Diese Arbeit wurde von dem Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Collaborative Innovation Award unterstützt. LAM wurde von der Signaling and Cellular Verordnung National Institute of Health Ausbildungsförderung (T32 GM008759) und der NIH Ruth L. Kirschstein Pre-Doctoral Fellow (CA165349-01) unterstützt. Wir möchten Prof. Michael Stowell (CU Boulder), Prof. Douglas Rees und Prof. Rob Phillips (Caltech) für ihre wertvollen Kommentare danken.

1. Liposomenpräparat <ol><li> Abrufen einer 20 ml-Glas mit einem mit Teflon ausgekleideten Deckel. </li><li> Reinigen Sie alle Glaswaren und Spritzen mit Chloroform vor dem Gebrauch, um eine Kontamination zu verhindern. </li><li> Übertragen Sie 100 ul Chloroform von Reagenzgüteklasse dem Glasfläschchen mit einer 250 ul luftdichten Glas Spritze. </li><li> In 30 l Reagens reines Methanol zu dem gleichen Glasfläschchen mit einer 100 ul luftdichten Glas Spritze. </li><li> Phosphatidylethanolamin (PAPST):: zu einer 2 mm 7:1.5:1.5 Phosphatidylcholin (POPC) vorbereiten Cholesterin-Lipid-Lösung, zu übertragen 216 ul 10 mg / mL POPC, 42 ul 10 mg / mL Papst und 20 ul von 11 mg / mL Cholesterin-Lösungen in CHCl 3 der 20 ml Glasflasche. </li><li> Verdampft die organischen Lösungsmittel unter Verwendung langsam-Flow-Argon oder Stickstoff, bis ein dünner Film von Lipiden an der Unterseite des Glasfläschchens. </li><li> Legen Sie den nicht begrenzten Glasfläschchen in einem Vakuumexsikkator für mindestens 30 Minuten, um das restliche Lösungsmittel zu entfernen. </li><li> Transfer 2 ml Puffer, die vorher durch einen 0,2 Mikron-Filter geleitet, um dem Glasfläschchen zu hydratisieren die Lipide. </li><li> Inkubieren Sie die Mischung bei 4 ° C über Nacht und innerhalb von 48 Stunden. </li></ol> 2. Frost-und Tauwetter-: Für Liposomengrößen von 30 bis 100 nm nur <ol><li> Liposomensuspension Einfrieren in flüssigem Stickstoff für 15 Sekunden. </li><li> Auftauen Liposomensuspension mit einem Heizblock bei 42 ° C Temperatur für ~ 3 Minuten. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.1 und 2.2 für insgesamt 5 Zyklen. </li></ol> 3. Extrusion Folgen Sie den Anweisungen, um Avestin korrekt zusammenbauen LiposoFast LF-50 Extruder, mit dem Instrument stellen in ihren Reiseführer. <ol><li> Platzieren Sie die große Öffnung Stützsieb (mit runden Löchern) in dem Träger Filtergrundplatte, gefolgt von der kreisförmigen gesinterten Schale (ohne Löcher), eine Drain-Scheibe (25 mm Durchmesser), und eine Polycarbonat-Membran (25 mm im Durchmesser). </li><li> Setzen Sie den kleinen, schwarzenO-Ring an der Oberseite der Membran, um sie auf den Träger Filter zu befestigen. </li><li> Bringen Sie die obere Filter Extruder durch Anziehen 4 Schrauben in den vier entsprechenden Löcher. </li><li> Montieren Sie den Filter auf die Extruder-Einheit unter dem großen Extruderzylinder. Fügen Sie die Liposomen-Lösung für das Zylinderrohr. Platzieren Sie den folgenden auf der Oberseite des Extrusionstrommel um: große, runde O-Ring, schmale Mütze, großen runden O-Ring-, Kreis-Kappe. </li><li> Befestigen Sie den Gasregler auf dem Extruderzylinder oben und schließen Sie alle Ventile zu Luftverlust, darunter das Überdruckventil zu