Mitochondriale Dysfunktion liegt vielen neurodegenerativen Erkrankungen zugrunde. Unser Protokoll stellt ein wichtiges Instrument zur Untersuchung der mitochondrialen Dynamik in den Axonen bereit und erleichtert die Untersuchung neurologischer Erkrankungen mit axonaler Degeneration. Durch die Kombination von mitochondrialer Etikettierung, Live-Zell-Bildgebung und induzierter pluripotenter Stammzelltechnologie kann unser Protokoll verwendet werden, um den mitochondrialen Handel entlang menschlicher Axone zu charakterisieren und ihre Morphologien zu analysieren.
Beeinträchtigter mitochondrialer Transport und Morphologie können in Stammzellkulturen und Tiermodellen neurodegenerativer Erkrankungen beobachtet werden, die potenzielle therapeutische Ziele für die Behandlung dieser Krankheiten bieten. Nach Tag fünfunddreißig der Kultur, dissoziieren Die Neurosphären von menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen in kleine Cluster mit 1 mg/ml Zellablösung für zwei Minuten bei 37 Grad Celsius differenzieren. Am Ende der Inkubation sammeln Sie die Zellcluster durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in einem Milliliter NDM wieder auf.
Platte etwa fünf Cluster von Zellen in hundert Mikroliter Medium pro Polyornithin und Lactose-Dehydrogenase erhöhen virusfreie reduzierten Wachstumsfaktor Keller Membran Matrix beschichtet 35 Millimeter GlasbodenSchalen. Dann fügen Sie einen Milliliter NDM mit B27, zyklischea Adenosin Monophosphat, Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor, menschliche Gehirn abgeleiteten neurotrophen Faktor und Gliazell abgeleitetneurotrophen Faktor zu jeder Kultur. Um Mitochondrien entlang der Axone von Vorhirn-Neuronen zu visualisieren, färben die Neuronen zuerst die Neuronen mit 50 nanomolarem roten Fluoreszenzfarbstoff enden in NDM für drei Minuten bei 37 Grad Celsius, gefolgt von zwei Washes in warmen NDM.
Als nächstes stellen Sie die Kultur auf die Bühne eines Fluoreszenzmikroskops und wählen Sie das 40X-Objektiv aus. Unter dem Phasenfeld identifizieren Sie die Axone anhand ihrer morphologischen Eigenschaften. Um die Richtung der mitochondrialen Bewegung entlang der Axone klar zu unterscheiden, identifizieren Sie die Zellkörper von Neuronen deutlich.
Nach der Unterscheidung des Zellkörpers und des Axons passen Sie die Belichtungszeit und den Fokus der Mitochondrien in den Axonen an und erfassen Sie den mitochondrialen Transport innerhalb der Axone alle fünf Sekunden für insgesamt fünf Minuten. Um den mitochondrialen Transport in ImageJ zu analysieren, öffnen Sie Fidschi und wählen Sie das Bio-Formats-Plugin. Verwenden Sie den Importvon Bio-Formats, um die Zeitrafferbilder der tiff-Serie zu importieren und standardmäßigimageJ und Open all series auszuwählen.
Überprüfen Sie die automatische Skalierung von geteilten Kanälen, und klicken Sie auf OK, um die Framenummer und -größe der Bilder in Pixel nok zu notieren. Nachdem Sie die Helligkeit und den Kontrast für alle 60 Frames angepasst haben, verwenden Sie die segmentierte Linie, um eine Linie vom Zellkörper zum Terminalaxon zu zeichnen. Um den Kymograph zu generieren, wählen Sie das multiple Kymograph-Plugin und wählen Sie die Linienbreite aus.
Zur Messung der Entfernung, Zeitwerte und Geschwindigkeit für die sich bewegenden Mitochondrien öffnen tsp050607. txt im Makro-Plugin. Und zeichnen Sie eine segmentierte Linie über die Spur der mitochondrialen Bewegung auf dem Kymographen von der überlegenen zur unteren Region.
