gentranskription in Einzel-Kerne von P. falciparum infiziert menschliche Erythrozyten. Das Verfahren beruht auf der Verwendung von Digoxigenin-Basis und Biotin-markierte Antisense-RNA-Sonden unter Verwendung der Fluoreszenz-Plus-TSA Palette System 2 (Perkin Elmer), mikroskopische Analysen und frisch ausgewählt P. falciparum IE. Die in situ-Hybridisierungsverfahren verwendet werden, um Transkription und Regulation einer Vielzahl von Genen in den verschiedenen Phasen des P. ausgedrückt überwachen falciparum Lebenszyklus und ist anpassungsfähig an andere Malaria-Parasiten Arten und anderen Organismen und Zelltypen.

Abbildung 1 zeigt ein Flussdiagramm der wichtigsten Schritte und der Zeitdauer der RNA FISH Methodik. Eine Reihe von repräsentativen Bildern von gut und schlecht erhaltenen gefärbten mRNA FISH-Experimente mit einzelnen P. falciparum IE sind in Abbildung 2 gezeigt. Diese intrazellulären Protozoen hat einen kleinen (1-1.5 Mikrometer Durchmesser) Kern, blau gefärbt mit DAPI wird. Vierundzwanzig Stunden nach Erythrozyten Invasion im P. falciparu...

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Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluoreszierend<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung (FISH) auf mRNA-Transkripte in den einzelnen Zellen zu identifizieren ermöglicht die Analyse von polygenen Tätigkeit wie die gleichzeitige Transkription von mehr als einem Mitglied der<em&gt; Var</em&gt; Multigenfamilie in<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Infizierten Erythrozyten<sup&gt; 1</sup&gt;. Die Technik ist anpassbar und kann bei verschiedenen Arten von Genen, Zellen und Organismen verwendet werden.

Analyse von Einzel-Zell-Gene Transkription durch RNA-Fluorescent<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

analysis-single-cell-gene-transcription-rna-fluorescent-situ

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

15.3K Aufrufe.  University of Copenhagen. Fluoreszierend In situ Hybridisierung (FISH) auf mRNA-Transkripte in den einzelnen Zellen zu identifizieren ermöglicht die Analyse von polygenen Tätigkeit wie die gleichzeitige Transkription von mehr als einem Mitglied der Var Multigenfamilie in Plasmodium falciparum Infizierten Erythrozyten 1. Die Technik ist anpassbar und kann bei verschiedenen Arten von Genen, Zellen und Organismen verwendet werden.

Serie: Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafisch Whole Mount High-Resolution Doppel Fluorescent In-situ Hybridisierung

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Forschung

Biologie

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Fluoreszenz In situ Hybridisierung (FISH)-Protokoll in menschlichen Spermien

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

In vitro Transkription und Capping von Gaussia-Luciferase mRNA von HeLa-Zelle Transfektion Gefolgt

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. Each of these features can be accomplished with in situ hybridization to mRNAs within cells. Here we present a radioactive in situ hybridization method modified from Clayton et al. (1988)1 that has been working successfully in our lab for many years, especially for adult vertebrate brains2-5. The long complementary RNA (cRNA) probes to the target sequence allows for detection of low abundance transcripts6,7. Incorporation of radioactive nucleotides into the cRNA probes allows for further detection sensitivity of low abundance transcripts and quantitative analyses, either by light sensitive x-ray film or emulsion coated over the tissue. These detection methods provide a long-term record of target gene expression. Compared with non-radioactive probe methods, such as DIG-labeling, the radioactive probe hybridization method does not require multiple amplification steps using HRP-antibodies and/or TSA kit to detect low abundance transcripts. Therefore, this method provides a linear relation between signal intensity and targeted mRNA amounts for quantitative analysis. It allows processing 100-200 slides simultaneously. It works well for different developmental stages of embryos. Most developmental studies of gene expression use whole embryos and non-radioactive approaches8,9, in part because embryonic tissue is more fragile than adult tissue, with less cohesion between cells, making it difficult to see boundaries between cell populations with tissue sections. In contrast, our radioactive approach, due to the larger range of sensitivity, is able to obtain higher contrast in resolution of gene expression between tissue regions, making it easier to see boundaries between populations. Using this method, researchers could reveal the possible significance of a newly identified gene, and further predict the function of the gene of interest.

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

This protocol is successfully used to quantitatively detect levels and spatial patterns of mRNA expression in multiple tissue types across vertebrate species. The method can detect low abundance transcripts and allows processing of hundreds of slides simultaneously. We present this protocol using expression profiling of avian embryonic brain formation as an example.

Radioaktiv In-situ- Hybridisierung zum Nachweis Diverse Genexpressionsmuster in Tissue

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Nachweis viraler RNA durch Fluoreszenz<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

Chromosome Replizieren Timing mit Fluorescent Kombiniert<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Whole Berg RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung in whole mount Embryonen und Histologie für Marine Elasmobranchs Angepasst

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...