verhindern. Legen Sie eine 20 ml Glasflasche oder 50-ml-Erlenmeyer-Kolben unter dem Extruder Filtereinheit. Ein Sicherheitsventil ist an den Regler angeschlossen werden und loslassen, wenn der Druck über 600 psi. Schalten Sie das Stickstoffgas und öffnen Sie das Gasventil mit dem Extruder. </li><li> Steigern Stickstoffdruck auf 25 psi für 400 nm Liposomen, 125 psi für 100 nm Liposomen und 400-500 psi für 30 nm Liposomen. </li><li> Sehen Sie sich das Liposom suspSpannen Sie wie es in den Behälter ausstößt, während der Stickstoff geschoben wird. Halten Sie den Stickstoff fließt, bis Sie beobachten nicht mehr jede Flüssigkeit, die durch den Extruder Filter in das Glasgefäß. </li></ol> 4. Die dynamische Lichtstreuung (DLS) Analyse <ol><li> Bereiten 50 ul einer 20 uM Liposomenlösung. </li><li> Schalten Sie die Stromversorgung der Lampe und Quelle. </li><li> Öffnen Sie die DynaPro Software. </li><li> Stellen Sie die Software an die MS / X-Algorithmus Modell Liposomen von 30 nm und 100 nm und MS800-Algorithmus Modell&gt; 100 nm Liposomen erkennen zu erfassen. </li><li> Schließen Sie an die Hardware. </li><li> Jeweils 14 ul von Liposomen-Probe in die Quarzküvette und Einsatz in den Küvettenhalter. </li><li> Drücken Sie starten. </li><li> Drücken Sie nach ~ 20 stoppen - 30 Akquisitionen. </li><li> Analysieren Sie die durchschnittliche Liposomendurchmesser Gipfel im Histogramm aufgezeichnet. </li></ol> 5. Nanopartikel Tracking-Analyse (NTA) <ol><li> Bereiten Sie einen 500 mL, 0,1 uM LiposomenLösung. </li><li> Spülen Sie den Probenraum mit Wasser und Ethanol. </li><li> Trocknen Sie den Probenraum mit einem fusselfreien Papiertuch. </li><li> Schalten von der Laserleistung und an den Computer. </li><li> Liefern Sie 300 ul 0,1 uM Liposomenlösung zu den Probenraum. </li><li> Öffnen Sie die Temperaturregelung und die Nanopartikel-Tracking-Analyse-Software. </li><li> Drücken Sie auf die Schaltfläche Capture, um den Laser einzuschalten. </li><li> Verwenden Sie die horizontalen und vertikalen Ausrichtung auf die Bühne zu bewegen und justieren Sie die Mikroskop-Fokus. </li><li> Stellen Sie die gewünschte Temperatur (20 ° C) und Aufnahmedauer (mindestens 30 Sekunden). </li><li> Drücken Sie die Record-Taste, um mehrere Bilderrahmen der Liposomen-Partikel für eine bestimmte Menge an Zeit in Anspruch nehmen. Analysieren der Peaks, die den Durchmesser Liposomengrößen auf dem Histogramm, wie es die Bewegung der einzelnen Partikel verfolgt. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Ein Schema skizziert die Extrusion Methode ist pübel in 1. Um optimale Ergebnisse zu erhalten, Herstellung von Liposomen mit einem Durchmesser von 30 nm erfordert einen hohen Druck von ~ 500 psi und einem Durchmesser von 100 nm erfordert einen Druck von 125 psi, um eine rasche Filter zu erzielen. Für Durchmesser von 400 nm, ein Unterdruck von etwa 25 psi empfohlen eine etwas langsamere Abscheiderate, die die Vesikel zu verlängern und zu größeren, homogenen Liposomen können zu erreichen. Wir führten eine Reihe von Experimenten, um den optimalen Druck für die Erstellung von konsistenten Sub-Mikrometer-Vesikel Größen zu bestimmen. Wir variiert der Druck als auch die Anzahl der Extrusion