Die Arbeit wurde durch die NIH gewährt AI57159 (SCH) und AI72346 (bis AMvO) unterstützt. SCH ist ein Howard Hughes Medical Institute Investigator.

Deckglas Funktionalisierung Die planare Doppelschicht in der Fusion-Assay verwendet wird, auf eine hydratisierte Film von Dextran unterstützt. Dextran dient als Abstandshalter zwischen den planaren Bilayer und Glasoberfläche. Dies verhindert Membran-Komponenten erst gar nicht auf der Glasoberfläche fest und bietet auch Raum in dem die Inhalte einer Virus-Partikel können auf Fusion zu entkommen. Deckgläser werden durch Behandlung mit einem Epoxysilan, die uns chemisch binden Dextran, das Glas (Elender, et al. 1996) ermöglicht funktionalisiert. <ol><li> Vereinbaren Sie 25 mm Deckgläschen in einer keramischen Färbebank und Platz im Rack in ein Glas oder Becher. </li><li> Füllen Sie den Behälter mit einer 10% igen Laborqualität Glaswaren Reinigungsmittel. Stellen Sie den Behälter in einem Ultraschall-Reinigungsgerät für 30 Minuten. </li><li> Spülen Sie den Behälter und Deckglas Rack mit deionisiertem Wasser und füllen Sie mit 1M postassium Hydroxid. Bringen Sie den Behälter zum Ultraschallbad für weitere 30 Minuten. </li><li> Wiederholen Sie diesen Reinigungsvorgang unter Verwendung von Aceton und Ethanol. </li><li> Spülen Sie den coverlips in Wasser und trocknen. </li><li> Schließlich, reinigen Sie die Deckgläser mit einem Sauerstoff-Plasma-Stripper für drei Minuten. </li><li> Der letzte Reinigungsschritt oxidiert die Oberfläche, so dass das Glas gleichmäßig hydrophil und reaktiven in den folgenden Silanisierung Schritte. </li><li> Bereiten Sie eine 0,2% ige Lösung von 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan in Isopropanol. Tauchen Sie die Deckgläser in dieser Lösung für 5 Minuten. </li><li> Entsorgen Sie die Silan-Lösung und spülen Sie die Deckgläser mehrmals in Isopropanol. </li><li> Die Deckgläser werden nun mit einer Schicht aus Silan beschichtet, aber sie müssen gehärtet werden, um damit das Silan kovalent an das Glas. Legen Sie die Deckgläser in einem Ofen auf 80 Grad Celsius für eine Stunde. </li><li> Während die Deckgläser Aushärtung sind, wiegen Sie Dextran 500 und erstellt einen 30% w / v Lösung. Vorwärmen des Wassers wird die Beihilfe Auflösung. Wir werden ca. 1 ml dieser Lösung pro Deckglas. Sobald die Dextran gelöst hat, entschäumen die Lösung in einem Vakuumexsikkator. </li><li> Wenn die silanisierte Deckgläschen abgeschlossen haben Härtung, entfernen Sie sie aus der Keramik-Rack und ordnen Sie sie flach auf der Innenseite einer Kunststoff-Gefrierfach. Verwenden einer 1 ml Pipette auf die Oberseite eines jeden Deckglas mit ca. 1 ml der Dextranlösung decken. Schließen Sie das Gefrierfach und lassen Sie sich in einem ruhigen Platz für 24-36 Stunden. </li><li> Fassen Sie die Deckgläser mit Kunststoff-Pinzette, giesst die überschüssige Dextran und ersetzen Sie sie in die Keramik-Rack. Spülen Sie die Deckgläser mehrmals in Wasser, und lassen Sie die Deckgläschen in Wasser für 48 Stunden einweichen. Das Glas kann leicht auf einem Tisch-Rotator geschüttelt werden. </li><li> Trocknen Sie die Deckgläser in einem Ofen auf 80 Grad Celsius und speichern in einem Vakuum-Exsikkator. </li></ol> Liposomenzubereitung Lipiddoppelschichten sind durch Adsorption Liposomen zu einer Dextran funktionalisierten Deckglas gebildet. Die adsorbierten Liposomen verschmelzen mit einander, bis Membran reißt und breitet sich flach über der Oberfläche. <ol><li> Ein typisches Liposomenformulierung im Assay verwendet wird, besteht aus 1,2, Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC), 1-Oleoyl-2-Palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC), Cholesterin, Rinderhirn Disialoganglioside (GD 1a) und N-((6 - (Biotinoyl) amino) Hexanoyl) -1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-Phosphoethanolamin