עבודה זו נתמכה על ידי הווארד יוז רפואי במכון (HHMI) בפרס חדשנות שיתופית. לאם נתמך על ידי איתות נייד תקנה המכון הלאומי לבריאות אימון מענק (T32 GM008759) ואת רות NIH ל Kirschstein קדם דוקטורט (CA165349-01). אנו רוצים להודות פרופ &#39;מיכאל Stowell (CU Boulder), פרופ&#39; דאגלס ריס ופרופ &#39;רוב פיליפס (קלטק) להערות יסולא בפז שלהם.

1. Liposome הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחזור בקבוקון 20 מ&quot;ל עם מכסה זכוכית מצופה טפלון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לנקות את כל כלי זכוכית מזרקים עם כלורופורם לפני השימוש כדי למנוע זיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 100 μL של כלורופורם כיתה מגיב על בקבוקון זכוכית באמצעות מזרק 250 μL אוויר חזק זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 30 μL של מתנול כיתה מגיב על בקבוקון זכוכית אותו באמצעות מזרק 100 μL אוויר חזק זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין 2 7:1.5:1.5 mM phosphatidylcholine (POPC): phosphatidylethanolamine (האפיפיור): פתרון שומנים וכולסטרול, להעביר 216 μL של 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​POPC, 42 μL של μL מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​האפיפיור 20 10 של 11 מ&quot;ג / מ&quot;ל פתרונות הכולסטרול CHCl 3 עד 20 מ&quot;ל בקבוקון זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאדות את ממיסים אורגניים באמצעות איטי זרימת ארגון או גז חנקן עד שכבה דקה של שומנים הוא ציין בתחתית בקבוקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את בקבוקון זכוכית כיפה בתוך תא ייבוש ואקום לפחות 30 דקות להסיר ממס שיורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TRansfer 2 מ&quot;ל של המאגר, עברה בעבר דרך 0.2 מיקרון המסנן, כדי בקבוקון זכוכית מימה את השומנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את התערובת על 4 מעלות צלזיוס במשך הלילה ולהשתמש תוך 48 שעות. </li></ol> 2. Freeze-and-הפשרה: עבור גדלים liposome של 30 - 100 ננומטר בלבד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא את ההשעיה liposome בחנקן נוזלי למשך 15 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר ההשעיה liposome באמצעות אבן חימום על 42 מעלות צלזיוס בטמפרטורה של ~ 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.1 ו -2.2 עבור סכום כולל של 5 מחזורים. </li></ol> 3. שחול בצע את ההוראות Avestin כראוי להרכיב extruder Liposofast LF-50, באמצעות מכשיר מתאר בספר המדריך שלהם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את חור גדול תמיכה המסך (עם חורים עגולים) בבסיס התמיכה מסנן, ואחריה המנה sintered עגול (בלי חורים), 1 דיסק הניקוז (25 מ&quot;מ קוטר), ואחד פוליקרבונט קרום (25 מ&quot;מ קוטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את קטן, שחורO-טבעת על גבי הממברנה על מנת לאבטח אותו לבסיס תמיכה הסינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף extruder מסנן למעלה הידוק 4 ברגים ב 4 חורים המתאימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את