durchläuft Polycarbonat-Filter mit einer Porengröße von 30, 100 und 400 nm und entdeckte geeigneten Druck für jede gewünschte Größe. Für 30 nm Poren, wird der Druck unter 500 psi reduziert die Fließgeschwindigkeit, was zu Dehnung und damit größere Vesikelgrößen. Für 100 nm Poren, wurde ein stetiger Strom bei 125 psi erreicht. Bei 400 nm-Poren, ermöglicht niedrigem Druck (25 psi) die Vesikel in größeren Vesikel s länglichenzialisiert. Eine langsame tropfenweise Flow Filtration ist optimal, um größere Sub-Mikrometer-Vesikel 13 zu schaffen. Wir führten DLS die Liposomengrößen extrudiert durch drei verschiedenen Durchmessern, dh 30, 100 und 400 nm zu bestimmen. DLS ist ein etabliertes Verfahren, das gestreute Licht sammelt, um die Partikeldurchmesser zu bestimmen. Wir extrudiert hydratisierten Liposomen von 2 mM durch eine Polycarbonat-Membran 30 nm bei 500 psi mit 5 Durchgängen durch den Filter Poren, eine 100 nm Polycarbonat-Membran bei 125 psi mit 5 Durchgängen durch den Filter Poren und einer 400 nm Polycarbonat-Membran bei 25 psi mit 2 durch den Filter Poren. Die Durchmesser der Liposomen gemessen und durch DLS für 30, 100 und 400 nm Porengröße waren 66 ± 28, 138 ± 18 und 360 ± 25 nm (Abbildung 2). Eine Suspension von 50 nm Polystyrolkügelchen wurde als Kalibrierstandard verwendet wie in 2, wo sie erfasst einen Durchmesser von 47 ± 16 nm dargestellt. Die prozentuale polydispersity zeigt, dass es keine Überschneidungen innerhalb Liposomen-Größen. Es ist typisch, Durchmesser größer als 30 nm zu beobachten bei der Verwendung von DLS-Analyse aufgrund der bekannten Bias dieses Instrument zu größeren Partikel 12. Lichtstreuung Intensitäten von großen und kleinen Partikeln gleichzeitig von einem Nachweisverfahren gesammelt und damit schwerer zu Liposomen in Suspension 12 zu lösen. Trotz dieser Einschränkung instrumental, beschreibt die Eichkurve eine nahezu lineare Korrelation. NTA ist eine neue Technologie, die die Größe der einzelnen Partikel aus direkten Beobachtungen der Diffusion in einem flüssigen Medium, unabhängig von Teilchen Brechungsindex oder Dichte mißt. Das hochauflösende Technik kann verwendet werden, um die Messung von Liposomen mit DLS ergänzen. Die NTA aufgezeichnet Durchmesser von 95 ± 48 und 356 ± 51 nm, zwei 100 nm und 400 nm Polystyrol-Lösungen wurden für die Kalibrierung verwendet. Lipid-Lösungen von 30 nm und 100 nm beobachtet, um eine Layout-Datei haben<html> landwirtschaftlicher Durchmesser zu den DLS wie in 3 gezeigt ist, wodurch durchschnittlichen Größen von 29 ± 14, 95 ± 17 und 359 ± 73 nm aufweist. 1000 nm - Die NTA kann eine allgemeinere Charakterisierung Technik, um mikroskopisch kleine Partikel zu quantifizieren, da seine Empfindlichkeit erlaubt es, Partikel von 50 zu messen sein. Die Eichkurve zeigt eine lineare Korrelation zwischen den Polycarbonat-Membran Poren im Vergleich zu dem aufgezeichneten NTA Durchmesser. <table border="1"><tbody><tr><td> Liposomengrößen </td><td> Nachweisgrenze </td><td> Erwartete minimale Partikelgröße (nm) </td></tr><tr><td> 30 nm </td><td> 11 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 100 nm </td><td> 11 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 400 nm </td><td> 21 </td><td> 400 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. NanoSight Parameter. ad/4151/4151fig1.jpg &quot;/&gt; 1. Flussdiagramm der Extrusionsverfahren, die beschreiben, wie der Druck und Stickstoffstrom steuert die Homogenität der verschiedenen Liposom Durchmesser. Im Anschluss an Liposomen Flüssigkeitszufuhr, sind unilamellare Vesikel verschiedener Größe durch verschiedene Polycarbonat-Membranfilter Poren mit unterschiedlichem Druck extrudiert. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig2.jpg" /> Abbildung 2. Dynamische Lichtstreuung (DLS) Daten zur Beschreibung der quantitativen Größen Liposomen nach der Extrusion. (A) Balkendiagramme gezeigt, um die Durchmesser der drei Liposom Beispiele beschreiben. Ein Kalibrierstandard von 50 nm Polystyrol (PS)-Kügelchen wurde als Referenz verwendet. Die durchschnittlichen Liposomen Durchmesser werden über der Bar für jede Probe angegeben. Die x-Achse beschreibt die Porengrößen von denen die Lösungen wurden extrudiert durch. Die y-Achse beschreibt den Durchmesser von DLS aufgezeichnet. Obwohl die 30 nm und 100 nm Größen EintragED-Werte höher als die Porengröße, während die größere Größe 400 nm aufgezeichnet eine etwas geringere Größe, zeigt die Eichkurve (b) eine nahezu lineare Korrelation, wobei die x-Achse drückt die Polycarbonatmembran Porengrößen und die y-Achse beschreibt die aufgezeichnet Liposomendurchmesser durch DLS. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig3.jpg" /> Abbildung 3. Nanopartikel Tracking-Analyse (NTA) Daten zur Beschreibung der Liposomen-Größen nach der Extrusion. (A) Die Balkendiagramme stellen den Durchmesser jedes Liposom Probe. Die x-Achse beschreibt die Porengrößen von denen die Lösungen wurden extrudiert durch. Die y-Achse beschreibt die Größe Durchmesser durch die NTA aufgezeichnet. Die mittlere Liposomen Durchmessern übereinander Probe markiert. (B) Die NTA Eichkurve zeigt eine lineare Korrelation als der DLS Eichkurve zwischen den Filtermembran Porengrößen gegenüber dem Durchmesser aufgenommen. Die x-Achse beschreibt die Polycarbonatmembran Porengrößen. Die y-Achse beschreibt die aufgezeichneten Liposomendurchmesser NTA. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig4.jpg" /> Abbildung 4. Negativ Fleck Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)-Aufnahmen zeigen jeweils Liposomengröße (500 um) extrudiert. Carbon-Mesh-Gitter wurden Formvar negativ vor der Färbung Probe entlassen, wo 1% Uranylacetat in Wasser verwendet wurde, um die Proben vor dem Trocknen und Bildgebung bei 34.000-facher Vergrößerung zu färben. Größe 30, 100 und 400 nm deutlich voneinander unterscheiden. Die Vergrößerung wurde zu 25.000 × gesetzt. Der Maßstab entspricht 0,5 um. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig5.jpg" /> Abbildung 5. Ein Zeit-Gänge-Versuch wurde mit drei Größen Liposomen durchgeführt. Die dynamische Lichtstreuung (DLS) wurde für jede Liposomen-Lösung unmittelbar nach der Extrusion gemessen. Alle Lösungen wurden in Liposomen 4 °C über Nacht. Die Durchmesser wurden von den DLS nach Inkubation über Nacht aufgezeichnet. Wenig bis gar keine Veränderung wurde nach einer 16-stündigen Inkubationszeit beobachtet.