in einem Verhältnis von 4:4:2:0.1:5 x10 -5. Alle Komponenten sind in Chloroform oder Chloroform und Methanol-Lösungen gespeichert. </li><li> Bereiten Sie eine Mischung aus zwei Mikromol Lipid durch die Übertragung von Mengen der einzelnen Komponenten in ein Reagenzglas. Das Lösungsmittel wird unter einem Strom von Argon oder Stickstoff. Entfernen Sie das restliche Lösungsmittel, indem man das Reagenzglas in einen Vakuumexsikkator für zwei Stunden. </li><li> Resuspendieren getrocknete Lipidfilm in 400 Mikroliter HNE-Puffer (5 mM HEPES, 145 mM NaCl, 0,1 mM EDTA). </li><li> Übertragen Sie die Suspension auf eine Kunststoff-Mikrozentrifugenröhrchen. Einfrieren der Suspension in einem Bad aus flüssigem Stickstoff und Auftauen in einem warmen Wasserbad. Wiederholen Sie diesen Frost / Tau-Zyklus viermal. </li><li> Montieren einer Lipid-Extruder mit einer 100 nm Polycarbonat-Membranfilter, und extrudieren die Lipidsuspension 25-mal. Die Suspension sollte erscheinen zu mehr Transparenz nach der Extrusion. </li><li> Liposomen sollten am Tag sind sie bereit verwendet werden. Sie können bei Raumtemperatur gelagert werden, bis verwendet. </li></ol> Mikrofluidik-Messzelle Vorbereitung Eine einfache mikrofluidischen Durchflusszelle ist durch Einfügen doppelte Klebeband zwischen einem Quarz-Rutsche und einer funktionalisierten Deckglas gemacht. <ol><li> Besorgen Sie sich ein 20x20x3 mm Quarz-Objektträger. Verwenden Sie einen Diamantkugel zwei 1 mm Löcher an gegenüberliegenden Seiten bohren. </li><li> Schneiden Sie ein 20 mm ² aus einem Blatt der doppelten Klebeband, und mit einer Rasierklinge, schneiden Sie ein 15 x 2 mm Ausschnitt aus dem Zentrum. </li><li> Ziehen Sie eine Seite des Bandes sichern, und halten das Band an der quartz gleiten. Beachten der anderen Seite zu einer funktionalisierten Deckglas. </li><li> Schneiden Sie zwei 20 cm Länge aus Polyethylen-Schlauch und stecken sie in die Löcher in der Quarz-Objektträger. </li><li> Seal die Flusszelle mit 5 Minuten Epoxy-Kleber. </li><li> Wenn der Kleber ausgehärtet ist, prime die Durchflusszelle und Schläuche mit Puffer. </li><li> Ein unterstützter Lipiddoppelschicht kann in diesem Stadium, indem etwa 80 Mikroliter der Liposomen-Suspension in die Kanäle gebildet werden. </li></ol> Viruspartikel Kennzeichnung <ol><li> H3N2 Influenza A (X-31) ist in der Regel für die Fusion-Assay verwendet, aber auch andere Grippestämme und anderen Viren wurden erfolgreich eingesetzt. </li><li> Virus ist mit bis zu zwei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert den Nachweis von hemifusion und Poren-Bildung zu ermöglichen. </li><li> Lösen Sie Sulforhodamin b (SRB) in HNE-Puffer zu einer 20 mM Lösung zu machen. Kombinieren Sie 20 Mikroliter der Lösung des Farbstoffes mit 10 Mikroliter der Virussuspension, und lassen bei Raumtemperatur für 20 Stunden. Während dieser Zeit wird Farbstoff langsam in die Viruspartikel akkumulieren. </li><li> Entfernen Sie die überschüssige Farbe, indem der die Virussuspension durch eine PD-10 Entsalzungssäule. Wenn genug viralem Material verwendet wird, kann ein farbiges Band in der Spalte zu sehen. Dieser Band enthält beschriftet Virus und kann gesammelt, wie es ist, eluiert werden. </li><li> Wenn kein Band zu sehen ist, sammeln 200 Mikroliter Fraktionen und bestimmen, welche Fraktionen enthalten beschriftet Virus durch die Messung 565 nm Absorption auf einem Spektralphotometer. Das Virus sollte in einem Gesamtvolumen von ca. 0,8 ml eluieren. </li><li> Beschriften Sie die Virushülle von Zugabe von 13 Mikroliter einer 2 mM Dimethylformamid (DMF)-Lösung von Octadecyl Rhodamin 110 (Rh110C18), um den SRB gekennzeichnet Virussuspension. </li><li> Rühre die Suspension durch das Anbringen der Röhre in ein Labor-Rotator und lassen für 3 Stunden. </li><li> Purify das Virus von überschüssigem Rh110C18 mit einer PD-10 Entsalzungssäule wie zuvor beschrieben. </li></ol> Mikroskop-Konfiguration Das Experiment basiert auf einem Fluoreszenz-Mikroskop mit einer hohen NA Ölimmersionsobjektiv geeignet für Total Internal Reflection Fluorescence Mikroskopie ausgestattet war. Die 488 und 568 nm Linien aus einem Argon / Krypton-Gas-Laser verwendet, um die Rh110C18 und SRB gekennzeichnet Virus zu erregen. Gleichzeitige Darstellung von jedem Etikett ist durch die Spaltung der grünen und roten Fluoreszenz-Emission mit einem dichroitischen Spiegel erreicht und unabhängig konzentriert die Bilder auf getrennten Hälften eines Elektrons multipliziert CCD-Kamera. Durchführung des Tests Die Ausführung der Fusion Test beinhaltet eine stufenweise Zusammenbau des biochemischen Komponenten innerhalb der Messzelle: Montage der planaren Lipid-Doppelschicht, Docking-markierter Viruspartikel, die Beschichtung der Oberfläche mit Fluorescein und dem Anspringen der Reaktion bei niedrigen pH-Puffer (Abbildung 1A) . <ol><li> Montieren Sie die Flow-Zelle auf dem Mikroskoptisch, und befestigen Sie den Ablaufschlauch auf eine Spritzenpumpe, die bei einem Steuersatz von 40 Mikroliter pro Minute fließen. </li><li> Deaktivieren Sie die Strömungskanäle von überschüssigem Liposomen durch fließendes in 300 Mikroliter HNE. </li><li> Fokus des Mikroskops und stellen Sie die Laserleistung, die Oberfläche mit 350 W / cm 2 von 488 nm-Licht und 70 W / cm 2 von 568 nm Licht zu beleuchten. Wenn Sie mit einem 1,45 NA 60x Ölimmersionsobjektiv sind, stellen Sie den Laser-Intensitäten zu 100 Mikro-Watt und 20 Watt Mikro-bzw.. </li><li> Pump gekennzeichnet Virus (verdünnt 1 / 100) in eine Durchflusszelle. Da das Virus diffundiert an der Bodenfläche des Strömungskanals wird Partikel beginnen zu dem Gangliosid in die Lipid-Doppelschicht eingebaut bleiben. </li><li> Wenn ein geeigneter Dichte angedockt Viruspartikel erreicht wurde (bis etwa 1000 Teilchen pro field of view). Schalten Sie den Zulaufschlauch, um eine Lösung mit zwei Mikrogramm pro Milliliter Fluorescein markiertem Streptavidin. Die markierten Streptavidin binden gekoppelt Lipid-Moleküle in der Doppelschicht Biotin, und schließlich ein schwaches grünen Hintergrund sichtbar sein wird. </li><li> Waschen Sie den Strömungskanal mit 300 Mikroliter HNE. </li><li> Wählen Sie eine Imaging-Bereich, konzentrieren die Lupe und bereiten die CCD-Kamera für zeitversetzt Bildaufnahme. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 100 ms und sammeln Bilder bei einer Rate von 10 Hz. </li><li> Initiieren Fusion durch fließendes in einem sauren Puffer mit 10 mM Natriumcitrat und 140 mM NaCl. Der pH-Wert des Puffers sollte so eingestellt werden unterhalb des kritischen pH-Wert des Virus untersucht werden. X-31 Sicherungen bei pH-Werten unter 5,5. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse Abbildung 1B zeigt Schnappschüsse von Doppelschicht angedockt Virionen vor und während der Fusion. Jeder beugungsbegrenzten Spot stellt eine einzelne Viruspartikel. Rote und grüne Fluoreszenz wurden getrennt auf den oberen und unteren Hälften einer CCD-Kamera abgebildet, so dass die gleichzeitige Beobachtung der Virushülle und Content-Etiketten. Es gibt in der Regel doppelt so viele Punkte in den grünen Kanal im Vergleich zudie rote, und dies spiegelt die geringere Effizienz der Kennzeichnung durch den Inhalt Farbstoff im Vergleich zu den Umschlag-Label. Der grüne Hintergrund-Fluoreszenz von der Oberfläche emittierte gebunden Fluorescein verschwindet bei der Ankunft der Citrat-Puffer und erlaubt die Bestimmung der Startzeit der Fusionsreaktion. Hemifusion Ereignisse werden als platzt der grünen Fluoreszenz als abgeschreckt Rh110C18 in der