Nach dem Zeichnen der Linie öffnen Sie Lesegeschwindigkeiten aus TL im Makro-Plugin, um die segmentierten Geschwindigkeiten zu lesen, die der Linie entsprechen. Öffnen Sie anschließend das Originalbild, und verwenden Sie das Linienwerkzeug, um eine Linie entlang der Maßstabsleiste zu zeichnen. Wählen Sie Analysieren aus, um die Länge der Linie zu messen, und konvertieren Sie jetzt den dx und die Entfernungseinheiten von Pixeln in Mikrometer.
Ändern Sie dann die Zeit von Pixel zu Sekunden. Um die mitochondriale Länge und Fläche innerhalb von Axonen in ImageJ zu analysieren, installieren Sie das Begradigungsunterstrich-JAR-Plugin und öffnen Sie das Axon-Image von Interesse. Konvertieren Sie das 32-Bit-Bild in acht Bit, und verwenden Sie das segmentierte Linienwerkzeug, um das Axon zu verfolgen.
Wählen Sie das STRAIGHTen Unterstrich JAR Plugin und legen Sie die Breite der Filament breite Linie auf 50 Pixel. Verfolgen Sie das Axon erneut, um ein begradigtes Axon zu erzeugen, und passen Sie den Bildschwellenwert an. Wählen Sie Set-Messungen analysieren, um Ellipsen und Formdeskriptoren anzupassen, um die Messung festzulegen, und verwenden Sie die Linienfunktion, um die Maßstabsleiste im Originalbild wie gezeigt zu messen.
Geben Sie unter Analysieren und Festlegen der Skala den Abstand in pixelbekannten Abstand und die Längeneinheit ein, um die Skala festzulegen. Wählen Sie dann global aus, um die Skalierungseinstellung auf alle Bilder festzulegen. Wählen Sie schließlich Analysieren und Analysieren von Partikeln aus, um den Bereich zu bestimmen, und wählen Sie Anzeigeergebnisse aus, um die resultierende Messung anzuzeigen.
Nach der Differenzierung in telenzephalische glutamaterge Neuronen können die Zellen durch ihre T-B-R ein und beta drei Tubulin Marker Expression gekennzeichnet werden. Die Färbung mit rotem Fluoreszenzfarbstoff und die Zeitraffer-Bildgebung ermöglicht die Auswertung des axonalen Transports von Mitochondrien. Ein einzelnes Mitochondrion kann statisch bleiben oder sich in anterograder oder retrograder Richtung innerhalb eines Axons bewegen.
Die Geschwindigkeit der mitochondrialen Bewegung entlang des Axons kann wie dargestellt quantifiziert werden. Zum Beispiel mit kommerziell erhältlichen Analyse-Software ist der Prozentsatz der motilen Mitochondrien deutlich reduziert in S-P-G-3-A Neuronen im Vergleich zu wilden Typ Neuronen. Zur Analyse der mitochondrialen Flächenlänge und des Seitenverhältnisses können Axone in der Bildanalysesoftware begradigt und durch Anpassen des Schwellenwerts ausgewählt werden.
Die mitochondriale Flächenumfangsbreite und das Seitenverhältnis können dann aus dem begradigten Axon gewonnen werden. Zum Beispiel sind sowohl die mitochondriale Länge als auch das Seitenverhältnis in S-P-G 15 Neuronaxonen im Vergleich zu Wild-Typ-Axonen signifikant reduziert. Es ist wichtig, das Medium und den Mikroskop-Inkubator zu erwärmen, um die Zellen sanft zu waschen und die Zellen vor der Bildgebung für zwanzig Minuten stabilisieren zu lassen.
Nach der Live-Zell-Bildgebung können die Kulturen fixiert und immunstainiert werden, um die Expression anderer Proteine von Interesse zu untersuchen. Es ist eine Herausforderung, die mitochondriale Dynamik in lebenden menschlichen Nerven zu untersuchen. Diese Technik bietet das einzigartige Werkzeug für die Untersuchung der mitochondrialen Dynamik und Nervendegeneration bei neurologischen Erkrankungen.