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	<li>Connor, J., Bucana, C., Fidler, I. J., Schroit, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation-dependent+expression+of+phosphatidylserine+in+mammalian+plasma+membranes:+quantitative+assessment+of+outer-leaflet+lipid+by+prothrombinase+complex+formation.">Differentiation-dependent expression of phosphatidylserine in mammalian plasma membranes: quantitative assessment of outer-leaflet lipid by prothrombinase complex formation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 3184-3188 (1989).</li><li>Smith, S. A., Morrissey, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+incorporation+of+tissue+factor+into+liposomes.">Rapid and efficient incorporation of tissue factor into liposomes.</a> J. Thromb. Haemost. 2, 1155-1162 (2004).</li><li>Hui, E., Johnson, C. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrusion+technique+to+generate+liposomes+of+defined+size.">Extrusion technique to generate liposomes of defined size.</a> Methods Enzymol. 367, 3-14 (2003).</li><li>Gruner, S. M., Cullis, P. R., Hope, M. J., Tilcock, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+polymorphism:+the+molecular+basis+of+nonbilayer+phases.">Lipid polymorphism: the molecular basis of nonbilayer phases.</a> Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 14, 211-238 (1985).</li><li>Guven, A., Ortiz, M., Constanti, M., O'Sullivan, C. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+extrusion+pressure+and+lipid+properties+on+the+size+and+polydispersity+of+lipid+vesicles.">Effect of extrusion pressure and lipid properties on the size and polydispersity of lipid vesicles.</a> Biophys J. 74, 2996-3002 (1998).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Verwenden des Avestin LiposoFast LF-50 Extruder, haben wir gezeigt, wie kleine, synthetischen Liposomen durch ein druckgesteuertes System hergestellt. Es ist wichtig zu beachten, dass multilamellare Vesikel spontan nach Liposom Hydratisierung, die Herstellung von kleineren Nanopartikel führen kann. Diese kleinen multilamellare Vesikel wird unweigerlich durch die größere Polycarbonat-Membran Porengröße fließen, wodurch Heterogenität in Lösungen von einschichtigen Vesikeln durch eine große Filterporengröße prod...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Chloroform </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 02432-25ML </td><td> 95% Stabilisatoren </td></tr><tr><td> High Grade Methanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 179.337-4L </td><td></td></tr><tr><td> LiposoFast LF-50 Extruder </td><td> Avestin, Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Phospholipide </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Polycarbonat Poren </td><td> Avestin, Inc. </td><td></td><td> 25 mm Durchmesser </td></tr><tr><td> Lassen Sie Discs PE </td><td> Avestin, Inc. </td><td> 230600 </td><td> 25 mm Durchmesser </td></tr></tbody></table>