Virushülle diffundiert durch die hemifusion Stiel erkannt und ist in der planaren Membran verdünnt. Ein nach außen erweitert fluoreszierende Wolke kann um hemifused Teilchen betrachtet werden, zeigt freie Diffusion der Fettsäuren-Acyl verbunden Farbstoff in die planare Membran. Porenbildung ist als der Zerfall von roten Fluoreszenz von SRB in das Innere der viralen Partikel gefangen beobachtet. Die Eröffnung eines Fusionspore ermöglicht der Farbstoff in die wässrige Raum unterhalb der planaren Bilayer und aus der Beobachtung Region zu entkommen. Fluoreszenzintensität Trajektorien für jedes Teilchen, aufgetragen von der integrierten Intensitäten der einzelnen Teilchen, erleichtern die Bestimmung der Ausbeute und Zeiten der hemifusion und Porenbildung (Abb. 1C). Hemifusion und Porenbildung bei Zeiten sind als der Punkt, an dem die maximale Steigung einer Rh110C18 Fluoreszenz platzen oder SRB Signalabfall tritt bestimmt. In einem erfolgreichen Experiment, geben etwa 50 Prozent der Partikel mit Rh110C18 Ertrag Dequenching Signale, und 30 Prozent der SRB markierten Partikel bezeichnet nutzbare Signal. Der Teilchen mit den beiden Farbstoffen markiert, zeigen rund 10 Prozent sowohl Lipid Misch-und Porenbildung Signale. Abb.. 2A-C zeigt die Verteilung der hemifusion und Porenbildung Verzögerungszeiten von einem typischen Experiment. Fig.2D-F zeigt Event-Verteilungen von Ereignissen aus fünf Experimenten unter den gleichen Bedingungen durchgeführt kombiniert. Auch bei einer bescheidenen Anzahl der Beobachtungen ist die Form der Histogramme deutlich. Da jedes Experiment durch den Nachweis des pH-Abfall-Zeit synchronisiert wird, können mehrere Experimente miteinander kombiniert werden und detaillierte Informationen über Rate-Limiting Zwischenschritte erreicht werden kann. <img src="/files/ftp_upload/1484/1484fig1a.jpg" border="0" alt="Abbildung 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1484/1484fig1b.jpg" border="0" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Experimental Design. A) Virus Partikel sind mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen markiert, um die Kinetik der hemifusion und Fusion Porenbildung zu überwachen. Die Fluoreszenz wird durch einen High-NA Mikroskopobjektiv gesammelt und abgebildet auf eine CCD. B) Fluoreszenz Bilder vor (links) und während (rechts) die Verschmelzung der einzelnen Viruspartikel. Obere und untere Hälfte jedes Bild, um die rote und grüne Fluoreszenz entsprechen jeweils der gleichen ~ 50 x 100 mm 2 Fläche der unterstützten Doppelschicht. C) Die Intensität der Fluoreszenz der roten SRB virale Inhalte Tracer (obere Kurve), bieten die grünen Rh110C18 Membran-Farbstoff (Mitte Spur), und die Fluorescein-pH-Sensor (untere Kurve) die genauen Zeiten zwischen pH-Abfall, hemifusion und Fusion vergangen. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1484/1484fig1.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 1 zu sehen. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1484/1484fig2tmb.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Fusion Kinetik der fluoreszenzmarkierten Virus. Verteilungen der Zeit zwischen dem pH-Abfall und hemifusion (A, D) und Porenbildung (B, E) verstrichen sind. Der Aufstieg und Verfall der Verteilungen weisen auf das Vorhandensein von mehreren Zwischenschritten. Der Übergang zwischen hemifusion und Eröffnung einer Fusionspore für einzelne Partikel ist exponentiell verteilt, was auf einen einzigen geschwindigkeitsbestimmenden Schritt. Panels AC zeigen die Ergebnisse einer einzigen Experiment. Panels DF sind aus fünf verschiedenen Experimenten unter den gleichen Bedingungen durchgeführt zusammengestellt. Bitte <a href="/files/ftp_upload/1484/1484fig2.jpg1484">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 2 zu sehen.

<ol>
	<li>Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalisation+of+Si/SiO2+and+glass+surfaces+with+ultrathin+dextran+films+and+deposition+of+lipid+bilayers.">Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers.</a> Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).</li><li>Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+kinetics+of+influenza+virus+membrane+fusion.">Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).</li></ol>

Vorbereitung von Flüssigkeit und kontinuierliche Lipiddoppelschichten kann schwierig sein. Spuren von Verunreinigung materieller oder Oberflächenfehler verhindert Ausbreitung von Doppelschichten. Eine sorgfältige Reinigung und Abscheidung einer gleichmäßigen Schicht von Dextran sind unerlässlich. Längerer Abbildung von Viruspartikeln können Bleichmittel der fluoreszierenden Markierungen oder diese wieder inaktiviert. Photo-Schäden dieser Art ist auch in der Bio-Imaging und Einzelmol...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Corning cover glass squares, 25 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>CLS286525</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fused silica slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Technical Glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining rack</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thomas Scientific</td>
<td>8542E40</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>(3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gelest</td>
<td>SIG5840.1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextran T-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pharmacosmos</td>
<td>5510 0500 4006</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>850375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>850457</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cholesterol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>700000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>B1616</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin, fluorescein conjugate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S-869</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Disialoganglioside GD1a from bovine brain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G2392</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini Extruder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>610000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1 micron polycarbonate membrane filters</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>800309</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 mm drain discs (membrane supports)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>230300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sulforhodamine b sodium salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>S1402</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol</td>
</tr>
<tr>
<td>PD-10 desalting columns</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-0851-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nikon fluorescence microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>TE2000-U</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Coherent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringe Pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>702213</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

method for measurement of viral fusion kinetics at the single particle level

Membranfusion ist ein wesentlicher Schritt bei der Eingabe von umhüllten Viren in die Zellen. Konventionelle Fusion-Assays in der Regel über eine große Anzahl von Fusion Events, so dass es schwierig quantitativ zu analysieren die Reihenfolge der molekularen Schritte. Wir haben eine in vitro entwickelt, zwei-Farben-Fluoreszenz-Assay zur Kinetik der einzelnen Viruspartikel Verschmelzung mit einer Ziel-Doppelschicht auf einer im Wesentlichen Flüssigkeit Unterstützung zu überwachen. Influenza Virus-Partikel sind mit einem grünen lipophilen Fluorophor an die Membran und eine rote hydrophilen Fluorophor an die virale Innenraum Fleck Fleck inkubiert. Wir deponieren ein Gangliosid-haltigen Lipid-Doppelschicht auf der Dextran-funktionalisierten Glasoberfläche einer Durchflusszelle, bebrüten die Viruspartikel auf der planaren Bilayer und Bild der Fluoreszenz einer 100 x 100 pm 2-Gebiet, mit mehreren hundert Partikel, auf einem CCD Kamera. Durch die Abbildung die rote und grüne Fluoreszenz können wir gleichzeitig überwachen das Verhalten der Membran-Farbstoff (grün) und der wässrigen Inhalt (rot) der Partikel. Beim Absenken des pH auf einen Wert unterhalb der Fusion pH-Wert, werden die Partikel mit der Membran verschmelzen. Hemifusion, die Verschmelzung der äußeren Blatt der viralen Membran mit dem äußeren Blatt der Zielmembran, wird sichtbar, wie eine plötzliche Veränderung in der grünen Fluoreszenz eines Teilchens. Bei der anschließenden Fusion der beiden verbleibenden distalen Flugblättern eine Pore wird gebildet werden und die rot-emittierenden Fluorophors in der Viruspartikel wird unter dem Zielmembran freigegeben werden. Diese Veranstaltung wird zu einer Abnahme der roten Fluoreszenz der einzelnen Teilchen. Schließlich berichtet der integrierten Fluoreszenz aus einer pH-sensitiven Fluorophor, dass in der Ziel-Membran eingebettet ist auf den genauen Zeitpunkt der pH-Abfall. Von den drei Fluoreszenz-time Spuren lassen sich alle wichtigen Ereignisse (pH-Abfall-, Lipid-Mischung auf hemifusion, Content-Mischen nach Porenbildung) jetzt auf einfache Weise und für jedes Teilchen einzeln entnommen werden. Durch das Sammeln der verstrichenen Zeit für die verschiedenen Übergänge für viele einzelne Partikel in Histogramme, können wir die Lebensdauer der entsprechenden Zwischenprodukte. Auch versteckte Zwischenprodukte, die nicht über eine direkte Fluoreszenz beobachtbar können direkt visualisiert werden aus diesen Histogrammen.

Watch this Scientific Journal Video about Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level at JoVE.com

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Wir präsentieren einen<em&gt; In vitro,</em&gt; Zwei-Farben-Fluoreszenz-Assay auf die Fusion einzelner Viruspartikel mit einer Flüssigkeit Ziel Doppelschicht zu visualisieren. Durch die Kennzeichnung Viruspartikel mit Fluorophoren, die unterschiedlich Fleck der viralen Membran und im Inneren sind wir in der Lage, die Kinetik der hemifusion und Porenbildung zu überwachen.

Methode zur Messung des Viral Fusion Kinetics auf der Single Particle Stufe

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

method-for-measurement-viral-fusion-kinetics-at-single-particle

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K Aufrufe.  Harvard Medical School. Wir präsentieren einen In vitro, Zwei-Farben-Fluoreszenz-Assay auf die Fusion einzelner Viruspartikel mit einer Flüssigkeit Ziel Doppelschicht zu visualisieren. Durch die Kennzeichnung Viruspartikel mit Fluorophoren, die unterschiedlich Fleck der viralen Membran und im Inneren sind wir in der Lage, die Kinetik der hemifusion und Porenbildung zu überwachen.

Serie: Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large macromolecular complexes. Compared to X-ray crystallography, it has some unique advantages. First, single particle EM reconstruction does not need to crystallize the protein sample, which is the bottleneck in X-ray crystallography, especially for large macromolecular complexes. Secondly, it does not need large amounts of protein samples. Compared with milligrams of proteins necessary for crystallization, single particle EM reconstruction only needs several micro-liters of protein solution at nano-molar concentrations, using the negative staining EM method. However, despite a few macromolecular assemblies with high symmetry, single particle EM is limited at relatively low resolution (lower than 1 nm resolution) for many specimens especially those without symmetry. This technique is also limited by the size of the molecules under study, i.e. 100 kDa for negatively stained specimens and 300 kDa for frozen-hydrated specimens in general.
For a new sample of unknown structure, we generally use a heavy metal solution to embed the molecules by negative staining. The specimen is then examined in a transmission electron microscope to take two-dimensional (2D) micrographs of the molecules. Ideally, the protein molecules have a homogeneous 3D structure but exhibit different orientations in the micrographs. These micrographs are digitized and processed in computers as "single particles". Using two-dimensional alignment and classification techniques, homogenous molecules in the same views are clustered into classes. Their averages enhance the signal of the molecule's 2D shapes. After we assign the particles with the proper relative orientation (Euler angles), we will be able to reconstruct the 2D particle images into a 3D virtual volume.
In single particle 3D reconstruction, an essential step is to correctly assign the proper orientation of each single particle. There are several methods to assign the view for each particle, including the angular reconstitution1 and random conical tilt (RCT) method2. In this protocol, we describe our practice in getting the 3D reconstruction of yeast exosome complex using negative staining EM and RCT. It should be noted that our protocol of electron microscopy and image processing follows the basic principle of RCT but is not the only way to perform the method. We first describe how to embed the protein sample into a layer of Uranyl-Formate with a thickness comparable to the protein size, using a holey carbon grid covered with a layer of continuous thin carbon film. Then the specimen is inserted into a transmission electron microscope to collect untilted (0-degree) and tilted (55-degree) pairs of micrographs that will be used later for processing and obtaining an initial 3D model of the yeast exosome. To this end, we perform RCT and then refine the initial 3D model by using the projection matching refinement method3.

This article describes a standard method to get a three-dimensional (3D) reconstruction of biological macromolecules using negative staining electron microscopy (EM). In this protocol, we explain how to get the 3D structure of the Saccharomyces cerevisiae exosome complex at medium resolution using the random conical tilt reconstruction method (RCT).

Single Particle Electron Microscopy Rekonstruktion der Exosom Complex Mit der Random-konische Tilt-Methode

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

Forschung

Biologie

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

Die Messung der Kinetik der mRNA Transkription in einzelnen lebenden Zellen

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

Studieren Proteolyse von Cyclin B an der Single Cell Level in Whole Cell Populationen

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Here we employ FISH methodology to track LINE-1 retrotransposition at the single nuclei level in chromosome spreads of HepG2 cell lines stably expressing synthetic LINE-1.

Analyse von LINE-1-Retrotransposition im Einzel Nucleus Ebene

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Open-Source-Einzelpartikelanalyse für Super Resolution Mikroskopie mit VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

Fortgeschrittene Mikroskopiertechniken der konfokalen zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen und die Kinetik bei DNA-Läsionen

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, implantation of transgenic cells and tiny optical sensors. However, intravenous microinjections into small animals, which are mostly used in biological and veterinary laboratories, are very difficult and require trained personnel. Herein, we demonstrate a robust and efficient method for the introduction of microparticles into the circulatory system of adult zebrafish (Danio rerio) by injection into the fish kidney. To visualize the introduced microparticles in the vasculature, we propose a simple intravital imaging technique in fish gills. In vivo monitoring of the zebrafish blood pH was accomplished using an injected microencapsulated fluorescent probe, SNARF-1, to demonstrate one of the possible applications of the described technique. This article provides a detailed description of the encapsulation of pH-sensitive dye and demonstrates the principles of the quick injection and visualization of the obtained microcapsules for in vivo recording of the fluorescent signal. The proposed method of injection is characterized by a low mortality rate (0-20%) and high efficiency (70-90% success), and it is easy to institute using commonly available equipment. All described procedures can be performed on other small fish species, such as guppies and medaka.

This article demonstrates the principles of a quick, minimally invasive injection of fluorescent microparticles into the circulatory system of small fishes and the in vivo visualization of the microparticles in fish blood.

Einfache und effektive Verwaltung und Visualisierung von Mikropartikeln im Herz-Kreislauf-System von kleinen Fischen mit Niere Injektion

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &#955; DNA at the Single Molecule Level

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. In single molecule assays for studying DNA-protein interactions, there are two important factors for consideration: the DNA substrate with enough length for easy observation and labeling a protein with a suitable fluorescent probe. 48.5 kb &#955; DNA is a good candidate for the DNA substrate. Quantum dots (Qdots), as a class of fluorescent probes, allow long-time observation (minutes to hours) and high-quality image acquisition. In this paper, we present a protocol to study DNA-protein interactions at the single-molecule level, which includes preparing a site-specifically modified &#955; DNA and labeling a target protein with streptavidin-coated Qdots. For a proof of concept, we choose ORC (origin recognition complex) in budding yeast as a protein of interest and visualize its interaction with an ARS (autonomously replicating sequence) using TIRFM. Compared with other fluorescent probes, Qdots have obvious advantages in single molecule studies due to its high stability against photobleaching, but it should be noted that this property limits its application in quantitative assays.

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &amp;#955; DNA at the Single Molecule Level

Here, we present a protocol to study DNA-protein interactions by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) using a site-specifically modified &#955; DNA substrate and a Quantum-dot labeled protein.

Visualisierung der Interaktion zwischen dem Qdot-markierten Protein und ortspezifisch modifizierte λ-DNA auf der Einzelmolekül-Ebene

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell motility, or cell signaling. The green algae Chlamydomonas reinhardtii has proven to be an insightful model in the study of centriole architecture, function, and protein composition. Despite great advances toward understanding centriolar architecture, one of the current challenges is to determine the precise localization of centriolar components within structural regions of the centriole in order to better understand their role in centriole biogenesis. A major limitation lies in the resolution of fluorescence microscopy, which complicates the interpretation of protein localization in this organelle with dimensions close to the diffraction limit. To tackle this question, we are providing a method to purify and image a large number of C. reinhardtii centrioles with different orientations using super-resolution microscopy. This technique allows further processing of data through fluorescent single-particle averaging (Fluo-SPA) owing to the large number of centrioles acquired. Fluo-SPA generates averages of stained C. reinhardtii centrioles in different orientations, thus facilitating the localization of distinct proteins in centriolar sub-regions. Importantly, this method can be applied to image centrioles from other species or other large macromolecular assemblies.

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

We have developed a strategy to purify and image a large number of centrioles in different orientations amenable for super-resolution microscopy and single-particle averaging.

Isolation und Fluoreszenz-Imaging für Single-Particle-Rekonstruktion der Chlamydomonas Centriolen

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...