Wir sind dankbar, S. Taylor für die Bereitstellung der pLPCX-Histone H2-GFP-Plasmid. Wir danken R. Mertelsmann für die kontinuierliche Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft unterstützt.

Ein. Seeding der U2OS-basierte Cyclin B-SNAP Reporter Cells (Clone 11 Cells 6) auf Mikroskop Chamber Slides <ol><li> Trypsinieren subkonfluenten SNAP Reporter Zellen, die erlaubt, asynchron wachsen in log-Phase für mindestens 48 h wurden. </li><li> Arbeiten mit 8 gut Mikroskop Kammern (konstante Verteilung der Zellen). </li></ol> Zum Beimpfen von Zellen auf 8-Well-Mikroskop-Kammern mit einer konstanten Verteilung über die gesamte Fläche des Mikroskops Kammer Zentrifuge 10.000 Zellen und Resuspendieren in 350 ul Phenolrot-freiem normalem Wachstumsmedium (ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum, Penicillin / Streptomycin und Natriumpyruvat). Übertragen Zellsuspension zum Mikroskop Kammer (Abbildung 2). Arbeiten mit 8 gut Mikroskop Kammern (maximale Zelldichte in der Mitte). Zum Beimpfen von Zellen in einer höheren Dichte im Zentrum des Mikroskops chambäh, laden Sie die Kammer mit 300 ul Phenolrot-freiem normalem Wachstumsmedium. Hinzufügen 5.000 Zellen vorsichtig auf die Mitte des Mikroskops Kammer (Abbildung 2). Arbeiten mit 96 auch spezielle Optik Platten (konstante Verteilung der Zellen). Zum Beimpfen von Zellen auf 96-Well-Platten bei einer konstanten Verteilung über die gesamte Oberfläche des Bohrlochs, zentrifugieren 5.000 Zellen und Resuspendieren in 300 ul Phenolrot-freiem normalen Wachstumsmedium. Übertragen der Zellsuspension auf eine 96-Well-Platte. Abhängig von der Gesamtzahl der Zellen enthaltende Bohrungen Bedarf die Zellzahl und das Gesamtvolumen des Suspensionsmediums (Abbildung 2). Arbeiten mit 96 auch spezielle Optik Platten (maximale Zelldichte in der Mitte). Für die Aussaat von Zellen auf 96-Well-Platten, vorsichtig 1.500 Zellen in 15 ul Phenolrot-freiem normalem Wachstumsmedium in einem small Tropfen auf die Mitte jeder Vertiefung zur Beschränkung Zellwachstum zu erreichen, um die Mitte der Wanne (Abbildung 2). <ol start="3"><li> Lassen ausgesäten Zellen für mindestens 18 Stunden unter Standardbedingungen Zellkultur Bedingungen (37 ° C, 100% Luftfeuchtigkeit, 5% CO 2) zu wachsen. </li></ol> 2. Die Färbung der Reporter Zellen mit SNAP Substrate <ol><li> 30 Minuten vor dem Beginn des Färbeverfahrens ermöglichen Aliquots von Phenolrot-frei normalen Wachstumsmedium zum Aufwärmen auf 37 ° C. </li><li> Für die einfache Handhabung des SNAP Substrat (in unserem Fall TMR Star) aufzulösen TMR Star in DMSO, um eine Konzentration in der Stammlösung von 400 uM, die bei -20 ° C gelagert werden erhalten </li><li> Vor dem Färben, verdünnte 0,5 ul TMR-Sterne-Stammlösung in 200 ul Phenolrot-freiem normalem Wachstumsmedium (37 ° C), um eine endgültige Kennzeichnung Konzentration von 1 uM erhalten. </li><li> Entfernen normalem Wachstumsmedium von den asynchron wachsenden Zellen und Inkubation in lAbeling Medium für 25 min unter Standard-Kulturbedingungen. </li><li> Entfernen Etikettieren Medium und Waschen Zellen viermal mit Phenolrot-freiem normalem Wachstumsmedium (37 ° C). Inkubieren Zellen in 300 ul Phenolrot-freiem normalem Wachstumsmedium (37 ° C) für 30 min. Vor dem Transport zu dem Mikroskop ersetzen das Medium mit frischem Phenolrot-freiem normalem Wachstumsmedium (37 ° C), um restliche ungebundenen SNAP Substrat zu entfernen. </li><li> Transport-Zellen mit dem Mikroskop in einem Styropor-Box auf einem vorgewärmten (37 ° C) Heizblock gegen Temperaturschwankungen zu minimieren. </li></ol> 3. Messung der Fluoreszenzintensität <ol><li> Zwei Stunden vor der Analyse einstellen Lufttemperatur der Klimakammer bei 37 ° C in trockenem Modus, um das gesamte Mikroskop mit all seinen Komponenten auf die gewünschte Temperatur zu bringen. Vorheizen, bevor Sie die Luftfeuchtigkeit ist wichtig, Kondensation und anschließende Beschädigung des Mikroskops zu