constant pressure-controlled extrusion method for the preparation of nano-sized lipid vesicles

Liposomen sind künstlich hergestellte Vesikel aus natürlichen und synthetischen Phospholipiden, die weithin als eine Zellmembran imitiert Plattform, um Protein-Protein und Protein-Lipid-Wechselwirkungen 3, Drug-Delivery-Monitor 4,5 und 4 studierst Einkapselung verwendet werden. Phospholipide natürlich erstellen gebogene Lipid-Doppelschichten und zeichnet sich aus einer Micelle. 6 Liposomen werden traditionell von Größe und Anzahl der Doppelschichten, dh große unilamellare Vesikel (LUV), kleine einschichtige Vesikel (SUVs) und multilamellare Vesikel (MLV) 7 eingestuft. Insbesondere ist die Herstellung von homogenen Liposomen in verschiedenen Größen für das Studium Membrankrümmung, die eine wichtige Rolle bei der zellulären Signalübertragung, Endo-und Exozytose, Membranfusion und Proteintransport 8 wichtig. Mehrere Gruppen analysieren, wie sich Proteine ​​verwendet werden, zu modulieren Prozesse, die Membrankrümmung einzubeziehen und somit vorbereiten Liposomen mit Durchmessern &lt;100 bis 400nm bis ihr Verhalten auf Zellfunktionen 3 studierst. Andere konzentrieren sich auf Liposom-Arzneistoff-Verkapselung, Studium Liposomen als Vehikel zu transportieren und liefern ein Medikament von Interesse 9. Drug-Kapselung erreicht wie während Liposomenbildung 9 gemeldet werden. Unsere Extrusionsschritt sollte nicht die verkapselten Wirkstoffs aus zwei Gründen, dh sie sollten (1) Wirkstoffverkapselung vor diesem Schritt erreicht werden und (2) Liposomen sollten ihrer natürlichen biophysikalischen und formstabil bleibt, sicher trägt das Arzneimittel im wässrigen Kern. Diese Forschungsergebnisse legen nahe, weitere Ziele die Notwendigkeit für eine optimierte Methode, um eine stabile Sub-Mikrometer-Lipidvesikel zu entwerfen. Dennoch weisen die aktuellen Liposomenzubereitung Technologien (Beschallung 10, Frost-und Tauwetter-10, Sedimentation) nicht zulassen, Herstellung von Liposomen mit stark gekrümmten Oberfläche (dh Durchmesser &lt;100 nm) mit hoher Konsistenz und Effizienz 10,5, die der physischen Begrenztheit Studien eines Emerging Bereich der Membrankrümmung Fernerkundung. Hier präsentieren wir eine robuste Herstellungsmethode für eine Vielzahl von biologisch relevanten Liposomen. Manuelle Extrusion unter Verwendung gasdichte Spritzen und Polycarbonatmembranen 10,5 ist eine gängige Praxis, aber Heterogenität wird oft beobachtet, wenn mit Porengrößen &lt;100 nm aufgrund aufgrund der Variabilität der manuellen Druck aufgebracht. Wir verwendeten einen konstanten Druck-gesteuerten Extrusionsvorrichtung, um synthetischen Liposomen, deren Durchmesser im Bereich zwischen 30 und 400 nm herzustellen. Die dynamische Lichtstreuung (DLS) 10, 11 und Elektronenmikroskopie Nanopartikel Tracking-Analyse (NTA) 12 wurden verwendet, um die Liposomen-Größen zu quantifizieren, wie in unserem Protokoll beschrieben, mit kommerziellen Polystyrol (PS) Perlen als Kalibrier-Standard verwendet. Eine nahezu lineare Korrelation zwischen der verwendeten Porengrößen und der experimentell bestimmten Liposomen beobachtet, was eine hohe Wiedergabetreue der druckgesteuerten Liposomenpräparation erfüllthod. Ferner haben wir gezeigt, dass diese Lipidvesikel Herstellungsverfahren allgemein anwendbar, unabhängig von verschiedenen Größen Liposom ist. Schließlich haben wir auch in einem zeitlichen Verlauf Studie zeigte, dass diese vorbereiteten Liposomen stabil waren für bis zu 16 Stunden. Ein Vertreter in Nano-Größe Liposomenzubereitung Protokoll wird unter Beweis gestellt.

