JB ist ein CRUK klinischen Kollegen, AS ist ein Wellcome Trust Doktorand, der SR-Labor wird von einem Senior Research Fellowship CRUK (C99667/A12918) finanziert. Diese Arbeit wurde von zwei Wellcome Trust Strategische Awards (097945/B/11/Z und 095931/Z/11/Z) unterstützt.

1. Zellkultur und Behandlung <ol><li> Sammeln Sie die Reagenzien und Geräte in Tabelle 1 zu Kultur menschliche Osteosarkom (U2OS-Zellen) aufgeführt. Bereiten Sie alle Reagenzien und führen alle Gewebekulturtechniken in der Laminar-Air-Flow-Haube, um die Sterilität zu gewährleisten </li><li> Vorbereitung des Kulturmediums, wie folgt: In 50 ml FCS, 5 ml L-Glutamin und 5 ml Penicillin / Streptomycin auf das DMEM, um Endkonzentrationen von 10% (FCS) zu erreichen, 2 mM (L-Glutamin), 50 U / ml ( Penicillin) und 50 U / ml (Streptomycin). Warm das Kulturmedium bei 37 ° C in einem Wasserbad. </li><li> Bereiten Sie die Zellen für die Behandlung: <ol><li> Sterilisieren mehrere Deckgläser in 70% Ethanol, an der Luft trocknen und legen Sie ein auf dem Boden der sechs 3,5 cm-Platten. </li><li> Tauchen Sie die Deckgläser in 2 ml erwärmt kompletten DMEM (37 ° C), nach unten drücken mit den Deck Pinzette, um sicherzustellen, dass sie auf den Boden der Wells haften bleiben. </li><li> Lösen Sie die U2OS Zellen aus ihrem Gewebe KultAbbildung Platte durch einmaliges Waschen mit 3 ml PBS, 4 ml Aufbringen erwärmt 0,05% Trypsin-EDTA (1%) und Inkubation bei 37 ° C für 7 min. </li><li> Die Zellen in 6 ml DMEM komplett erwärmt, um das Trypsin-EDTA zu inaktivieren und rechnen mit einer Zählkammer. </li><li> Plate 2 x 10 5 Zellen zu jedem der 3,5 cm-Platten in Punkt 1.3.1 vorbereitet. Schütteln Sie die Platte, um eine noch Zellverteilung zu gewährleisten. Damit sich die Zellen vor der Behandlung über Nacht anhaften. </li></ol></li><li> Behandeln Sie die Zellen, indem vier 3,5-cm-Platten in die Hypoxie-Workstation und lassen Sie die anderen zwei 3,5-cm-Platten im Brutschrank bei 37 ° C in normalen Sauerstoffbedingungen. Seien Sie bereit, um die RNA-Assay Kennzeichnung unter Bedingungen behandelt (in der Hypoxie-Kammer für die Hypoxie-behandelten Zellen) 1 h beginnen, bevor der Hypoxie Behandlung endet. </li><li> Expose Zellen auf Hypoxie für 1 h 15 min, 1 h 30 min, 2 h und 24 h. Diese Zeitpunkte sind flexibel und benutzer bestimmt. </li><li> Verwenden Sie eine normoxic 3,5 cm-Platte als positive Kontrolle und einer normoxischen 3,5 cm-Platte mit Actinomycin D (10 ug / ml Endkonzentration) für 4 Stunden als Negativkontrolle behandelt. Actinomycin D ist ein Inhibitor der globalen RNA-Synthese. </li></ol> Hinweise: Hoechst 33342 ist ein bekanntes Mutagen. DMSO ist bekannt, dass das Eindringen von organischen Molekülen in das Gewebe zu erleichtern. NaOH ist ätzend. HCl ist ätzend. Para ist sehr giftig für alle Tiere und können zum Tod beim Menschen verursachen. Triton X-100 kann zu Hautreizungen führen durch direkten Kontakt. Actinomycin D ist, wenn sie in Kontakt mit Haut oder Verschlucken giftig. Ergreifen Sie geeignete Vorsichtsmaßnahmen, wenn alle gefährlichen Chemikalien. 2. Click-iT Assay <ol><li> Sammeln Sie die folgenden Reagenzien, die zusätzlich zu dem Click-iT-Assay-Kit erforderlich sind: Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) pH 7,2 bis 7,6, 3,7% Paraformaldehyd (PFA) in PBS, 1% Triton X-100 In PBS, entionisiertem Wasser (dH 2 O), Dimethylsulfoxid (DMSO), 10 M Natriumhydroxid (NaOH) und 37% ige Salzsäure (HCl); Optional - pH-Indikator-Streifen. </li><li> Eine frische PFA-Stammlösung, bevor das Click-iT Reaktion wie folgt: <ol><li> Setz 1,85 g PFA, 3,5 ml dH 2 O und 10 ul von10 M NaOH in 50 ml Falcon-Röhrchen. Kochen Sie 300 bis 400 ml H 2 O in einem großen Becher in der Mikrowelle, ein Wasserbad herstellen und diese in einer Abzugshaube. </li><li> Legen Sie die 50 ml Falcon in das Wasserbad und vorsichtig rühren für 10 min, in regelmäßigen Abständen die Freigabe der Deckel, bis das PFA gelöst hat. </li><li> Spritze die PFA-Lösung über einen 0,2 um Filter in einen anderen 50 ml-Falcon-Röhrchen, was zu einer 37% igen Lösung. </li><li> Diese verdünnte durch Zugabe von PBS 10x und den pH-Wert auf 6,8 zu bringen durch Zugabe von 12 ul konzentrierter HCl. Option: Bestätigen Sie den richtigen pH-Indikatorstreifen mit den in der Abzugshaube. </li><li> Verwenden Sie sofort oder zu speichern overnight bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die Stammlösungen der RNA-Imaging-Kit wie folgt: <ol><li> In 373 ul dH 2 O auf die Komponente A, was zu einer Stammlösung von 100 mM der EU. Bei -20 ° C für bis zu einem Monat. </li><li> In 85 ul DMSO zu Komponente B (Alexa Fluor 594) und mischen durch Pipettieren oder Vortexen. Bewahren Sie sowohl bei -20 ° C bis zu einem Jahr. </li><li> 2 ml dH 2 O, um die Komponente E um einen 10X Lösung der RNA-Imaging-Kit Reaktionspuffer Additiv erstellen. Lagerung bei -20 ° C für bis zu einem Jahr, zu verwerfen, wenn Lösung entwickelt eine braune Farbe. </li></ol></li><li> Markierung von Zellen mit der EU: Bereiten Sie eine Lösung von 2X Arbeits EU von der 100 mM Lager in Schritt 2.3 in vorgewärmten Vollmedium (37 ° C) zubereitet Führen Sie den Rest dieses Schritt und Schritt 2.5 in der Hypoxie-Kammer für Zellen mit Hypoxie behandelt. . auf 1X Verdünnen durch Zugabe eines gleichen Volumens von 2X Arbeitslösung in den Medien containing Zellen. Inkubation für 1 h unter Behandlung Zellkulturbedingungen. </li><li> Handy Fixation: Waschen Sie jede Vertiefung einmal mit PBS und 1 ml der 3,7% PFA Lager in Schritt 2.2 unter der Behandlung Bedingungen hergestellt. Inkubation: 15 min unter Behandlungsbedingungen. Die mit Hypoxie behandelten Proben kann von der Hypoxie Kammer an dieser Stelle entfernt werden. Entfernen Sie das Fixiermittel und Waschvorgang noch einmal mit PBS (Achten Sie darauf, von PFA entsorgen Abfall verantwortungs). Führen Sie die nächsten Schritte bei Raumtemperatur. </li><li> Permeabilisierungs: Entfernen der Waschlösung und 1 ml 1% Triton X-100 in PBS in jede Vertiefung. Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Permeabilisierung Puffer-und Waschvorgang noch einmal mit PBS. </li><li> Markierten RNA-Detektion: <ol><li> Eine frische 1X Arbeitslösung von RNA-Imaging-Kit Reaktionspuffer Additiv durch Verdünnen der 10X-Lösung (in Schritt 2.3 vorbereitet) 1:10 in dH 2 O. </li><li> Bereiten Sie die Imaging-RNA KitReaktion Cocktail nach Tabelle 2 für den Einsatz unmittelbar nach der Herstellung. </li><li> Entfernen Sie die Waschlösung und fügen Sie 500 ul der RNA-Imaging-Kit Reaktion Cocktail zu jeder Probe. Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur, vor Licht schützen. </li><li> Entfernen Sie die Imaging-RNA Kit Reaktionscocktail und einmal mit 1 ml RNA-Imaging-Kit Reaktionsspülung Puffer (Komponente F) waschen, entfernen Sie dann die RNA-Imaging-Kit Reaktionsspülung Puffer. </li></ol></li><li> Optional Multiplex-Reaktion: Führen Sie die zusätzlichen Antikörpermarkierung der Proben an dieser Stelle nach den Empfehlungen des Herstellers. </li><li> DNA-Färbung: Wash Proben mit PBS entfernen Sie dann die Waschlösung. Verdünnen Sie die Hoechst 33342 (Komponente G) 1:1000 in PBS. 1 ml der verdünnten Hoechst 33342 in jede Vertiefung und Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur, vor Licht schützen. Entfernen Sie die Hoechst 33342-Lösung und waschen die Zellen zweimal mit PBS. Entfernen Sie den Wasch solution und fahren Sie mit der Lichtmikroskopie. </li></ol> 3. Lichtmikroskopie <ol><li> Berg Deckgläser: <ol><li> Platz 10 ul Montagemedium auf der Mitte einer Standardobjektträger. </li><li> Legen Sie das Deckglas mit der Zellseite nach unten auf der Mitte des Objektträgers, um den aliquoten Eindeckmedium abzudecken. Achten Sie auf die Erzeugung von Blasen in der Montagemedium zu vermeiden, da dies die nachfolgende Bild Erwerb verschleiern. </li><li> Kleben Sie das Deckglas auf dem Objektträger durch die Anwendung klaren Nagellack auf ihren Umfang. Lassen Sie für 5 min bei Raumtemperatur trocknen. Vor Licht schützen. Die Proben können bei -20 ° C gelagert werden folgende Montage. </li></ol></li><li> Bildaufnahme: Erfassung von Bildern mit einem Weitfeldmikroskop in der Lage, Fluoreszenz-Detektion. Ungefähre Fluoreszenz / Anregungsemissionsmaxima für die Alexa Fluor-Farbstoff Hoechst 33342 an DNA gebunden sind in Tabelle 3 gezeigt. </li><li> Perform Imaging mit einem 40X/1.30 NA Ölimmersion und die Aufnahmen mit einer gekühlten CCD-Kamera. </li></ol> 4. Datenanalyse <ol><li> Entfalten, Bilder mit Hilfe von Bildverarbeitungssoftware (siehe Materialien Tabelle) vor dem Import in die OMERO-Client. Normalisieren Rendering-Einstellungen für alle Bilder im gleichen Experiment im Mikroskopbild Visualisierungs-und Analyse-Software, indem die Rendering-Einstellungen von Steuer normoxischen Zellen zu allen anderen Bedingungen. </li><li> Verwenden Sie die Region of Interest (ROI)-Werkzeug in der Mikroskopbild Visualisierungs-und Analyse-Software (siehe Materialien Tabelle), um Kerne von jedem Bild zu wählen. Erhalten mittleren Intensitäten für jedes ROI und der Mittelwert und Standardabweichung für jeden Zustand, der durch die Wahl der Option Intensitätsanalyse, einschließlich einer Zahl zwischen 30 bis 50 Zellen. </li><li> Construct Streudiagramme mit Hilfe eines Daten Grafik-Software (siehe Materialien Tabelle) durch Auftragen alle einzelnen Mittelintensitätswerte in Schritt 4,2 t erhalteno reflektieren Variabilität zwischen den Zellen unter jeder Bedingung. Alternativ bauen Balken, den Mittelwert plus Standardabweichung Intensität der entstehenden RNA darstellen. </li></ol>

<ol>
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JRS ist Gründer von Glencoe Software, Inc., einem Open-Source-US-Handelsgesellschaft, die OMERO beiträgt.

Wir haben unser Verwendung eines RNA-Sichtbarmachungsausrüstung, um die Effekte der Hypoxie auf die RNA-Synthese in Osteosarkom (U2OS-Zellen) beschrieben untersuchen. Diese Technik ist relativ einfach und liefert Daten über die globale Transkriptions auf Einzelzellebene. Wir modifizierten die herkömmlichen Protokoll für dieses Kit, um die Kennzeichnung in einer Hypoxie Kammer zu integrieren. Nach unserer Kenntnis ist dies der erste Bericht über die Verwendung dieser Technik, um Änderungen in der RNA-Synthese in Hypoxie zu messen. Die RNA Belichtungskit wir verwendeten, ist geeignet für Experimente in Hypoxie, da es keine radioaktiven Isotope erfordert und technisch kompatibel mit den Einschränkungen, die in einer kontrollierten Atmosphäre Workstation. Häufige Probleme mit dieser Technik Sorge effiziente Fixierung und Kennzeichnung der Probe. Es ist äußerst wichtig, dass die PFA für die Festsetzung des Proben ist frisch und die Waschschritte, die das &quot;Klick&quot;-Reaktion folgen, werden als gering beschrieben, um die Hintergrundfärbung der Probe zu gewährleisten durchgeführt. Wenn bintergrund Fluoreszenz wird zu einem Problem, wird empfohlen, mit 1 ml RNA Belichtungskit Reaktionsspülung Puffer nach dem Schritt 2.7.4 einmal zu waschen. Die hier genannten RNA-Imaging-Kit stellt einen bedeutenden Fortschritt in der RNA-Imaging-Technologie in Bezug auf die Benutzerfreundlichkeit und die Spezifität und die Geschwindigkeit der Reaktion. Diese Technik wird hauptsächlich durch die Zeit, die für die Probe kenn beschränkt. Die RNA-Imaging-Kit erfordert eine Kennzeichnung 1 Stunde Zeit, dass die Prüfung der schnellen Veränderungen in der globalen RNA, die normalerweise in diesem Zeitraum auftreten würde, verhindert. Es ist aus diesem Grund unsere ersten Zeitpunkt auf 1 Stunde und 15 Minuten beschränkt. Die Technik ist mit einigen anderen Einschränkungen, die weitgehend betreffen Kompatibilität mit anderen fluoreszierenden Markern Reagens, zum Beispiel, ist diese RNA Abbildungssatz nicht kompatibel mit Phalloidin-Färbung verbunden. Alle bestehenden Ansätze des Studiums RNA-Synthese in Zellen auf Einbau von modifizierten Nucleoside in der Basisnaszierende RNA und die Detektion von Etiketten integriert mit anderen Mitteln. Die bahnbrechenden Ansatz zur Verwendung von radioaktiv markierten RNA-Vorstufen gefolgt von der Detektion mit Autoradiographie basiert. Diese Methode führte zu einer Entdeckung von Zellzyklus-Stadien und andere wichtige Erkenntnisse; aber es hat eine Menge Nachteile, wie die Schwerfälligkeit der Radioaktivität Arbeit, lange Belichtungszeiten und Bilder mit niedriger Auflösung von 6 Autoradiographie. Der nächste Vorteil auf dem Gebiet ausgenutzt mittels Immun die Notwendigkeit der Radioaktivität zu entfernen. RNA wurde durch Einbau von BrU gefolgt von Immun Nachweis markiert. Jedoch effiziente Antikörperbindung erforderlich Nukleinsäure Denaturierung, um Zugang zu DNA oder RNA, die den Verlust der Zellmorphologie hervorgerufen und beschädigt die Epitope von vielen Proteinen, die Verhinderung der weiteren Detektion mit Fluoreszenz-markierten Antikörpern 13 zu verbessern. Die Einführung von &quot;Klick-Chemie&quot;-Technologie vereinfacht die Erkennung und Schritt ter Verfahren im Vergleich zu Autoradiographie und Immunchemie. Die Technologie basiert auf Azid-Alkin Huisgen-Cycloaddition in dem terminalen Alkin 5-ethyniluridine bindet mit Azid mit dem Fluorophor in Anwesenheit von Cu (I) konjugiert basiert. Die Reaktion ist spezifisch, schnell, keine zusätzlichen Schritte erfordern und ist mit immunchemischen Nachweis von anderen Zellbestandteile leicht kompatibel. Unter Verwendung dieser RNA-Imaging-Technologie haben wir gezeigt, dass Zellen in der gleichen Mono Bevölkerung, verschiedene RNA-Syntheserate in Reaktion auf Hypoxie. Wir beschränken unser Experiment, um die Wirkung von nur RNA-Produktion zu untersuchen; es ist jedoch ganz mit dieser RNA Belichtungskit möglich, modifizierte, zusätzliche Multiplex-Reaktionen, die für eine komplexe Analyse der RNA-Produktion erlauben zuführen. Beispielsweise sekundäre Färbung mit einem spezifischen Marker für aktive Transkription wie Ebenen phosphorylierten RNA-Polymerase II oder Komponenten des Translations Antikörpertion Maschinen, um eine Anzeige der Menge des neu erzeugten RNA in ein Protein umgewandelt wird geben sind möglich. Zusätzliche Proteine ​​wie Actin, einem Protein, das nicht wesentlich mit Hypoxie ändern sollte, könnte als zusätzliche Kontrolle getestet werden. Ferner könnten verschiedene Zelltypen getestet werden, da es sehr wahrscheinlich ist, dass unterschiedliche Zellen unterschiedliche RNA-Syntheseraten und sogar verschiedene Reaktionen auf Hypoxie. Verwendung dieser RNA Belichtungskit ist ganz einfach die Schritte vorgesehen sind, wie beschrieben, durchgeführt. Kritische Schritte im Protokoll beinhalten Zelle Beschichtung, Zell Fixierung und Färbung und Bildaufnahme. Es ist wichtig, um die Zellen in der beschriebenen Dichte Platte bei Experimenten an Über-oder Unterfluss zu verhindern, welche das Ergebnis wesentlich beeinflussen. Es ist auch wichtig, um frisches Fixiermittel zu verwenden, die die bestmögliche &quot;Momentaufnahme&quot; der Zelle genommen und dafür Sorge zu tragen, wenn Waschen der Zellen nach Färbung, die bac reduzierenkground auf ein Niveau, das für eine effiziente Analyse akzeptabel ist. Schließlich ist das Verfahren zur Bildaufnahme von entscheidender Bedeutung, um Bilder, die von einer Qualität gut genug für eine nachfolgende Analyse zu erzielen. Wir empfehlen die Verwendung der besten Lichtmikroskop zur Verfügung, um Proben optisch wie dem Mikroskop in diesem Protokoll, das in den meisten forschungsintensiven Zentren weltweit ist verwendet zu untersuchen.

Hypoxie (niedriger Sauerstoffspannungen) tritt auf, wenn die normale Sauerstoffversorgung eines Gewebes ist gestört. Umwelt Sauerstoff ist sowohl ein Nährstoff-und ein Signalmolekül, die wichtige Hinweise für viele Zelltypen. Änderungen der Umgebungssauerstoff durch eine Gruppe von Dioxygenasen, die die Aktivität eines essentiellen Transkriptionsfaktor-Familie wie die Hypoxie-induzierbaren Faktoren (HIFs) bekannten Steuer erfaßt. Die HIFs aus zwei Untereinheiten, α und β besteht. Es gibt drei bekannte Isoformen von HIF-α (1, 2, 3) und mehrere Spleißvarianten von HIF-1β. HIF-1β konstitutiv exprimiert wird und nicht durch Umgebungssauerstoffgehalt 1 geregelt. Die HIF-α Familienmitglieder werden dynamisch durch eine Klasse von Prolyl-Hydroxylasen (PHDs) geregelt und die Hemmung von HIF-Faktor (FIH); die beide von Sauerstoff als Co-Faktor, um die Hydroxylierung von HIF-α 2,3 katalysieren. In Normoxie die HIF-α Familienmitglieder hydroxyliert und proteosom getaggtal-Abbaus durch die E3-Ligase, von Hippel Lindau (VHL). In Hypoxie die PHDs und FIH sind inaktiv oder haben eine verminderte Aktivität. Die HIF-α-Isoformen stabilisiert, bilden ein Heterodimer mit HIF-1β, und bewirken die Transkription von Genen, die die zelluläre Antwort auf die hypoxische Umgebung (1A) bereitzustellen 4. Gegenwärtige Techniken für die RNA-Analyse konzentrieren sich auf die Quantifizierung der gemittelten Werte in einer gegebenen Zellpopulation. Zellen auf einer hypoxischen Stimulus durch Initiieren der Transkription einer Vielzahl von Genen, die sie zu ihrer feindlichen Umgebung 5 anpassen kann. Allerdings besteht häufig Hypoxie als Gradient und Zellen in einer hypoxischen Umgebung sind nicht Gegenstand einer einheitlichen hypoxischen Reiz. Wir beschreiben eine Implementierung der Click-iT RNA Imaging-Kits in einer Sauerstoff gesteuert Workstation zur globalen RNA-Synthese an Einzelzellebene in Hypoxie zu untersuchen. Die RNA-Imaging-Kit verwendet eine einlkyne-modifizierten Nukleosid-, 5-Ethinyl Uridin (EU) und chemoselektiven Ligation, um den Nachweis der globalen RNA-Synthese zeitlich und räumlich in Zellen und Geweben 6 zu ermöglichen. Kurz gesagt werden Zellen mit Hypoxie und in Gegenwart von EU kultiviert behandelt. Sie werden dann fixiert und permeabilisiert und die EU-Eingliederung in entstehenden RNA wird durch chemoselektiven Ligation der EU mit einem Azid enthaltenden Farbstoff nachgewiesen. Ein typischer Arbeitsablauf für diese Reaktion ist in 1B gezeigt. Wir nutzten die RNA-Bildgebung Kit RNA-Synthese an Einzelzellebene, die von einer Behandlung mit Hypoxie führte zu untersuchen. Die geringe Größe des Alkins Tag ermöglicht einen effizienten Einbau der modifizierten Nukleosid in RNA spezifisch. Die chemoselektiven Ligation oder &quot;Klick&quot;-Reaktion ist hoch effizient, schnell und spezifisch 10.07. Alle Reaktionskomponenten sind bioinert und die Reaktion erfordert keine extremen Temperaturen oder Lösungsmittel. Die Klick-Reaktion negiertdas Erfordernis für herkömmliche radioaktive Markierung und eine direkte Visualisierung der Ergebnisse, da der Ausgang ist Licht. Darüber hinaus kann die Nachweismolekül leicht eindringen komplexen Proben Berücksichtigung Multiplexanalyse mit Antikörpern zum Nachweis von RNA-interaktiven Proteinen. Diese RNA-Bildgebung Test ist mit organischen Farbstoffen einschließlich Alexa Fluor und Fluorescein (FITC) kompatibel. Wir messen die Veränderung der RNA-Synthese nach der Behandlung der Zellen mit einer Umsetzung der offenen Mikroskopie-Umgebung für Remote-Objekte (OMERO). OMERO ist Open-Source-Software, verfügbar unter <a href="http://openmicroscopy.org/">http://openmicroscopy.org/</a> . Dieses Mikroskop Bildvisualisierung und Analyse-Software ermöglicht den Zugriff auf und die Verwendung von einer Vielzahl von biologischen Daten, einschließlich der Verwaltung von mehrdimensionalen, heterogenen Datensätzen. Die Client-Anwendung ermöglicht Remote-Visualisierung und Analyse komplexer biologischer Bilddaten 11;wir haben es genutzt, um die visuellen Veränderungen in der globalen und Einzelzelle RNA-Synthese zu quantifizieren. Diese Daten und die erforderlich ist, um unsere RNA Imaging Experiment analysieren Schritte mit dieser Mikroskopbild Visualisierungs-und Analyse-Software finden Sie weiter unten. Wir sahen uns an Veränderungen in der globalen RNA-Synthese nach der Behandlung menschlicher Osteosarkom (U2OS-Zellen) mit Hypoxie für bis zu 24 Stunden. Bei allen Bedingungen, die wir erfasst Zelle zu Zelle Änderung in der Ebene der RNA-Produktion. Kurze Zeiten von Hypoxie Exposition führte zu keinen signifikanten Änderungen in der Höhe der entstehenden RNA in den Zellen führen. Belichtung und 24 Stunden Hypoxie führte jedoch zu einem signifikanten Anstieg der Menge an RNA, die in Zellen produziert. Die meisten der zellulären Reaktionen auf Hypoxie nach längeren Belichtungsperioden, wie 4 bis 24 Stunden gemessen. Allerdings sind einige Mechanismen, die viel früher gelegt, zum Beispiel; NF-kappaB Aktivierung erfolgt innerhalb von 5-15 min der Hypoxie Exposition 12. Untersuchung kürzere hypoxia Belichtungszeiten ist daher gerechtfertigt und könnte von komplizierter Reaktionen wie Zellzyklus und Apoptose ablenken.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1313px;" width="1314">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">U-2 OS Primary Cells</td>
			<td style="width:92px;">European Collection of Cell Cultures</td>
			<td align="right" style="width:115px;">92022711</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:703px;"><a href="http://www.hpacultures.org.uk/products/celllines/generalcell/search.jsp?searchtext=u2os&amp;dosearch=true">http://www.hpacultures.org.uk/products/celllines/generalcell/search.jsp?searchtext=u2os&#38;dosearch=true</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">14190094</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/14190094">http://products.invitrogen.com/ivgn/product/14190094</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">41966029</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/41966029?ICID=search-41966029">https://products.invitrogen.com/ivgn/product/41966029?ICID=search-41966029</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FCS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">10270106</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/10270106?ICID=search-10270106">http://products.invitrogen.com/ivgn/product/10270106?ICID=search-10270106</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE17-603E</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/antibiotics-antimycotics/penicillin-streptomycin.aspx">http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/antibiotics-antimycotics/penicillin-streptomycin.aspx</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-605E</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/cell-culture-reagents/l-glutamine-200mm.aspx">http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/cell-culture-reagents/l-glutamine-200mm.aspx</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.05% Trypsin-EDTA (1%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300062">http://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300062</a></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Hypoxia Chamber</td>
			<td>Ruskinn</td>
			<td>InVivo2 300</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.ruskinn.com/products/invivo2300">http://www.ruskinn.com/products/invivo2300</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Click-iT assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C-10329/C10330</td>
			<td></td>
			<td>http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catDisplayStyle&#38;catKey=601107&#38;filterDispName=Nascent%2BRNA%2BDetection%2B%2526amp%253B%2BCapture%2BKits&#38;_bcs_=H4sIAAAAAAAAAMWP3WrDMAyFn8Y3MwtOUrrcZg0dpVAGZbs3jpYIEjvYSoLffvK6jbKV3Q6EhP44%0A37nPhaqevWtnQ0GKYivP4Bc0EP6Y90STKGtR7DnWdc3QLkjedWAz40YeBiTgMgdOYDn1boSsp3Hg%0Ad1GUKVRFfobUqwfFJVc5H1aFyu%2B4O%2BJFV48s9SjrEHT8pT19Av4EKOtK8RqXzn4BvJw56RY9GEqr%0A7wdR7s3YirI5vD6djKYGwzTouNMEnfOREXh4hMgXie2a%2F00P4aYBLsV2czFyms0AaGRtsJUNEOuj%0As9fWrB5iwCCT5X92%2BEF9y%2BI7x9UoYCgCAAA%3D</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>76240</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/76240?lang=en&amp;region=GB">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/76240?lang=en&#38;region=GB</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X-100</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/x100?lang=en&amp;region=GB">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/x100?lang=en&#38;region=GB</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10M NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/72068?lang=en&amp;region=GB">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/72068?lang=en&#38;region=GB</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37% HCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20252.335</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://uk.vwr.com/app/search/Search?keywords=%2720252.244%27%20%2720252.290%27%20%2720252.324%27%20%2720252.335%27%20%2720252.368%27%20%2720252.420%27%20%2720252.448%27%20%2720252.980%27&amp;searchOp=or">https://uk.vwr.com/app/search/Search?keywords=%2720252.244%27%20%2720252.290%27%20%2720252.324%27%20%2720252.335%27%20%2720252.368%27%20%2720252.420%27%20%2720252.448%27%20%2720252.980%27&#38;searchOp=or</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VectaShield Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1400</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=1483">http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=1483</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Actinomycin D</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9415</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9415?lang=en&amp;region=GB">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9415?lang=en&#38;region=GB</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Deltavision Core Microscope</td>
			<td>Applied Precision</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.appliedprecision.com/">http://www.appliedprecision.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">softWoRx [Refered to in text as image processing software]</td>
			<td>Applied Precision</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.api.com/softworx.asp">http://www.api.com/softworx.asp</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CoolSnap HQ2 CCD Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.photometrics.com/products/ccdcams/coolsnap_hq2.php">http://www.photometrics.com/products/ccdcams/coolsnap_hq2.php</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Open Microscopy Environment for Remote Objects (OMERO) [refered to in text as microscope image visualisation and analysis software]</td>
			<td>OME</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://openmicroscopy.org/">http://openmicroscopy.org/</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SigmaPlot v12.0 [Refered to in text as data graphing software]</td>
			<td>Systat Software Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaplot.co.uk/products/sigmaplot/sigmaplot-details.php">http://www.sigmaplot.co.uk/products/sigmaplot/sigmaplot-details.php</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of global rna synthesis at the single cell level following hypoxia

Hypoxie oder Absenken der Sauerstoffverfügbarkeit in vielen physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt. Auf der molekularen Ebene, Zellen initiieren einen bestimmten Transkriptionsprogramm, um eine angemessene und koordinierte zelluläre Antwort zu montieren. Die Zelle besitzt mehrere Sauerstoffsensor Enzyme, die molekularen Sauerstoff als Co-Faktor für ihre Tätigkeit benötigen. Diese reichen von Prolyl-Hydroxylasen zu Histondemethylasen. Die meisten Studien analysiert zellulären Reaktionen auf Hypoxie auf Zellpopulationen und durchschnittlich Studien, und als solche Einzelzellanalyse von hypoxischen Zellen nur selten durchgeführt. Hier beschreiben wir eine Methode zur Analyse des globalen RNA-Synthese an Einzelzellebene in Hypoxie durch Verwendung Click-iT RNA Imaging-Kits in einer Sauerstoff gesteuert Arbeitsplatz, gefolgt von mikroskopische Analyse und Quantifizierung. Verwendung von Krebszellen gegen Hypoxie für unterschiedlich lange ausgesetzt wird RNA in jeder Zelle markiert und gemessen. Diese Analyse ermöglichtDie Visualisierung der zeitlichen und Zelle-zu-Zelle Veränderungen der globalen RNA-Synthese nach hypoxischen Stress.

Ein Schema des RNA Belichtungskit Reaktion wird in 1B gezeigt. Wir haben diese Reaktion zur quantitativen Bestimmung der Gesamt-RNA-Synthese in U2OS-Zellen nach der Behandlung mit Hypoxie sowohl auf individueller (Einzelzelle) und globaler Ebene (Population von Zellen). Die Zellen wurden mit Hypoxie und in Gegenwart von EU kultiviert behandelt. Sie wurden dann fixiert und permeabilisiert und EU-Einbau wurde von chemoselektiven Ligation der EU mit einem Azid enthaltenden Farbstoff nachgewiesen. Dieser &quot;Klick&quot;-Reaktion führt zu einer Fluoreszenzemission, die detektiert und quantifiziert unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie ist. Fig. 2A zeigt ein typisches Ergebnis dieses Experiments. Fluoreszenzmarkierten Zellen werden rot pseudocolored und das Bild in der offenen Mikroskopie-Umgebung für Remote-Objekte (OMERO) eröffnet worden. Dieses Mikroskop Bild Visualisierung und Analyse-Software verfügt über einen eingebauten ROI-Tool, das verwendet werden kann, um einzelne subzellulärer Strukturen auszuwählenturen und quantitativ zu analysieren Bildintensität innerhalb der gewählten Region. Ein typisches Beispiel für die Datenausgabe nach der Anwendung dieses Werkzeugs in dem Client-Programm kann in Fig. 2B gesehen werden kann; Einzelzelle Intensitäten werden neben einem repräsentativen Bild aus dem Experiment, die als Sichtprüfung, um die Gültigkeit der Daten sicherzustellen, dient gezeigt. Die einzelnen Zellfluoreszenzintensitäten können als Streudiagramm, um die Verteilung der einzelnen Zellintensitäten innerhalb des behandelten Zellpopulation zeigen aufgetragen werden. Ein Beispiel dieser Art von Diagramm ist in Fig. 2C zu sehen. Plotten Intensitätsdaten auf diese Weise ist nützlich, da es einen schnellen Vergleich der Behandlungsergebnisse und zeigt deutlich die signifikante Heterogenität innerhalb einer Behandlungszellpopulation, die sonst mit Standard-Datendarstellung verdeckt wird. Die Antwort Heterogenität ist interessant, in diesem Experiment, denn obwohl eine einheitliche hypoxischen Stimulus war einzu den Zellen ngewandte, ist es offensichtlich, dass jede Zelle von der gleichen Monoschicht Population unterschiedlich auf diese Anregung reagiert. 2D zeigt das Gesamtergebnis aus unserem Experiment. Fluoreszenzintensitäten von allen Zellen innerhalb einer Population Behandlung wurden gemittelt und dann in diesem Balkendiagramm dargestellt. Ein Student-t-Test wurde verwendet, um die statistische Wahrscheinlichkeit von jeder Behandlungsgruppe wesentlich von der Steuerung zu berechnen. Interessanterweise zeigen diese Daten, dass es einen statistisch signifikanten Anstieg der globalen RNA-Synthese über die Zeit, wenn U2OS-Zellen mit Hypoxie behandelt (manchmal mehr als 1 h 30 min * p &lt;0,01;. ** P &lt;0,05 und *** p &lt;0,001 und n&gt; 30). Diese Daten zeigen, dass nach längerer Hypoxie-Behandlung, die Zelle selbst in dieser feindlichen hypoxischen Umgebung konzentriert seine Anstrengungen auf die Produktion von RNA. Actinomycin D-Behandlung komplett abträgt die Fluoreszenzintensität wie erwartet.<img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51420/51420fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51420/51420fig1.jpg" /> 1. A. Die HIF-System reagiert auf Veränderungen der zellulären Sauerstoff. In diesem vereinfachten schematische Hypoxie stabilisiert sich die HIF-Heterodimer durch die Verhinderung HIF-α-Hydroxylierung (-OH) durch die Prolylhydroxylase Enzyme (PHDs) und ihrer späteren polyubquitination von von-Hippel-Lindau-Protein (VHL). HIF Stabilisierung Ergebnisse bei der Aktivierung von Genen, die die unzähligen Zelle reagieren auf zellulärer Hypoxie B. RNA-Synthese kann mit dem Click-IT-Test nachgewiesen werden helfen. Zellen werden mit EU nach der Behandlung das Click-Reaktion erkennt die RNA-Synthese, die durch Fluoreszenzintensität und Lichtmikroskopie quantifiziert werden können, gekennzeichnet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51420/51420fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere vers ansehen</a>Ionen dieser Figur. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51420/51420fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51420/51420fig2.jpg" /> Abbildung 2. A. Screenshot aus OMERO typische mikroskopische Ausgangs folgenden RNA-Markierung zeigen. Dieses Mikroskop Bildvisualisierung und Analyse-Software können schnell extrahieren Intensitätsdaten auf Einzelzellebene mit seiner eingebauten ROI Makro. Ein Screenshot der Ausgabe dieses Befehls wird in B. Globale RNA-Synthese gezeigt, kann von einzelnen Zell Intensität zu entnehmen ist, kann der Bereich der in dem Streudiagramm zu sehen ist C. Eine formale Darstellung dieser aggregierten Daten ist zu erkennen, D. * p &lt;0,01; ** P &lt;0,05 und *** p &lt;0,001 und n&gt; 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51420/51420fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <tablE border = &quot;0&quot; cellpadding = &quot;0&quot; cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> Zellkultur-Reagenzien </td></tr><tr><td> Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS), pH 7,2 bis 7,6 </td></tr><tr><td> Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) </td></tr><tr><td> Fötalem Kälberserum (FCS)-Filter sterilisiert </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td></tr><tr><td> 0,05% Trypsin-EDTA (1%) </td></tr><tr><td> 70% Ethanol </td></tr><tr><td> Actinomycin D (1 ug / ul Lager) </td></tr><tr><td> Zellkultur-Ausrüstung </td></tr><tr><td> Sterile Pasteurpipetten </td></tr><tr><td> Eine Reihe von Zellkultur-behandelten Plast zur Pflege und Behandlung von Zellen in Kultur </td></tr><tr><td> Wasserbad bei 37 ° C eingestellt </td></tr><tr><td> Laminar-Flow-Haube </td></tr><tr><td> Brutschrank bei 37 ° C, 5% CO 2 </td></tr><tr><td> Hypoxie Workstation bei 37 ° C, 5% CO 2, 1% O 2 </td></tr><tr><td> Deckgläschen </td></tr><tr><td> Präzisions-Pinzette </td></tr><tr><td> Hämozytometers </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Chemikalien und Geräte für die Kultivierung von Zellen U2OS erforderlich. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="514"><tbody><tr><td rowspan="2"> Reaktionskomponenten </td><td colspan="6"> Anzahl der Deckgläser </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Click-iT RNA-Reaktionspuffer (Komponente C) </td><td> 428 ul </td><td> 856 ul </td><td> 1,7 ml </td><td> 2,1 ml </td><td> 2,58 ml </td><td> 4,3 ml </td></tr><tr><td> CuSO 4 (Komponente D) </td><td> 20 ul </td><td> 40 ul </td><td> 80 ul </td><td> 100 ul </td><td> 120 ul </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> Alexa Fluor Azid (in Schritt 2.3 vorbereitet) </td><td> 1,8 ul </td><td> 3,7 ul </td><td> 7,4 ul </td><td> 9.3 ul </td><td> 11.28 ul </td><td> 18,8 ul </td></tr><tr><td> Click-iT Reaktionspuffer Additiv (in Schritt 2.3 vorbereitet) </td><td> 50 ul </td><td> 100 ul </td><td> 200 ul </td><td> 250 ul </td><td> 300 ul </td><td> 500 ul </td></tr><tr><td> Ungefähre Gesamt Volume </td><td> 500 ul </td><td> 1 ml </td><td> 2 ml </td><td> 2,5 ml </td><td> 1,5 ml </td><td> 5 ml </td></tr></tbody></table> . Tabelle 2 RNA Imaging Kit Reaktion Cocktails: Referenz-Tabelle mit Verhältnis von Master-Mix-Komponenten für die RNA-Imaging-Kit-Reaktion nach der Anzahl der Deckgläser zu gefärbt werden. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Fluorophor </td><td> Anregung (nm) </td><td> Emission (nm) </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> 495 </td><td> 519 </td></tr><tr><td> Hoechst 33342, an DNA gebunden </td><td> 350 </td><td> 461 </td></tr></tbody></table> . Tabelle 3 Fluoreszenz / Anregung Emissionsmaxima: Etwa Fluoreszenz / Anregung Emission maximal für Alexa Fluor Farbstoff und Hoechst 33342 an DNA gebunden.

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Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Wir beschreiben eine Technik zur Analyse der globalen RNA-Synthese in Hypoxie mit bildgebenden. Click-Chemie Markierung von RNA wurde bisher nicht unter Hypoxie durchgeführt und ermöglicht die Visualisierung der globalen RNA Veränderungen auf Einzelzellebene. Dieser Ansatz ergänzt die bestehenden gemittelt RNA-Techniken, die eine direkte Visualisierung von Zell-zu-Zell-Veränderungen in der globalen RNA-Synthese.

Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.2K Aufrufe.  University of Dundee, UK.  Wir beschreiben eine Technik zur Analyse der globalen RNA-Synthese in Hypoxie mit bildgebenden. Click-Chemie Markierung von RNA wurde bisher nicht unter Hypoxie durchgeführt und ermöglicht die Visualisierung der globalen RNA Veränderungen auf Einzelzellebene. Dieser Ansatz ergänzt die bestehenden gemittelt RNA-Techniken, die eine direkte Visualisierung von Zell-zu-Zell-Veränderungen in der globalen RNA-Synthese. 

Serie: Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

Methode zur Messung des Viral Fusion Kinetics auf der Single Particle Stufe

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Forschung

Biologie

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

Direkte Analyse von Einzelzellen durch Massenspektrometrie bei Atmosphärendruck

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

Analyse von Einzel-Zell-Gene Transkription durch RNA-Fluorescent<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

Studieren Proteolyse von Cyclin B an der Single Cell Level in Whole Cell Populationen

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Die Messung der Hämsynthese Levels in Säugerzellen

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as leukemia and lymphoma. Elucidating the mechanisms controlling HSCs self-renewal and differentiation is important for application of HSCs for research and clinical uses. However, it is not possible to obtain large quantity of HSCs due to their inability to proliferate in vitro. To overcome this hurdle, we used a mouse bone marrow derived cell line, the EML (Erythroid, Myeloid, and Lymphocytic) cell line, as a model system for this study.
RNA-sequencing (RNA-Seq) has been increasingly used to replace microarray for gene expression studies. We report here a detailed method of using RNA-Seq technology to investigate the potential key factors in regulation of EML cell self-renewal and differentiation. The protocol provided in this paper is divided into three parts. The first part explains how to culture EML cells and separate Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The second part of the protocol offers detailed procedures for total RNA preparation and the subsequent library construction for high-throughput sequencing. The last part describes the method for RNA-Seq data analysis and explains how to use the data to identify differentially expressed transcription factors between Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The most significantly differentially expressed transcription factors were identified to be the potential key regulators controlling EML cell self-renewal and differentiation. In the discussion section of this paper, we highlight the key steps for successful performance of this experiment.
In summary, this paper offers a method of using RNA-Seq technology to identify potential regulators of self-renewal and differentiation in EML cells. The key factors identified are subjected to downstream functional analysis in vitro and in vivo.

RNA-sequencing and bioinformatics analyses were used to identify significantly and differentially expressed transcription factors in Lin-CD34+ and Lin-CD34- subpopulations of mouse EMLcells. These transcription factors might play important roles in determining the switch between self-renewing Lin-CD34+ and partially differentiated Lin-CD34- cells.

Identifizierung von Schlüsselfaktoren Regelselbsterneuerung und Differenzierung in EML hämatopoetischen Vorläuferzellen durch RNA-Sequenzierungsanalyse

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Here we employ FISH methodology to track LINE-1 retrotransposition at the single nuclei level in chromosome spreads of HepG2 cell lines stably expressing synthetic LINE-1.

Analyse von LINE-1-Retrotransposition im Einzel Nucleus Ebene

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium covering most of our body, and epidermal appendages such as the hair follicles and sweat glands. The epidermis undergoes regeneration throughout life and in response to injury. This is enabled by K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell populations that are tightly regulated by multiple regulatory mechanisms active within the epidermis and between epidermis and dermis. This article describes a simple method to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize K14 protein expression patterns, Ki67 labeled proliferating cells, Nile Red labeled sebocytes, and DAPI nuclear labeling at single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment and quantification of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines. The CUBIC protocol is the best method available to date to investigate molecular and cellular interactions in full thickness skin biopsies at single cell resolution.

This report describes a CUBIC protocol to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize protein expression patterns, proliferating cells, and sebocytes at the single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines.

CUBIC Protokoll Visualisiert Expression Protein bei Single Cell Resolution in Ganze Berge Vorbereitung der Haut

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

Analyse der Beta-Zellfunktion mit einzelligen Auflösung Kalzium Imaging im Zebrafisch Inselchen

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &#955; DNA at the Single Molecule Level

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. In single molecule assays for studying DNA-protein interactions, there are two important factors for consideration: the DNA substrate with enough length for easy observation and labeling a protein with a suitable fluorescent probe. 48.5 kb &#955; DNA is a good candidate for the DNA substrate. Quantum dots (Qdots), as a class of fluorescent probes, allow long-time observation (minutes to hours) and high-quality image acquisition. In this paper, we present a protocol to study DNA-protein interactions at the single-molecule level, which includes preparing a site-specifically modified &#955; DNA and labeling a target protein with streptavidin-coated Qdots. For a proof of concept, we choose ORC (origin recognition complex) in budding yeast as a protein of interest and visualize its interaction with an ARS (autonomously replicating sequence) using TIRFM. Compared with other fluorescent probes, Qdots have obvious advantages in single molecule studies due to its high stability against photobleaching, but it should be noted that this property limits its application in quantitative assays.

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &amp;#955; DNA at the Single Molecule Level

Here, we present a protocol to study DNA-protein interactions by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) using a site-specifically modified &#955; DNA substrate and a Quantum-dot labeled protein.

Visualisierung der Interaktion zwischen dem Qdot-markierten Protein und ortspezifisch modifizierte λ-DNA auf der Einzelmolekül-Ebene

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. ...