vermeiden. </li><li> Passen Luftfeuchtigkeit to 60% und CO 2 bis 5% vor dem Beginn der Analyse. </li><li> Starten Sie den Scan ^ R Acquisition Software und definieren Standard-Einstellungen (siehe Tabelle 1). </li><li> Werden die Stellen der Vertiefungen analysiert werden. </li><li> Definieren Sie die At (Übernahme Zykluszeit) und die absolute Zahl der Erwerbs-Zyklen. </li><li> Wenn die Analyse einer größeren Anzahl von Brunnen gewünscht wird, wählen Sie Hardware Autofokus, sonst ist es ausreichend, um Software-Autofokus-alone verwenden. </li><li> Starten Sie die Aufnahme und Überwachung in den ersten beiden Erfassungszyklen. Das Mikroskop ist am Histon H2-GFP-Signal zu konzentrieren, mit anschließender Übernahme eines ersten Bildes in diesem Kanal, bevor der Filter gewechselt wird und der entsprechende TMR Stern Bild aufgenommen wird (Abbildung 3). Dies wird dann für alle Positionen innerhalb einer Vertiefung und für jede der Mulden zu untersuchenden wiederholt, vor der Wiederholung erneut den nächsten Zyklus. </li></ol> 4. Analyse der proteolytischen Profile usingen Scan ^ R <ol><li> Starten Sie den Scan ^ R-Analyse-Software und analysieren die Bilder mit den Zellkernen, wie visualisiert Histon H2-GFP, als Haupt-Objekt definiert, mit einer Schwelle von Signalintensität und einer Wasserscheide-Algorithmus, um die Trennung benachbarter Zellen unterstützen basiert. Ein Unterobjekt, bestehend aus einem Kern mit Zytoplasma sollte TMRstar Analyse erstellt werden. (Wichtige Eigenschaften des Hauptobjekts sind X und Y-Positionen, Zeit und maximalen und mittleren Intensitäten der GFP für die Haupt-Objekt und die gesamte Intensität Bereich für die TMRstar Unterobjekt unterteilt.) Diese Analyse kann einige Stunden wegen großer Datenmengen Mengen. </li><li> Ändern Sie den Modus zu verfolgen, um die subobject mittlere TMR-Sterne Fluoreszenzintensität über die Zeit (Zelle Spuren), zugeordnet zu den analysierten wichtigsten Objekte (Abbildung 4) zu visualisieren. Die Anzahl der zu untersuchenden Zellen lassen sich nach Gating auf diesen Messungen Laufzeit von mindestens 140 Zyklen und mit einer hohen maximalen Lichtstärke von H2-GFP verengt werden. Suchenbei größeren Anzahlen von Zellen ermöglicht eine erste repräsentative und objektive Sicht (Abbildung 4). </li><li> Wählen Sie eine Zelle Spur von Interesse Histon H2-GFP-und TMR-Sterne-Fluoreszenz gleichzeitig an der einzelnen Zelle (5A) zu visualisieren. </li><li> Mit der rechten Maustaste auf eine Zelle von Interesse und erzeugen eine ausführbare Bildergalerie zur Illustration von Histon H2-GFP und Cyclin B-SNAP TMR Star für jeden einzelnen Zeitpunkt. </li><li> Wechseln Sie in der Bevölkerung Modus des Scan ^ R Analysesoftware und Tor in der Region, wo die Zelle von Interesse auf der X vs Y dot plot (5B) vertreten ist. </li><li> Tragen Sie einen neuen Punkt Plot-Fenster auf die gated Region und visualisieren meine TMR-Sterne Fluoreszenzintensität über die Zeit (Abbildung 5C). </li><li> Exportieren von Daten (Zeit und Fluoreszenz-Intensität), um Microsoft Excel zur weiteren Berechnung. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Feigeure 5D und 5E zeigen Cyclin B Kinetik, durch einen Stern TMR Fluoreszenzintensität Kurve dargestellt, mit einer Zelle, die durch einen regelmäßigen verläuft Mitose ohne Anzeichen einer chromosomalen Fehlausrichtung (5E). Nach der Verdichtung des Cytoplasmas nach Kernhülle Aufteilung (NEBD, wie durch den roten Dreieck gekennzeichnet) zeigt TMR-Sterne Fluoreszenzintensität einen abrupten Anstieg bis die isomorph Fenster (heller Bereich in der Abbildung) ist erreicht, wenn die Zelle in Prometaphase 6. Fluoreszenzintensität bleibt auf einem stabilen Niveau, solange die Zelle durchläuft und Prophase Metaphase und dann beginnt schnell einmal fallen alle Chromosomen eines stabilen Metaphaseplatte festgelegt (Figur 5D und 5E). Dieser Rückgang voraus Trennung der Chromosomen während der Anaphase (blauer