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Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Dieses Protokoll beschreibt ein Extrusionsverfahren zur Herstellung Lipidvesikel von Submikrometer-Abmessungen mit einem hohen Grad an Homogenität. Dieses Verfahren verwendet eine Druck-Steuerung mit gesteuerten Stickstoff Flussraten für Liposomenpräparation. Die Lipid-Vorbereitung<sup&gt; 1,2</sup&gt;, Wird Liposomen Extrusion, Größe und Charakterisierung Beispiele vorgestellt werden.

Constant Pressure-gesteuerte Extrusionsverfahren zur Herstellung von Nano-Größe Lipidvesikeln

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

23.8K Aufrufe.  University of Colorado Boulder. Dieses Protokoll beschreibt ein Extrusionsverfahren zur Herstellung Lipidvesikel von Submikrometer-Abmessungen mit einem hohen Grad an Homogenität. Dieses Verfahren verwendet eine Druck-Steuerung mit gesteuerten Stickstoff Flussraten für Liposomenpräparation. Die Lipid-Vorbereitung 1,2, Wird Liposomen Extrusion, Größe und Charakterisierung Beispiele vorgestellt werden.

Serie: Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Verbesserte Methode zur Präparation einer menschlichen Zelle-basierte, Kontakt Modell der Blut-Hirn-Schranke

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Forschung

Biotechnik

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. Clinically, this protein is widely used for cosmetic surgery, dermal injections, bone grafting, and reconstructive surgery. The sources of COL1 for these procedures are commonly nonhuman, which increases the potential for inflammation and rejection as well as xenobiotic disease transmission. In view of this, a method to efficiently and quickly purify COL1 from limited quantities of autologously-derived tissues would circumvent many of these issues; however, standard isolation protocols are lengthy and often require large quantities of collagenous tissues. Here, we demonstrate an efficient COL1 extraction method that reduces the time needed to isolate and purify this protein from about 10 days to less than 3 hr. We chose the dermis as our tissue source because of its availability during many surgical procedures. This method uses traditional extraction buffers combined with forceful agitation and centrifugal filtration to obtain highly-pure, soluble COL1 from small amounts of corium. Briefly, dermal biopsies are washed thoroughly in ice-cold dH2O after removing fat, connective tissue, and hair. The skin samples are stripped of noncollagenous proteins and polysaccharides using 0.5 M sodium acetate and a high speed bench-top homogenizer. Collagen from residual solids is subsequently extracted with a 0.075 M sodium citrate buffer using the homogenizer. These extracts are purified using 100,000 MW cut-off centrifugal filters that yield COL1 preparations of comparable or superior quality to commercial products or those obtained using traditional procedures. We anticipate this method will facilitate the utilization of autologously-derived COL1 for a multitude of research and clinical applications.

Traditional procedures for the isolation of soluble type 1 collagen (COL1) require about 10 days from start to finish because of lengthy buffer incubations and laborious resuspensions of fibrils. Here, we describe a means to purify COL1 from small dermal biopsies in less than 3 hr.

Ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Typ I-Kollagen aus der Haut

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This emerging field engages engineers, chemists, biologists, and physicists to design and assemble basic biological components into complex, functioning systems from the bottom up. Such bottom-up systems could lead to the development of artificial cells for fundamental biological inquiries and innovative therapies1,2. Giant unilamellar vesicles (GUVs) can serve as a model platform for synthetic biology due to their cell-like membrane structure and size. Microfluidic jetting, or microjetting, is a technique that allows for the generation of GUVs with controlled size, membrane composition, transmembrane protein incorporation, and encapsulation3. The basic principle of this method is the use of multiple, high-frequency fluid pulses generated by a piezo-actuated inkjet device to deform a suspended lipid bilayer into a GUV. The process is akin to blowing soap bubbles from a soap film. By varying the composition of the jetted solution, the composition of the encompassing solution, and/or the components included in the bilayer, researchers can apply this technique to create customized vesicles. This paper describes the procedure to generate simple vesicles from a droplet interface bilayer by microjetting.

Microfluidic jetting against a droplet interface lipid bilayer provides a reliable way to generate vesicles with control over membrane asymmetry, incorporation of transmembrane proteins, and encapsulation of material. This technique can be applied to study a variety of biological systems where compartmentalized biomolecules are desired.