יחידת extruder מסנן מתחת לחבית מכבש גדול. מוסיפים את הפתרון liposome כדי לחבית גליל. מניחים את הפעולות הבאות על גבי חבית שיחול על מנת: עגול גדול O-טבעת, כובע צר, גדול עגול O-טבעת, כובע עגול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף הרגולטור גז לראש לחבית extruder וסגור את כל השסתומים כדי למנוע דליפת אוויר, כולל שסתום הקלה בלחץ. מניחים צנצנת זכוכית 20 מ&quot;ל או 50 מ&quot;ל בבקבוק Erlenmeyer תחת יחידת extruder הסינון. שסתום הבטיחות מחובר הרגולטור ואת תשחרר אם הלחץ עולה על 600 psi. הפעלת גז חנקן לפתוח את שסתום הגז מחובר extruder. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר את הלחץ חנקן ל -25 PSI ל 400 ננומטר, ליפוזומים 125 תע&quot;ח של 100 ננומטר, ליפוזומים ו תע&quot;ח 400-500 עבור 30 ננומטר ליפוזומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצפות לכל חש liposomeension כפי שהוא פולט לתוך המיכל תוך נדחף על ידי חנקן. שמור חנקן זורם עד שאתה כבר לא צופים כל עובר הנוזל דרך פילטר extruder לתוך בקבוקון זכוכית. </li></ol> 4. פיזור אור דינאמי (DLS) ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 μL של פתרון liposome 20 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מקור הכוח מקור המנורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנת DynaPro. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר את התוכנה למודל MS / X האלגוריתם לזהות ליפוזומים של 30 ננומטר ו -100 ננומטר MS800 מודל אלגוריתם לזיהוי&gt; 100 ליפוזומים ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיבור החומרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 14 Pipet μL המדגם liposome אל קובט הוספה קוורץ לתוך המחזק את התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על התחל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ להפסיק אחרי ~ 20 - 30 רכישות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח הפסגות הממוצע בקוטר liposome שנרשמו על ההיסטוגרמה. </li></ol> 5. Nanoparticle מעקב וניתוח (נ.ת. ע) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן μL 500, 0.1 מיקרומטר liposomeפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את תא המדגם עם מים ואתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבש את תא מדגם במגבת נטולת מוך נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מקור לייזר כוח המחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספק 300 μL של פתרון 0.1 מיקרומטר liposome לתא המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את בקרת טמפרטורה Nanoparticle מעקב תוכנת ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ לכידת כדי להפעיל את הלייזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש התאמות אופקיים ואנכיים לעבור לשלב ולהתאים את המיקוד מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את הטמפרטורה הרצויה (20 מעלות) וזמן ההקלטה (לפחות 30 שניות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחצו על כפתור ההקלטה לקחת מסגרות של תמונות רבות של חלקיקים liposome עבור כמות מוגדרת של זמן. לנתח את פסגות המתאימים גדלים liposome בקוטר על ההיסטוגרמה כפי שהוא עוקב אחר התנועה של כל חלקיק. </li></ol> 6. נציג תוצאות תכנית מתאר שיטה שחול הוא pהתרעם באיור 1. כדי להשיג תוצאות אופטימליות, הכנת ליפוזומים עם קוטר של 30 ננומטר דורש לחץ גבוה של ~ 500 psi ו בקטרים ​​של 100 ננומטר דורש הלחץ של 125 psi להשיג קצב הסינון מהירה. עבור קוטר של 400 ננומטר, לחץ נמוך של 25 PSI ~ מומלץ להשיג שיעור הסינון איטי יותר, המאפשר להאריך את שלפוחית ​​ויוצרים גדולים יותר, ליפוזומים הומוגניות. ערכנו סדרת ניסויים כדי לקבוע את הלחץ האופטימלי להפקת עקביות מיקרון משנה גודל שלפוחית. אנחנו מגוונים את הלחץ, כמו גם את מספר שחול עובר דרך מסננים פוליקרבונט עם הגדלים הנקבוביות של 30, 100, ו -400 ננומטר וגילה הלחץ המתאים לכל גודל רצוי. במשך 30 ננומטר הנקבוביות, לחץ להלן 500 psi יקטין את קצב הזרימה, גרימת התארכות וגדלים שלפוחית ​​ובכך גדולים יותר. עבור 100 ננומטר הנקבוביות, זרם קבוע הושגה ב 125 psi. עבור 400 ננומטר הנקבוביות, בלחץ נמוך (25 psi) מאפשר שלפוחית ​​כדי להאריך לתוך שלפוחית ​​גדולה יותר שלizes. זרימה איטית ירידה מבחינת סינון רצוי ליצור יותר משנה מיקרון שלפוחית ​​13. ביצענו DLS כדי לקבוע את גודל liposome משוחלים דרך בשלוש מידות קוטר שונות, כלומר 30, 100 ו -400 ננומטר. DLS היא שיטה הוקמה שאוסף אור מפוזרות כדי לקבוע את קוטר החלקיקים. אנחנו ליפוזומים hydrated משוחלים של 2 מ&quot;מ דרך הממברנה פוליקרבונט 30 ננומטר ב 500 psi עם 5 עובר דרך נקבוביות המסנן: 100 ננומטר פוליקרבונט קרום על 125 psi עם 5 עובר דרך נקבוביות המסנן 400 ננומטר קרום פוליקרבונט ב 25 psi עם 2 עובר דרך הנקבוביות את המסנן. את קוטר של ליפוזומים ומדד ידי DLS עבור 30, 100 ו 400 ננומטר גודל הנקבוביות היו 66 ± 28, 138 ± 18 360 ± 25 ננומטר (איור 2). ההשעיה של 50 ננומטר חרוזי פוליסטירן שימש תקן כיול כפי שמוצג באיור 2, שם נרשם קוטר של 47 ± 16 nm. Polydispe אחוזיםrsity מראה כי אין חפיפה בתוך בגדלים liposome. זה אופייני לצפות בקטרים ​​גבוהים יותר מ -30 ננומטר, כאשר באמצעות ניתוח DLS בשל הטיה ידועה המכשיר הזה יש חלקיקים גדולים יותר לכיוון 12. עוצמות ופיזור אור מכדור חלקיקים גדולים וקטנים נאספים בו זמנית משיטה אחת זיהוי ולכן קשה יותר לפתור ליפוזומים בתרחיף 12. למרות מגבלה זו סייעה, עקומת כיול מתאר קשר לינארי הקרוב. נ.ת. ע היא טכנולוגיה חדשה אשר מודד את הגודל של כל חלקיק מן התצפיות הישירות של דיפוזיה בתווך נוזלי, עצמאית של מדד החלקיקים השבירה או צפיפות. טכניקה זו ברזולוציה גבוהה יכול לשמש כדי להשלים את המדידה של ליפוזומים עם DLS. נ.ת. ע רשם קוטר של 95 ± 48 ו - 356 ± 51 ננומטר, שני 100 ננומטר ו -400 ננומטר פוליסטירן פתרונות שימשו לצורך כיול. בתמיסות של 30 ננומטר ו -100 ננומטר נצפו להיות comp יותר<html> קוטר לעיבוד יחסית DLS כפי שמוצג באיור 3, ייצור בגדלים ממוצעים של 29 ± 14, 95 ו - 17 ± 359 ± 73 ננומטר. נ.ת. ע עשוי להיות טכניקה אפיון כללי יותר לכמת חלקיקים מיקרוסקופיים מאז הרגישות שלה מאפשרת לה למדוד חלקיקים של 50 - 1000 ננומטר. עקומת הכיול מראה קשר לינארי בין נקבוביות הממברנה פוליקרבונט לעומת בקוטר נ.ת. ע מוקלט. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Liposome גדלים </td><td> זיהוי סף </td><td> צפוי החלקיקים מינימום גודל (ננומטר) </td></tr><tr><td> 30 ננומטר </td><td> 11 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 100 ננומטר </td><td> 11 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 400 nm </td><td> 21 </td><td> 400 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. פרמטרים NanoSight. ad/4151/4151fig1.jpg &quot;/&gt; באיור 1. תרשים זרימה של השיטה שחול, המתאר כיצד הלחץ ואת זרימת החנקן שולט ההומוגניות של קטרים ​​liposome שונים. לאחר הידרציה liposome, שלפוחית ​​unilamellar בגדלים שונים נמתחים דרך שונים פוליקרבונט נקבוביות הממברנה הסינון בלחצים שונים. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig2.jpg" /> איור 2. דינמי פיזור אור (DLS) נתונים המתארים את גודל liposome כמותיים לאחר שחול. (א) גרפים בר מוצגים לתאר את קוטר של שלוש דגימות liposome. סטנדרט כיול של 50 ננומטר פוליסטירן (PS) חרוזים שימש כנקודת התייחסות. בקטרים ​​את liposome הממוצע מסומנים מעל שורת עבור מדגם זה. ציר X מתאר את גודל הנקבוביות אשר הפתרונות היו extruded דרך. ציר y מתאר את קוטר נרשם על ידי DLS. למרות 30 ננומטר ו 100 בגדלים שיא ננומטראד ערכים גבוהים יותר מאשר גודל הנקבוביות שלהם בזמן גדול יותר בגודל 400 ננומטר רשמה בגודל מעט נמוך יותר, עקומת כיול (ב) מציג קשר לינארי הקרוב, שבו ציר x מבטא את נקבוביות הממברנה גדלים פוליקרבונט, ואת ציר y מתאר רשמה בקוטר liposome על ידי DLS. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig3.jpg" /> 3. איור Nanoparticle מעקב ניתוח (נ.ת. ע) נתונים המתארים את גודל liposome לאחר שחול. (א) גרפים בר לייצג את הקוטר של מדגם זה liposome. ציר X מתאר את גודל הנקבוביות אשר הפתרונות היו extruded דרך. ציר y מתאר את קוטר גודל נרשם על ידי נ.ת. ע. בקטרים ​​את liposome הממוצע מסומנים מעל מדגם זה. (ב) עקומת כיול נ.ת. ע מראה קורלציה ליניארית יותר עקומת כיול DLS בין הנקבובית גדלים סינון הממברנה לעומת בקוטר מוקלט. ציר X מתאר את נקבוביות הממברנה גדלים פוליקרבונט. ציר y מתאר את קוטר liposome נרשם על ידי נ.ת. ע. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig4.jpg" /> איור 4. שליליות כתם במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) תמונות המציגות כל אחת בגודל liposome (500 מיקרומטר) ואחריו שחול. פחמן Formvar רשתות רשת שוחררו לרעה לפני מכתים המדגם, שם אצטט Uranyl 1% במים נעשה שימוש כדי להכתים את דגימות לפני ייבוש הדמיה בהגדלה 34000 ×. מידות 30, 100, ו -400 ננומטר הם בבירור ברורה זה מזה. ההגדלה נקבע × 25000. בר מייצגת בהיקף 0.5 מיקרומטר. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig5.jpg" /> איור 5. הניסוי בזמן הקורס נערך עם שלושה גדלים liposome. פיזור אור דינאמי (DLS) נמדד עבור כל פתרון liposome שחול הבאה מיד. כל פתרונות liposome אוחסנו 4 °ג לילה. בקטרים ​​שלהם נרשמו על ידי DLS לאחר הדגירה לילה. קצת שינוי לא נצפתה לאחר תקופה 16 שעות דגירה.

<ol>
	<li>Connor, J., Bucana, C., Fidler, I. J., Schroit, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation-dependent+expression+of+phosphatidylserine+in+mammalian+plasma+membranes:+quantitative+assessment+of+outer-leaflet+lipid+by+prothrombinase+complex+formation.">Differentiation-dependent expression of phosphatidylserine in mammalian plasma membranes: quantitative assessment of outer-leaflet lipid by prothrombinase complex formation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 3184-3188 (1989).</li><li>Smith, S. A., Morrissey, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+incorporation+of+tissue+factor+into+liposomes.">Rapid and efficient incorporation of tissue factor into liposomes.</a> J. Thromb. Haemost. 2, 1155-1162 (2004).</li><li>Hui, E., Johnson, C. P., Yao, J., Dunning, F. M., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptotagmin-mediated+bending+of+the+target+membrane+is+a+critical+step+in+Ca(2+)-regulated+fusion.">Synaptotagmin-mediated bending of the target membrane is a critical step in Ca(2+)-regulated fusion.</a> Cell. 138, 709-721 (2009).</li><li>Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+procedures+for+the+coupling+of+proteins+to+liposomes.">Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes.</a> J. Immunol. Methods. 132, 25-35 (1990).</li><li>Mui, B., Chow, L., Hope, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrusion+technique+to+generate+liposomes+of+defined+size.">Extrusion technique to generate liposomes of defined size.</a> Methods Enzymol. 367, 3-14 (2003).</li><li>Gruner, S. M., Cullis, P. R., Hope, M. J., Tilcock, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+polymorphism:+the+molecular+basis+of+nonbilayer+phases.">Lipid polymorphism: the molecular basis of nonbilayer phases.</a> Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 14, 211-238 (1985).</li><li>Guven, A., Ortiz, M., Constanti, M., O'Sullivan, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+method+for+the+size+separation+of+homogeneous+fluorescein-encapsulating+liposomes.">Rapid and efficient method for the size separation of homogeneous fluorescein-encapsulating liposomes.</a> J. Liposome. Res. 19, 148-154 (2009).</li><li>Zimmerberg, J., Kozlov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+proteins+produce+cellular+membrane+curvature.">How proteins produce cellular membrane curvature.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 9-19 (2006).</li><li>Chonn, A., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+liposomal+drug-delivery+systems.">Recent advances in liposomal drug-delivery systems.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 6, 698-708 (1995).</li><li>Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicles+of+variable+sizes+produced+by+a+rapid+extrusion+procedure.">Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure.</a> Biochim. Biophys. Acta. 858, 161-168 (1986).</li><li>Matsuoka, K., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+liposomes+to+study+COPII-+and+COPI-coated+vesicle+formation+and+membrane+protein+sorting.">The use of liposomes to study COPII- and COPI-coated vesicle formation and membrane protein sorting.</a> Methods. 20, 417-428 (2001).</li><li>Dragovic, R. A., Gardiner, C., Brooks, A. S., Tannetta, D. S., Ferguson, D., Hole, P., Carr, B., Redman, C., Harris, A. L., Dobson, P. J., Harrison, P., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine. , (2011).</li><li>Hunter, D. G., Frisken, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+extrusion+pressure+and+lipid+properties+on+the+size+and+polydispersity+of+lipid+vesicles.">Effect of extrusion pressure and lipid properties on the size and polydispersity of lipid vesicles.</a> Biophys J. 74, 2996-3002 (1998).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

שימוש Liposofast Avestin LF-50 extruder, הראינו עד כמה קטן בגודל, ליפוזומים מלאכותיים מוכנים באמצעות מערכת לחץ מבוקר. חשוב לציין כי שלפוחית ​​multilamellar ליצור באופן ספונטני לאחר הידרציה liposome, מה שעשוי להוביל לייצור של חלקיקים קטנים יותר. אלו שלפוחיות קטנות multilamellar בהכרח לזרום גודל גד?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> כלורופורם </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 02432-25ML </td><td> 95% מייצבים </td></tr><tr><td> מתנול ציון גבוה </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 179337-4L </td><td></td></tr><tr><td> Extruder Liposofast LF-50 </td><td> Avestin, Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> פוספוליפידים </td><td> AVANTI ליפידים פולאר </td><td></td><td></td></tr><tr><td> פוליקרבונט הנקבוביות </td><td> Avestin, Inc </td><td></td><td> 25 מ&quot;מ קוטר </td></tr><tr><td> מסננים דיסקים PE </td><td> Avestin, Inc </td><td> 230600 </td><td> 25 מ&quot;מ קוטר </td></tr></tbody></table>

constant pressure-controlled extrusion method for the preparation of nano-sized lipid vesicles

ליפוזומים הם בועיות שהוכנו באופן מלאכותי המורכב פוספוליפידים טבעיים וסינתטיים הנמצאים בשימוש נרחב כמו קרום התא מחקה פלטפורמת ללמוד חלבונים חלבונים חלבונים שומנים בדם אינטראקציות 3, משלוח צג התרופה 4,5, ו 4 אנקפסולציה. פוספוליפידים באופן טבעי ליצור bilayers השומנים מעוקלים, להבדיל את עצמו מן micelle. 6 ליפוזומים מסווגים באופן מסורתי על ידי גודל ומספר bilayers, כלומר שלפוחית ​​unilamellar גדולות (&#39;לאב&#39;), שלפוחית ​​unilamellar קטנים (רכבי השטח) ואת שלפוחית ​​multilamellar (MLVs) 7. בפרט, הכנת ליפוזומים הומוגניות בגדלים שונים, חשוב ללמוד עקמומיות קרום זה ממלא תפקיד חיוני איתות התא, אנדו ו-exocytosis, איחוי קרום, וסחר חלבון 8. מספר קבוצות לנתח כיצד חלבונים משמשים לווסת את התהליכים הכרוכים עקמומיות הממברנה ובכך להכין ליפוזומים בקטרים ​​של פחות מ -100 - 400ננומטר ללמוד את ההתנהגות שלהם על פונקציות התא 3. אחרים מתמקדים אנקפסולציה liposome תרופות, לומד ליפוזומים כלי רכב לבצע ולספק סמים עניין 9. אנקפסולציה התרופה ניתן להשיג כפי שדווח במהלך היווצרות liposome 9. צעד שחול שלנו לא אמור להשפיע על התרופה Encapsulated משתי סיבות, כלומר (1) אנקפסולציה התרופה צריכה להיות מושגת לפני השלב הזה (2) ליפוזומים צריך לשמור על יציבות biophysical הטבעי שלהם, באופן מאובטח נושאת את התרופה הליבה מימית. מטרות אלה מחקר נוסף מצביעים על הצורך שיטת אופטימיזציה לעצב יציבים מיקרון משנה שלפוחית ​​השומנים. עם זאת, הטכנולוגיות הנוכחיות הכנה liposome (sonication 10, הקפאת-and-ההפשרה 10, שקיעה) לא מאפשרים הכנה של ליפוזומים עם משטח עקום מאוד (כלומר &lt;בקוטר 100 ננומטר) עם עקביות יעילות גבוהה 10,5, אשר מגביל את biophysical מחקרים של emergiבתחום ng של חישה עקמומיות קרום. כאן, אנו מציגים שיטת הכנה חזק עבור מגוון רחב של ליפוזומים רלוונטיות מבחינה ביולוגית. שחול ידני באמצעות גז חזק מזרקים וממברנות פוליקרבונט 10,5 היא מנהג נפוץ אך ההטרוגניות הוא נצפה לעיתים קרובות בעת השימוש גדלים הנקבוביות פחות מ -100 ננומטר בשל בשל השתנות של לחץ ידני מיושם. העסקנו מנגנון קבוע לחץ שבשליטת שחול להכין ליפוזומים סינתטיים אשר בקטרים ​​לנוע בין 30 ל 400 ננומטר. פיזור אור דינאמי (DLS) 10, 11 ו במיקרוסקופ אלקטרונים Nanoparticle מעקב וניתוח (נ.ת. ע) 12 שימשו כדי לכמת את גודל liposome כמפורט בפרוטוקול שלנו, עם קלקר מסחרי (PS) חרוזים ששימשו כסטנדרט כיול. קשר ליניארי ליד נצפתה בין גודל הנקבוביות מועסק על ליפוזומים נקבע באופן ניסיוני, המעיד על איכות גבוהה של הכנה שלנו לחץ שבשליטת liposome נפגשוהוד. יתר על כן, הראינו כי שלפוחית ​​שומנים שיטת הכנת חלה באופן כללי, ללא תלות בגודל liposome שונים. לבסוף, אנו הוכיחו גם במחקר כמובן אז אלה ליפוזומים מוכנים היו יציבים עד 16 שעות. פרוטוקול נציג בגודל ננו הכנה liposome באה לידי ביטוי בהמשך.

Watch this Scientific Journal Video about Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles at JoVE.com

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

פרוטוקול זה מתאר שיטה שחול להכנת שלפוחית ​​השומנים של מיקרון משנה גדלים עם רמה גבוהה של הומוגניות. שיטה זו משתמשת במערכת לחץ מבוקר עם מבוקרים זרימת שיעורי חנקן להכנת liposome. הכנה שומנים בדם<sup&gt; 1,2</sup&gt;, שיחול liposome, ואפיון גודל יוצגו להלן.

שחול קבוע לחץ שבשליטת שיטה להכנת בגודל ננו שלפוחית ​​שומנים

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

constant-pressure-controlled-extrusion-method-for-preparation-nano

Research

JoVE Journal

Bioengineering

23.8K Views.  University of Colorado Boulder. פרוטוקול זה מתאר שיטה שחול להכנת שלפוחית ​​השומנים של מיקרון משנה גדלים עם רמה גבוהה של הומוגניות. שיטה זו משתמשת במערכת לחץ מבוקר עם מבוקרים זרימת שיעורי חנקן להכנת liposome. הכנה שומנים בדם 1,2, שיחול liposome, ואפיון גודל יוצגו להלן.

Video: Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

שיפר שיטה להכנה מבוססת תאים, דגם מגע אנושי של מחסום דם המוח

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. Clinically, this protein is widely used for cosmetic surgery, dermal injections, bone grafting, and reconstructive surgery. The sources of COL1 for these procedures are commonly nonhuman, which increases the potential for inflammation and rejection as well as xenobiotic disease transmission. In view of this, a method to efficiently and quickly purify COL1 from limited quantities of autologously-derived tissues would circumvent many of these issues; however, standard isolation protocols are lengthy and often require large quantities of collagenous tissues. Here, we demonstrate an efficient COL1 extraction method that reduces the time needed to isolate and purify this protein from about 10 days to less than 3 hr. We chose the dermis as our tissue source because of its availability during many surgical procedures. This method uses traditional extraction buffers combined with forceful agitation and centrifugal filtration to obtain highly-pure, soluble COL1 from small amounts of corium. Briefly, dermal biopsies are washed thoroughly in ice-cold dH2O after removing fat, connective tissue, and hair. The skin samples are stripped of noncollagenous proteins and polysaccharides using 0.5 M sodium acetate and a high speed bench-top homogenizer. Collagen from residual solids is subsequently extracted with a 0.075 M sodium citrate buffer using the homogenizer. These extracts are purified using 100,000 MW cut-off centrifugal filters that yield COL1 preparations of comparable or superior quality to commercial products or those obtained using traditional procedures. We anticipate this method will facilitate the utilization of autologously-derived COL1 for a multitude of research and clinical applications.

Traditional procedures for the isolation of soluble type 1 collagen (COL1) require about 10 days from start to finish because of lengthy buffer incubations and laborious resuspensions of fibrils. Here, we describe a means to purify COL1 from small dermal biopsies in less than 3 hr.

שיטה משופרת להכנת סוג I קולגן מעור

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This emerging field engages engineers, chemists, biologists, and physicists to design and assemble basic biological components into complex, functioning systems from the bottom up. Such bottom-up systems could lead to the development of artificial cells for fundamental biological inquiries and innovative therapies1,2. Giant unilamellar vesicles (GUVs) can serve as a model platform for synthetic biology due to their cell-like membrane structure and size. Microfluidic jetting, or microjetting, is a technique that allows for the generation of GUVs with controlled size, membrane composition, transmembrane protein incorporation, and encapsulation3. The basic principle of this method is the use of multiple, high-frequency fluid pulses generated by a piezo-actuated inkjet device to deform a suspended lipid bilayer into a GUV. The process is akin to blowing soap bubbles from a soap film. By varying the composition of the jetted solution, the composition of the encompassing solution, and/or the components included in the bilayer, researchers can apply this technique to create customized vesicles. This paper describes the procedure to generate simple vesicles from a droplet interface bilayer by microjetting.

Microfluidic jetting against a droplet interface lipid bilayer provides a reliable way to generate vesicles with control over membrane asymmetry, incorporation of transmembrane proteins, and encapsulation of material. This technique can be applied to study a variety of biological systems where compartmentalized biomolecules are desired.

השומנים bilayer שלפוחיות דור שימוש Microfluidic jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

הכנת מיכה נתמכת יפידים bilayers לרזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה אופטית הדמיה

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

ייצור Biomembrane ידי השומנים bilayer (SALB) השיטה בסיוע מרכך

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

מוצקים שומנים חלקיקים (SLNs) אפליקציות לתאיות מיקוד

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Film Extrusion of Crambe abyssinica/Wheat Gluten Blends

Crambe abyssinica is a plant with potential for use in industrial (non-food) plant oil production. The side stream from this oil production is a high-protein crambe meal that has limited value, as it is not fit for food or feed use. However, it contains proteins that could potentially make it a suitable raw material for higher-value products. The purpose of this study was to find methods of making this side stream into extruded films, showing that products with a higher value can be produced. The study mainly considered the development of material compositions and methods of preparing and extruding the material. Wheat gluten was added as a supportive protein matrix material, together with glycerol as a plasticizer and urea as a denaturant. The extrudate was evaluated with respect to mechanical (tensile testing) and oxygen barrier properties, and the extrudate structure was revealed visually and by scanning electron microscopy. A denser, more homogeneous material had a lower oxygen transmission rate, higher strength, and higher extensibility. The most homogeneous films were made at an extruder die temperature of 125-130 &#176;C. It is shown here that a film can be extruded with promising mechanical and oxygen barrier properties, the latter especially after a final compression molding step.

Film Extrusion of Crambe abyssinica/Wheat Gluten Blends

The side stream from plant oil production of Crambe abyssinica has limited value. The purpose of this study was to find methods for extruding materials based on this side stream, demonstrating that products with a higher value can be produced. The extrudates were found to have promising properties.

סרטים שחול של<em&gt; Crambe abyssinica</em&gt; / חיטה גלוטן תערובות

Crambe abyssinica is a plant with potential for use in industrial (non-food) plant oil production. The side stream from this oil production is a ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical development, not only their pharmaceutical activity is important but also their production needs to be evaluated. In this context, research focuses on the isolation of EVs, their characterization, and their storage. The present manuscript aims at providing a facile procedure for the assessment of the effect of different storage conditions on EVs, without genetic manipulation or specific functional assays. This makes it possible to quickly get a first impression of the stability of EVs under a given storage condition, and EVs derived from different cell sources can be compared easily. The stability measurement is based on the physicochemical parameters of the EVs (size, particle concentration, and morphology) and the preservation of the activity of their cargo. The latter is assessed by the saponin-mediated encapsulation of the enzyme beta-glucuronidase into the EVs. Glucuronidase acts as a surrogate and allows for an easy quantification via the cleavage of a fluorescent reporter molecule. The present protocol could be a tool for researchers in the search for storage conditions that optimally retain EV properties to advance EV research toward clinical application.

Here we present a readily applicable protocol to assess the storage stability of extracellular vesicles, a group of naturally occurring nanoparticles produced by cells. The vesicles are loaded with glucuronidase as a model enzyme and stored under different conditions. After storage, their physicochemical parameters and the activity of the encapsulated enzyme are evaluated.

הערכת יציבות האחסון של שלפוחיות ומסחטות

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

כימות בו זמני של קינורנינים נבחרים שנותחו על ידי ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית במדיום שנאסף מתרביות תאים סרטניים

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure single-molecular binding kinetics, assess mechanical properties of ligand-receptor interactions, visualize protein dynamic conformational changes and more excitingly elucidate receptor mediated cell mechanosensing mechanisms. More recently, BFP has been used to measure the spring constant of molecular bonds. This protocol describes the step-by-step procedure to perform molecular spring constant DFS analysis. Specifically, two BFP operation modes are discussed, namely the Bead-Cell and Bead-Bead modes. This protocol focuses on deriving spring constants of the molecular bond and cell from DFS raw data.

A biomembrane force probe (BFP) is an in situ dynamic force spectroscopy (DFS) technique. BFP can be used to measure the spring constant of molecular interactions on living cells. This protocol presents spring constant analysis for molecular bonds detected by BFP.

ניתוח מתמיד של האביב המולקולרי על ידי ספקטרוסקופיית בדיקה כוח Biomembrane

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure ...

שחול קבוע לחץ שבשליטת שיטה להכנת בגודל ננו שלפוחית ​​שומנים

שחול קבוע לחץ שבשליטת שיטה להכנת בגודל ננו שלפוחית שומנים