Punkt auf der Kurve). Im späten Mitose das Chromatin beginnt decondense (blaue Balken) und die Zelle nimmt Interphase Morphologie während die Fluoreszenzintensität Kurve nähert sich einPlateau, das niedriger als das Plateau vor der Mitose (5D und 5E) ist. <table border="1"><tbody><tr><td> Autofokus-Einstellungen </td><td> Histone H2-GFP (Hauptobjekt Akquisition Einstellungen) </td><td> Cyclin B-SNAP mit TMR Stern markiert (Erwerb Einstellungen) </td><td> Erfassungszykluszeit Wiederholungen </td></tr><tr><td> Grob Autofokus + / -39 um 24 Layers Feine Autofokus + / -5,4 Um 14 Layers </td><td> GFP Filter gesetzt: Belichtungszeit: 100 ms Lichtstärke: 25% </td><td> TRITC Filter gesetzt: Belichtungszeit: 150 ms Lichtstärke: 33,3% </td><td> 2 bis 5 min. </td></tr><tr><td> GFP Filter gesetzt: Belichtungszeit: 12 ms Lichtstärke: 12,5% </td><td></td><td></td><td> Bis zu 48 h an fortgesetzte Analyse (begrenzt durch reduzierte Luftfeuchte von 60%) </td></tr></tbody&gt; </table> Tabelle 1. Standardeinstellungen für Analysen von Cyclin B Proteolyse verwendet. Histone H2-GFP wurde als Referenz verwendet, um die Struktur Fokusebene zur Messung von Cyclin B-SNAP Fluoreszenzintensität definieren. Lichtintensitäten während der Fokussierung Verfahrens sind niedriger als bei der Bildaufnahme Einstellungen gegenüber kumulativen Phototoxizität zu vermeiden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der Messung von Cyclin B Proteolyse durch Expression eines chimären Cyclin B Derivates Abbaueigenschaften ähnlich dem endogenen Protein. Der Rückgang der Fluoreszenzintensität nach Pulse-Chase-Markierung ist ein Maß für APC / C-Aktivität. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig2.jpg" /> Abbildung 2. Analyse von Zellen auf 8 gut Dias oder 96-Well-Platten. Regelmäßige Verteilung derZellen in der Oberfläche des Bohrlochs durch Resuspension in einem Endvolumen von 300 ul erreicht und wird empfohlen, wenn nur ein einzelner oder weniger Positionen für eine Analyse manuell definiert werden. Anreicherung von Zellen im mittleren Bereich wird durch Zugabe von Zellen zu dem Zentrum der vorgefüllten oder leeren Vertiefungen erreicht. Diese Technik wird im Falle einer automatisierten Bildaufnahme in verschiedenen Vertiefungen empfohlen. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig3.jpg" /> Abbildung 3. Ablauf der Datenerfassung. A) Nachweis von Histon-H2-GFP ist für Fokusebene Definition und Überwachung von chromosomalen Ausrichtung während der Mitose verwendet. B) Fluoreszenzintensität des TMR Stern Fluoreszenzintensität ist ein Maß für den absoluten Betrag der Pulse-Chase-markierten Cyclin B-SNAP. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig4.jpg" /> Abbildung 4. Vertreter Scan ^ R Analysis Software-basierte Darstellung der mittleren TMR SternFluoreszenzintensitäten (insgesamt TMRstar Intensität geteilt durch Fläche) über die Zeit. Auswahl einer repräsentativen Zelle Spur (blau). Die entsprechenden Bilder (siehe rechts) ermöglichen die gleichzeitige Darstellung von Histon H2-GFP (grün) und Cyclin B-SNAP (rot). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig5.jpg" /> Abbildung 5. A + B) Beispiel für Gating von Punkten, die eine Zelle von Interesse auf der XY-Punkt-Diagramm. C) Visualisierung der mittleren TMRstar Fluoreszenzintensität (insgesamt TMRstar Intensität geteilt durch Fläche) im Laufe der Zeit mit der Dot-Plot. D + E) Vertreter Fluoreszenzintensität Kurve von Cyclin B-SNAP mit isomorph Fenster (brigher Feld auf dem Diagramm) zwischen NEBD (Kernhülle Aufteilung) und Chromatindekondensation (blauer Balken) als in Microsoft Excel erzeugt. Anaphase durch t angedeutetEr blauen Punkt auf der Kurve. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239fig5large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . Movie 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239movie1.avi" target="_blank">Klicken Sie hier, um zusätzliche Film anzusehen</a> .

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	<li>Musacchio, A., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle-assembly+checkpoint+in+space+and+time.">The spindle-assembly checkpoint in space and time.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 379-393 (2007).</li><li>Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregating+sister+genomes:+the+molecular+biology+of+chromosome+separation.">Segregating sister genomes: the molecular biology of chromosome separation.</a> Science. 297, 559-565 (2002).</li><li>Cahill, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+mitotic+checkpoint+genes+in+human+cancers.">Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers.</a> Nature. 392, 300-303 (1998).</li><li>Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+instabilities+in+human+cancers.">Genetic instabilities in human cancers.</a> Nature. 396, 643-649 (1998).</li><li>Fletcher, D. A., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics+and+the+cytoskeleton.">Cell mechanics and the cytoskeleton.</a> Nature. 463, 485-4892 (2010).</li><li>Schnerch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+APC/C+activity+in+the+presence+of+chromosomal+misalignment+in+unperturbed+cell+populations.">Monitoring APC/C activity in the presence of chromosomal misalignment in unperturbed cell populations.</a> Cell Cycle. 11, (2012).</li><li>Keppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nat. Biotechnol. 21, 86-869 (2003).</li><li>Jansen, L. E., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+centromeric+chromatin+requires+exit+from+mitosis.">Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis.</a> J. Cell. Biol. 176, 795-805 (2007).</li><li>Malureanu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc20+hypomorphic+mice+fail+to+counteract+de+novo+synthesis+of+cyclin+B1+in+mitosis.">Cdc20 hypomorphic mice fail to counteract de novo synthesis of cyclin B1 in mitosis.</a> J. Cell Biol. 191, 313-329 (2010).</li><li>Mena, A. L., Lam, E. W., Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+spindle-assembly+checkpoint+response+requires+de+novo+transcription+and+translation+of+cyclin+B1.">Sustained spindle-assembly checkpoint response requires de novo transcription and translation of cyclin B1.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Wolthuis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc20+and+Cks+direct+the+spindle+checkpoint-independent+destruction+of+cyclin.">Cdc20 and Cks direct the spindle checkpoint-independent destruction of cyclin.</a> A. Mol. Cell. 30, 290-302 (2008).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir stellen Ihnen hier eine Live-Cell-Imaging-basierten Ansatz erleichtert die gleichzeitige Überwachung von Cyclin B Proteolyse und Chromosom Ausrichtung. Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung der mitotischen Kontrolle in ungestörten Zellpopulationen an der einzelnen Zelle. Cyclin B Abbaukurven erleichtern direkten Einblick in die Aktivität des APC / C und damit indirekt geben den Status des SAC 6. Dieser Ansatz, obwohl gegründet basierend auf dem Scan ^ R-Software, kann...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Produkts </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Reporter-Zelllinie </td><td> generiert in-house wie beschrieben 6 </td><td> Klon 11 Reporterzellen (U2OS basierenden Cyclin B-SNAP exprimierende Zellen) </td><td></td></tr><tr><td> Retrovirale Cyclin B-SNAP Expressionsvektor </td><td> generiert in-house wie beschrieben 6 </td><td> pLNCX2-Cyclin B mut5-SNAP </td><td></td></tr><tr><td> Phenolrot-freiem DMEM </td><td> Gibco </td><td> 21063-029 </td><td> Supplementierung mit FCS, Natriumpyruvat, Penicillin / Streptomycin-mycin erforderlich </td></tr><tr><td> SNAP-Cell TMR-Star </td><td> New England Biolabs </td><td> S9105S </td><td> Stammlösung 400 uM in DMSO </td></tr><tr><td> Besondere Opstics Plate, 96 well </td><td> Costar </td&gt; <td> 3720 </td><td></td></tr><tr><td> μ-Slide 8 gut, ibiTreat </td><td> Ibidi </td><td> 80826 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskopie-Einheit </td><td> Olymp </td><td> IX-81 inverse Mikroskop mit Klimakammer </td><td></td></tr><tr><td> Ziel </td><td> Olymp </td><td> UPLSAPO 20x-Objektiv (NA 0,75) </td><td></td></tr><tr><td> Acquisition Software </td><td> Olymp </td><td> Scan ^ R Acquisition Software (v.2.2.09) </td><td></td></tr><tr><td> Analyse-Software </td><td> Olymp </td><td> Scan ^ R Analysis Software (v.1.2.0.6) </td><td></td></tr></tbody></table>

studying proteolysis of cyclin b at the single cell level in whole cell populations

Gleichmäßige Verteilung der Chromosomen auf die beiden Tochterzellen bei der Zellteilung ist eine Voraussetzung für die Gewährleistung der genetischen Stabilität 1. Ungenauigkeiten bei der Trennung der Chromosomen sind ein Markenzeichen der Bösartigkeit und mit fortschreitender Erkrankung 2-4. Die Spindelanordnung Prüfpunkt (SAC) eine mitotische Überwachungsmechanismus zurückhält, die Zellen in der Metaphase bis jeder einzelnen Chromosom eine stabile Befestigung an der bipolaren mitotischen Spindel 1 hergestellt wurde. Der SAC übt seine Funktion durch Interferenz mit der aktivierenden APC / C-Untereinheit Cdc20 Proteolyse des Securin und Cyclin B und damit Trennung der Chromosomen und mitotische Ausfahrt blockieren. Bei unsachgemäßer Befestigung von Chromosomen verhindert Silencing SAC-Signalisierung und führt fort Hemmung der APC / C Cdc20, bis das Problem behoben ist auf Chromosom missegregation, Aneuploidie und bösartigen Neubildungen 1 zu vermeiden. Die meisten Studien, die die i adressiertnfluence unsachgemäßer chromosomale Befestigung an APC / C-abhängige Proteolyse nutzte der Spindel Störungen mit Depolymerisation oder Mikrotubuli-stabilisierende Medikamente mit chromosomalen Bindung an Mikrotubuli stören. Da Störungen Mikrotubuli Kinetik des Transports und Lokalisierung der kritischen Regulatoren beeinflussen können, tragen diese Verfahren ein Risiko der Induktion künstliche Effekte 5. Um zu untersuchen, wie die SAC mit APC / C-abhängige Proteolyse von Cyclin B stört während der Mitose in ungestörten Zellpopulationen, haben wir ein Histon H2-GFP-basiertes System, das erlaubt die gleichzeitige Überwachung von Metaphase Ausrichtung der mitotischen Chromosomen und Proteolyse von Cyclin B 6 . Einen proteolytischen Profile darstellen, erzeugten wir eine chimäre Cyclin B Reportermolekül mit einem C-terminalen SNAP-Einheit 6 (Abbildung 1). In einem Self-Labelling Reaktion ist der SNAP-Einheit in der Lage, kovalente Bindungen mit bildenAlkylguanin-Trägern (SNAP Substrat) 7,8 (Abbildung 1). SNAP Substratmolekülen sind leicht verfügbar und führen ein breites Spektrum verschiedener Fluorochrome. Chimäres Cyclin B-SNAP-Moleküle geworden markierten bei Zugabe des Membran-permeablen Substrat SNAP zum Wachstumsmedium 7 (Abbildung 1). Nach der Markierungsreaktion sinkt die Cyclin B-SNAP Fluoreszenzintensität in einem Puls-Chase-Reaktion-artig und Fluoreszenzintensitäten reflektieren Ebenen von Cyclin B Abbau 6 (Abbildung 1). Unserem System erleichtert die Überwachung der mitotischen APC / C-abhängige Proteolyse in einer großen Anzahl von Zellen (oder mehrere Zellpopulationen) parallel. Dabei kann das System ein wertvolles Werkzeug, um Agenten / kleine Moleküle, die in der Lage, mit proteolytischer Aktivität in der Metaphase stören den Übergang Anaphase zu identifizieren sein. Darüber hinaus hat die Synthese von Cyclin B während der Mitose kurzem als wichtiges mechanis vorgeschlagen wordenm bei der Förderung eines mitotischen Block in Mäusen und Menschen, indem sie Cyclin B Expression stabiler 9,10, aktiviert dieses System uns Cyclin B Proteolyse als ein Element eines ausgewogenen Gleichgewichts 6 analysieren.

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Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Metaphase zur Anaphase Übergang durch Anaphase-promoting complex (APC / C)-abhängige Ubiquitinierung und anschließende Zerstörung von Cyclin B. Hier haben wir ein System, das Pulse-Chase-Kennzeichnung nach, ermöglicht die Überwachung Cyclin B Proteolyse im gesamten Zellpopulationen und wird ausgelöst, erleichtert den Nachweis von Störungen durch den mitotischen Checkpoint.

Studieren Proteolyse von Cyclin B an der Single Cell Level in Whole Cell Populationen

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.4K Aufrufe.  University Medical Center Freiburg. Metaphase zur Anaphase Übergang durch Anaphase-promoting complex (APC / C)-abhängige Ubiquitinierung und anschließende Zerstörung von Cyclin B. Hier haben wir ein System, das Pulse-Chase-Kennzeichnung nach, ermöglicht die Überwachung Cyclin B Proteolyse im gesamten Zellpopulationen und wird ausgelöst, erleichtert den Nachweis von Störungen durch den mitotischen Checkpoint.

Serie: Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we will guide you through the process of performing whole-cell recordings of light evoked currents of individual cells in the retinal slice preparation. We use the aquatic tiger salamander as an animal model. We begin by describing the dissection of the eye and show how slices are mounted for electrophysiological recordings. Once the slice is placed in the recording chamber, we demonstrate how to perform whole-cell voltage clamp recordings. We then project visual stimuli onto the photoreceptors in the slice to elicit light-evoked current responses. During the recording we perfuse the slice with pharmacological agents, whereby an 8-channel perfusion system allows us to quickly switch between different agents.  The retinal slice preparation is widely used for patch clamp recordings in the retina, in particular to study amacrine or bipolar cells, which are not accessible in a whole-mount preparation.

This video shows the process of whole-cell voltage clamp recordings in the retinal slice of the aquatic tiger salamander. We demonstrate the preparation of the slice as well as how to perform patch clamp recordings during visual stimulation of the retina.

Ganzzellableitungen of Light evozierten exzitatorischen synaptischen Ströme in der Netzhaut Scheiben

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

Forschung

Biologie

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression profiles of pyramidal neurons in layer III. It is well known that the cerebral cortex is an exceptionally heterogeneous structure comprising diverse regions, layers and cell types, each of which is characterized by distinct cellular and molecular compositions and therefore differential gene expression profiles. To circumvent the confounding effects of tissue heterogeneity, we used laser-capture microdissection (LCM) in order to isolate our specific cell-type i.e pyramidal neurons.
Approximately 500 pyramidal neurons stained with the Histogene staining solution were captured using the Arcturus XT LCM system. RNA was then isolated from captured cells and underwent two rounds of T7-based linear amplification using Arcturus/Molecular Devices kits. The Experion LabChip (Bio-Rad) gel and electropherogram indicated good quality a(m)RNA, with a transcript length extending past 600nt required for microarrays. The amount of mRNA obtained averaged 51&mu;g, with acceptable mean sample purity as indicated by the A260/280 ratio, of 2.5. Gene expression was profiled using the Human X3P GeneChip probe array from Affymetrix.

We describe a process using laser-capture microdissection to isolate and extract RNA from a homogeneous cell population, pyramidal neurons, in layer III of the superior temporal gyrus in postmortem human brains. We subsequently linearly amplify (T7-based) mRNA, and hybridize the sample to the Affymetrix human X3P microarray.

Beziehen High Quality-RNA aus Einzel-Zellpopulationen in menschlichen Postmortem Gehirngewebe

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

Methode zur Messung des Viral Fusion Kinetics auf der Single Particle Stufe

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

Quantitative Messung der Invadopodia-vermittelte extrazellulären Matrix Proteolyse in Einzel-und Multizelluläre Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Segmentation is a periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic formation of blocks of tissue called somites along the body axis is evidence of a genetic oscillator patterning the developing embryo. In zebrafish, the intracellular clock driving segmentation is comprised of members of the Her/Hes transcription factor family organized into negative feedback loops. We have recently generated transgenic fluorescent reporter lines for the cyclic gene her1 that recapitulate the spatio-temporal pattern of oscillations in the presomitic mesoderm (PSM). Using these lines, we developed an in vitro culture system that allows real-time analysis of segmentation clock oscillations within single, isolated PSM cells. By removing PSM tissue from transgenic embryos and then dispersing cells from oscillating regions onto glass-bottom dishes, we generated cultures suitable for time-lapse imaging of fluorescence signal from individual clock cells. This approach provides an experimental and conceptual framework for direct manipulation of the segmentation clock with unprecedented single-cell resolution, allowing its cell-autonomous and tissue-level properties to be distinguished and dissected.

Somitogenesis is a rhythmic developmental process that spatially patterns the body axis of vertebrate embryos. Previously, we developed transgenic zebrafish lines that use fluorescent reporters to observe the cyclic genes that drive this process. Here, we culture dispersed cells from these lines and image their oscillations over time in vitro.

Generierung von Dispersed präsomitischen Mesoderm Zellkulturen für Imaging der Zebrafisch-Segmentierung Uhr in Einzelzellen

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Ein-Kanal-Cell-Attached-Patch-Clamp-Aufnahme

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Here we employ FISH methodology to track LINE-1 retrotransposition at the single nuclei level in chromosome spreads of HepG2 cell lines stably expressing synthetic LINE-1.

Analyse von LINE-1-Retrotransposition im Einzel Nucleus Ebene

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium covering most of our body, and epidermal appendages such as the hair follicles and sweat glands. The epidermis undergoes regeneration throughout life and in response to injury. This is enabled by K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell populations that are tightly regulated by multiple regulatory mechanisms active within the epidermis and between epidermis and dermis. This article describes a simple method to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize K14 protein expression patterns, Ki67 labeled proliferating cells, Nile Red labeled sebocytes, and DAPI nuclear labeling at single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment and quantification of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines. The CUBIC protocol is the best method available to date to investigate molecular and cellular interactions in full thickness skin biopsies at single cell resolution.

This report describes a CUBIC protocol to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize protein expression patterns, proliferating cells, and sebocytes at the single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines.

CUBIC Protokoll Visualisiert Expression Protein bei Single Cell Resolution in Ganze Berge Vorbereitung der Haut

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.