Lipiddoppelschicht Vesicle Erzeugung anhand Mikrofluidik Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Herstellung von Mica Unterstützte Lipiddoppelschichten für Hochauflösende Optische Mikroskopie Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

Biomembran Fabrication durch das Lösungsmittel-unterstützten Lipiddoppelschicht (SALB) Methode

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

Feste Lipidnanopartikel (SLN) für die intrazelluläre Targeting-Anwendungen

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Film Extrusion of Crambe abyssinica/Wheat Gluten Blends

Crambe abyssinica is a plant with potential for use in industrial (non-food) plant oil production. The side stream from this oil production is a high-protein crambe meal that has limited value, as it is not fit for food or feed use. However, it contains proteins that could potentially make it a suitable raw material for higher-value products. The purpose of this study was to find methods of making this side stream into extruded films, showing that products with a higher value can be produced. The study mainly considered the development of material compositions and methods of preparing and extruding the material. Wheat gluten was added as a supportive protein matrix material, together with glycerol as a plasticizer and urea as a denaturant. The extrudate was evaluated with respect to mechanical (tensile testing) and oxygen barrier properties, and the extrudate structure was revealed visually and by scanning electron microscopy. A denser, more homogeneous material had a lower oxygen transmission rate, higher strength, and higher extensibility. The most homogeneous films were made at an extruder die temperature of 125-130 &#176;C. It is shown here that a film can be extruded with promising mechanical and oxygen barrier properties, the latter especially after a final compression molding step.

Film Extrusion of Crambe abyssinica/Wheat Gluten Blends

The side stream from plant oil production of Crambe abyssinica has limited value. The purpose of this study was to find methods for extruding materials based on this side stream, demonstrating that products with a higher value can be produced. The extrudates were found to have promising properties.

Folienextrusion von<em&gt; Krambe</em&gt; / Weizen-Gluten-Mischungen

Crambe abyssinica is a plant with potential for use in industrial (non-food) plant oil production. The side stream from this oil production is a ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical development, not only their pharmaceutical activity is important but also their production needs to be evaluated. In this context, research focuses on the isolation of EVs, their characterization, and their storage. The present manuscript aims at providing a facile procedure for the assessment of the effect of different storage conditions on EVs, without genetic manipulation or specific functional assays. This makes it possible to quickly get a first impression of the stability of EVs under a given storage condition, and EVs derived from different cell sources can be compared easily. The stability measurement is based on the physicochemical parameters of the EVs (size, particle concentration, and morphology) and the preservation of the activity of their cargo. The latter is assessed by the saponin-mediated encapsulation of the enzyme beta-glucuronidase into the EVs. Glucuronidase acts as a surrogate and allows for an easy quantification via the cleavage of a fluorescent reporter molecule. The present protocol could be a tool for researchers in the search for storage conditions that optimally retain EV properties to advance EV research toward clinical application.

Here we present a readily applicable protocol to assess the storage stability of extracellular vesicles, a group of naturally occurring nanoparticles produced by cells. The vesicles are loaded with glucuronidase as a model enzyme and stored under different conditions. After storage, their physicochemical parameters and the activity of the encapsulated enzyme are evaluated.

Bewertung der Speicherstabilität von extrakellulären Bläschen

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

Gleichzeitige Quantifizierung ausgewählter Kynurenine, analysiert durch Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure single-molecular binding kinetics, assess mechanical properties of ligand-receptor interactions, visualize protein dynamic conformational changes and more excitingly elucidate receptor mediated cell mechanosensing mechanisms. More recently, BFP has been used to measure the spring constant of molecular bonds. This protocol describes the step-by-step procedure to perform molecular spring constant DFS analysis. Specifically, two BFP operation modes are discussed, namely the Bead-Cell and Bead-Bead modes. This protocol focuses on deriving spring constants of the molecular bond and cell from DFS raw data.

A biomembrane force probe (BFP) is an in situ dynamic force spectroscopy (DFS) technique. BFP can be used to measure the spring constant of molecular interactions on living cells. This protocol presents spring constant analysis for molecular bonds detected by BFP.

Molekulare Federkonstantenanalyse mittels Biomembran-Kraftsondenspektroskopie

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure ...